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CRISPR/Cas9介导的Suds3敲除抑制小鼠胚胎干细胞增殖和中内胚层分化

中国生物化学与分子生物学报 2021年第8期37卷 1050-1061页

作者：董春阳王波明金李陈方仕才黄依刘晶中国科学技术大学生命科学与医学部医药生物技术系合肥230026 中国科学院广州生物医药与健康研究院细胞生物学系广州510530 广州再生医学与健康生物岛实验室广州510530 广州医科大学-中国科学院广州生物医药与健康研究院联合生命科学学院生物化学与分子生物学系广州510530

胚胎干细胞(ESCs)具有分化为成体各种细胞的能力,其在发育和分化过程中的命运决定受基因表达、表观遗传和胞外信号等多种因素的综合调控。表观遗传调控例如DNA甲基化、组蛋白乙酰化和甲基化,在ESCs的多能性维持以及分化过程中发挥重要... 详细信息

胚胎干细胞(ESCs)具有分化为成体各种细胞的能力,其在发育和分化过程中的命运决定受基因表达、表观遗传和胞外信号等多种因素的综合调控。表观遗传调控例如DNA甲基化、组蛋白乙酰化和甲基化,在ESCs的多能性维持以及分化过程中发挥重要作用。Suds3(Sin3 histone deacetylase corepressor complex component SDS3)是Sin3组蛋白去乙酰化酶复合物的重要组分之一,在胚胎发育、细胞增殖、染色体分离等生物过程中发挥重要作用,但Suds3在ESCs中的功能例如对ESCs增殖、多能性维持及分化过程中的影响却少有报道。本研究利用CRISPR/Cas9基因编辑技术,构建了Suds3基因敲除的小鼠胚胎干细胞系,并结合细胞培养、体外拟胚体(embryoid body,EB)形成和体内畸胎瘤形成,CCK-8细胞增殖检测和细胞计数实验对Suds3在ESCs中的功能展开研究。Western印迹结果显示,SUDS3蛋白未表达,成功实现了对Suds3基因的敲除。通过对细胞形态的观察以及实时荧光定量PCR(QRT-PCR)检测多能性基因的表达,发现Suds3的敲除对ESCs多能性的维持无显著影响。拟胚体形成实验发现,拟胚体形成的第4 d和第6 d,Suds3^(-/-)细胞多能性基因表达并未像野生型细胞一样迅速下调反而提高(^(***)P<0.001),中胚层和内胚层基因表达量相比野生型显著降低(^(***)P<0.001),而外胚层基因表达量相比野生型提高(^(***)P<0.001)。CCK-8增殖检测和细胞计数的结果发现,Suds3的敲除使ESCs的增殖能力受到抑制(^(*)P<0.05,^(***)P<0.001)。体内畸胎瘤形成实验和HE染色表明,Suds3敲除抑制了增殖,同时促进外胚层分化,减少了中胚层和内胚层的分化。并且在Suds3^(-/-)细胞中过表达Suds3可以挽救敲除Suds3引起的ESCs表型变化。本研究成功构建了Suds3敲除的胚胎干细胞系,并表明Suds3的敲除对ESCs多能性的维持无显著影响,抑制ESCs的增殖及促进外胚层分化,限制中胚层和内胚层的分化。上述结果为研究组蛋白乙酰化对ESCs分化及早期胚胎发育的影响提供了新的见解和研究模型,为体外定向分化获取功能性细胞及未来的细胞治疗策略提供了技术参考。

关键词： CRISPR/Cas9 Sin3组蛋白去乙酰化酶阻遏复合物组分SDS3 胚胎干细胞拟胚体形成细胞增殖

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敲降同源异形框D12抑制7因子介导的体细胞重编程

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中国生物化学与分子生物学报 2021年第9期37卷 1188-1196页

作者：方仕才黄依王波赵国庆李陈明金董春阳李闯裴端卿广州医科大学生命科学学院生物系广州510530 中国科学院广州生物医药与健康研究院细胞生物学系广州510530 广州再生医学与健康生物岛实验室细胞命运谱系中心广州510530 中国科学技术大学生命科学与医学部医药生物技术系合肥230026

分化的体细胞可通过体外过表达多能性相关的转录因子重编程为诱导多能干细胞(induced pluripotent stem cells,iPSCs)。体细胞重编程的过程需要细胞内各个转录因子相互作用,协同调控细胞命运的转变。同源异形框D12(homeobox D12,Hoxd12... 详细信息

分化的体细胞可通过体外过表达多能性相关的转录因子重编程为诱导多能干细胞(induced pluripotent stem cells,iPSCs)。体细胞重编程的过程需要细胞内各个转录因子相互作用,协同调控细胞命运的转变。同源异形框D12(homeobox D12,Hoxd12)是调控脊椎动物胚胎发育的关键转录因子之一,对足趾发育、体轴形成和细胞内信号转导具有重要作用。但Hoxd12关于体细胞重编程和胚胎干细胞(embryonic stem cells,ESCs)方面的研究未见报道。本研究首先以7因子(Sall4-Esrrb-Jdp2-Glis1-Mkk6-Nanog-Kdm2b,7 factors)和Yamanka因子(Oct4-Klf4-Sox2,Yamanaka factors)诱导的重编程体系为模型,并结合RNA敲降(shRNA)和基因过表达技术,研究Hoxd12在体细胞重编程中的功能;其次利用CRISPR/Cas9基因编辑技术构建Hoxd12基因敲除的胚胎干细胞系,同时结合体外拟胚体形成(EB)和转录物组测序技术(RNA-seq),探索Hoxd12在ESCs多能性维持和退出中的功能。本研究得出以下结论:(1)敲降Hoxd12的表达抑制7因子诱导的重编程(**P<0.01),但对Yamanaka因子诱导的重编程无显著作用。(2)在7因子和Yamanaka因子诱导多能性的不同时期过表达Hoxd12对重编程无显著作用,且Hoxd12无法替代7因子当中的任何1个因子。(3)Hoxd12基因的敲除对ESCs多能性的维持无显著影响。(4)Hoxd12基因的敲除对ESCs在EB球形成中的谱系决定无显著影响。(5)Hoxd12基因的敲除抑制ESCs的增殖(Day3*t=12.91,Day4*t=4.87,Day5*t=5.98)。本研究初步揭示了Hoxd12在体细胞重编程和ESCs增殖中具有重要作用,为进一步深入理解Hoxd12调控细胞命运转变提供新的参考。

关键词：同源异形框D12 诱导多能干细胞体细胞重编程胚胎干细胞细胞增殖

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学生主导式的生物化学与分子生物学实验教学研究探讨——以PCR技术实验为例

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工业微生物 2024年第6期54卷 118-120页

作者：冉欣如周于婷虞红娇张铁军陈新美广州医科大学-中国科学院广州生物医药与健康研究院联合生命科学学院生物化学与分子生物学教研室广东广州511436 广州医科大学-中国科学院广州生物医药与健康研究院联合生命科学学院生物技术系广东广州511436 广州医科大学-中国科学院广州生物医药与健康研究院联合生命科学学院医学遗传学与细胞生物学教研室广东广州511436

生物化学与分子生物学是研究生命控制过程主要分子机制的重要领域。在建设国家一流本科专业的背景下,生物化学和分子生物学实验教学改革,对于提升生命科学相关专业本科学生的科研创新能力和科研素质至关重要。根据国家一流本科专业建设... 详细信息

生物化学与分子生物学是研究生命控制过程主要分子机制的重要领域。在建设国家一流本科专业的背景下,生物化学和分子生物学实验教学改革,对于提升生命科学相关专业本科学生的科研创新能力和科研素质至关重要。根据国家一流本科专业建设的人才培养要求,针对实验教学现状及问题,文章提出了学生主导式实验教学模式,并以PCR实验为例阐述了具体的实验教学改革方案,以期逐步推动生物化学与分子生物学实验教学改革,提高学生的科学思维能力和动手能力,为国家一流本科专业建设培养更多优秀的生命科学专业人才。

关键词：生物化学与分子生物学国家一流本科专业建设教学改革学生主导式实验教学

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瞬时受体电位通道在细胞自噬中的调控作用

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医学综述 2018年第14期24卷 2739-2743页

作者：李业盛伍慧晴凌振威张琪陈庆梓陈燕李淑妮周丽芬李建华广州医科大学中国科学院广州生物医药与健康研究院联合生命科学学院生物技术系广州511436 广州医科大学基础学院基础医学研究中心广州511436

自噬是机体在应对外界低氧、营养缺乏、炎症、癌症发生等胁迫条件下,将目标物质运送到溶酶体进行降解,并将转化的物质重新利用,以维持细胞生存的细胞过程。瞬时受体电位(TRP)通道超家族是目前最大的阳离子通道家族之一,多具Ca^(2+)通透... 详细信息

自噬是机体在应对外界低氧、营养缺乏、炎症、癌症发生等胁迫条件下,将目标物质运送到溶酶体进行降解,并将转化的物质重新利用,以维持细胞生存的细胞过程。瞬时受体电位(TRP)通道超家族是目前最大的阳离子通道家族之一,多具Ca^(2+)通透性,发挥着疼痛、味觉等感觉信号传递及调节细胞钙平衡和影响发育等功能。在受到不利于生存的刺激时,机体会通过调节TRP通道来调节自噬。因此,未来需进一步研究TRP通道调控细胞自噬的信号通路,以为寻找治疗人类疾病的治疗靶点提供理论依据。

关键词：自噬瞬时受体电位钙离子

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