检索结果-内蒙古大学图书馆

解放军医学杂志 2007年第3期32卷 205-207页

作者：龚小卫魏洁李煜生程蔚蔚邓鹏姜勇南方医科大学病理生理学教研室和广东省蛋白质组学重点实验室广州510515

目的研究p38丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)在血小板源性生长因子(PDGF)诱导的细胞迁移中的作用。方法PDGF刺激小鼠NI H3T3细胞后,利用免疫印迹法检测p38磷酸化程度的改变情况。利用Transwell细胞迁移系统来观察PDGF对NI H3T3细胞迁移的诱导... 详细信息

目的研究p38丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)在血小板源性生长因子(PDGF)诱导的细胞迁移中的作用。方法PDGF刺激小鼠NI H3T3细胞后,利用免疫印迹法检测p38磷酸化程度的改变情况。利用Transwell细胞迁移系统来观察PDGF对NI H3T3细胞迁移的诱导作用,以及p38基因敲除对PDGF诱导的细胞迁移的影响。结果PDGF能显著诱导NI H3T3细胞迁移(P<0.001),且在此过程中p38能被磷酸化激活,p38基因敲除能阻断PDGF诱导的细胞迁移(P<0.001)。结论p38MAPK参与了PDGF诱导的细胞迁移的调控。

关键词： p38 MAP激酶血小板源生长因子细胞运动

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人FAT10蛋白过表达诱导饥饿状态下HEK 293细胞发生凋亡

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中国病理生理杂志 2007年第10期23卷 1937-1941页

作者：刘亚伟刘靖华谢汝佳李志杰王国军黄劭唐靖赵明哲孙学刚邓鹏姜勇南方医科大学广东省蛋白质组学重点实验室和病理生理学教研室广东广州510515

目的:采用flag标记的人FAT10蛋白研究人FAT10蛋白对HEK293细胞的影响。方法:将FAT10基因片段克隆到载体pcDNA3-flag上,对阳性克隆进行PCR、酶切和测序鉴定,用脂质体转染HEK293细胞,用Western blotting方法检测外源性FAT10正常培养状态... 详细信息

目的:采用flag标记的人FAT10蛋白研究人FAT10蛋白对HEK293细胞的影响。方法:将FAT10基因片段克隆到载体pcDNA3-flag上,对阳性克隆进行PCR、酶切和测序鉴定,用脂质体转染HEK293细胞,用Western blotting方法检测外源性FAT10正常培养状态和饥饿状态下的HEK293细胞中的表达情况;并用XTT法和DNA ladder法观察正常培养和饥饿状态下HEK293细胞的凋亡情况。结果:重组质粒在HEK293细胞中高效表达,但在正常培养状态下和饥饿状态下表达情况不同。饥饿状态下,过表达FAT10的HEK293细胞存活率显著低于对照细胞,并且出现DNA ladder现象。结论:成功构建了带Flag标签的FAT10真核表达质粒,可在HEK293细胞中高效表达;FAT10过表达促进饥饿状态的HEK293细胞发生凋亡。

关键词：泛素样修饰因子 HEK293细胞细胞凋亡

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人高迁移率族蛋白B1细胞内定位及移位研究

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中国危重病急救医学 2006年第6期18卷 338-341页

作者：徐佳刘志锋王娟邓鹏姜勇南方医科大学病理生理学教研室和广东省功能蛋白质组学重点实验室广州510515

目的观察人高迁移率族蛋白B1(HMGB1)在真核细胞内的定位和移位情况。方法构建人HMGB1及增强型绿色荧光蛋白(EGFP)融合蛋白的哺乳动物细胞表达载体。通过两步亚克隆的方法,将HMGB1和EGFP的编码序列以融合表达形式克隆到带有血凝素(hytohe... 详细信息

目的观察人高迁移率族蛋白B1(HMGB1)在真核细胞内的定位和移位情况。方法构建人HMGB1及增强型绿色荧光蛋白(EGFP)融合蛋白的哺乳动物细胞表达载体。通过两步亚克隆的方法,将HMGB1和EGFP的编码序列以融合表达形式克隆到带有血凝素(hytohemagglutinin,HA)标记的载体pcDNA3HA上,随后转染293A细胞,在荧光显微镜下观察结果。结果重组质粒经酶切、聚合酶链反应(PCR)和测序鉴定证明构建正确,并在293A细胞中得到大量表达。荧光显微镜观察发现,融合蛋白主要分布于细胞核中,经肿瘤坏死因子α(TNFα)刺激后18h,部分细胞中融合蛋白从胞核移位到胞质,与预期结果一致。结论HMGB1的绿色荧光蛋白融合表达载体构建成功。该载体能在哺乳动物细胞中有效表达并正确定位、移位,为下一步深入研究HMGB1作用细胞的信号通路提供了一个重要的工具。

关键词：高迁移率族蛋白B1 增强型绿色荧光蛋白细胞内定位载体构建

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一种用于穿透多肽筛选的随机文库的构建及筛选

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中国生物化学与分子生物学报 2006年第6期22卷 491-497页

作者：刘瑜刘亚伟李海玉刘靖华邓鹏姜勇南方医科大学广东省功能蛋白质组学重点实验室和病理生理学教研室广州510515

以增强型绿色荧光蛋白(enhancedgreenfluorescenceprotein,EGFP)为示踪物,在pET-14b载体上构建编码12个氨基酸的随机多肽表达文库.建立一种简便、经济、有效的文库筛选方法,从所构建的文库中筛选出细胞穿透多肽(cell-penetratingpeptide... 详细信息

以增强型绿色荧光蛋白(enhancedgreenfluorescenceprotein,EGFP)为示踪物,在pET-14b载体上构建编码12个氨基酸的随机多肽表达文库.建立一种简便、经济、有效的文库筛选方法,从所构建的文库中筛选出细胞穿透多肽(cell-penetratingpeptide,CPP).采用点突变技术,首先在pET-14b载体多克隆位点NdeⅠ和XhoⅠ之间加入4个限制性内切酶位点,随后在BamHⅠ位点后加入三联终止密码子,接着再利用亚克隆的方法在KpnⅠ和XhoⅠ之间插入EGFP,形成一个新的用于原核表达示踪蛋白的载体pET-14bMCStop/EGFP.最后再利用点突变技术在上述构建的示踪载体的多克隆位点XhoⅠ和BamHⅠ之间插入36个随机碱基序列.以His-Tat-EGFP作为工具建立有效的筛选方法,利用这种方法对文库进行筛选.酶切和测序表明,示踪载体的构建是正确的,且在大肠杆菌中可有效地表达出His标记的EGFP.在示踪载体的基础上构建的随机多肽文库至少包含了105个独立克隆,其中90%以上的克隆插入的随机片段都是36个碱基.建立的筛选方法是可行的,并用此方法进行了初步的筛选.

关键词：细胞穿透多肽随机多肽文库跨膜转运内化

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p38L12-TAT融合肽对山梨糖醇引起的ECV304细胞ATF2磷酸化的抑制作用

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中国生物化学与分子生物学报 2006年第5期22卷 402-408页

作者：郭爱华刘志锋李海玉唐靖李志杰刘亚伟龚小卫刘靖华邓鹏姜勇南方医科大学病理生理学教研室和广东省功能蛋白质组学重点实验室广州510515

构建p38Loop12(L12)的TAT融合表达载体,纯化原核表达的p38L12融合蛋白并鉴定其在真核细胞内的功能.利用PCR方法分别扩增出p38L12及其“TXY”双磷酸化位点的AF突变体p38L12(AF)片段,克隆入His标记的TATEGFP融合蛋白原核表达载体pHTE(pET1... 详细信息

构建p38Loop12(L12)的TAT融合表达载体,纯化原核表达的p38L12融合蛋白并鉴定其在真核细胞内的功能.利用PCR方法分别扩增出p38L12及其“TXY”双磷酸化位点的AF突变体p38L12(AF)片段,克隆入His标记的TATEGFP融合蛋白原核表达载体pHTE(pET14bHisTATEGFP),经酶切、测序鉴定正确后,将重组质粒转化原核表达菌,诱导表达纯化融合蛋白;将融合蛋白加入ECV304细胞后于荧光显微镜下观察并行Western印迹分析,检测融合蛋白的细胞内转导活性;通过检测内源性ATF2磷酸化水平,鉴定高渗刺激下p38L12对内源性p38活性的影响.成功构建了p38L12和p38L12(AF)片段与TAT的融合表达载体,并获得相应的融合蛋白.在ECV304细胞中可见导入的HTEp38L12和HTEp38L12(AF)融合蛋白具有较高的细胞内转导活性和转导效率,并可竞争性抑制高渗刺激对内源性p38的活化.基于HIV1TAT细胞转导系统证实p38L12可竞争性抑制高渗刺激诱导的内源性p38对ATF2的活化,从而发挥对p38激活特异性抑制的功能.

关键词： Ⅰ型人免疫缺陷病毒转录激活蛋白丝裂原活化蛋白 Loop 12 细胞转导系统

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双色红外荧光技术在蛋白磷酸化检测中的应用

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南方医科大学学报 2006年第2期26卷 150-153页

作者：刘靖华唐靖蓝兴国刘亚伟李志杰陈芳邓鹏姜勇南方医科大学病理生理学教研室和广东省功能蛋白质组重点实验室广东广州510515 基因有限公司上海200233

目的通过与化学发光法比较,了解双色红外荧光技术在目标蛋白磷酸化检测中的优势。方法分别取内毒素休克小鼠不同时间肺组织,制备组织匀浆蛋白样品。用SDS-PAGE电泳分离后转膜,将膜分别与磷酸化的或／和总的 p42／44 MAPK抗体孵育,二抗... 详细信息

目的通过与化学发光法比较,了解双色红外荧光技术在目标蛋白磷酸化检测中的优势。方法分别取内毒素休克小鼠不同时间肺组织,制备组织匀浆蛋白样品。用SDS-PAGE电泳分离后转膜,将膜分别与磷酸化的或／和总的 p42／44 MAPK抗体孵育,二抗用耦联有Alexa Fluor 680和IRDye 800的荧光抗体或辣根过氧化物酶抗体,通过双色红外荧光系统和化学发光法进行蛋白质磷酸化检测。结果红外荧光检测技术和化学发光检测结果均显示内毒素处理后小鼠肺组织p42／44 MAPK磷酸化水平发生了改变,1 h最高,12 h以后逐渐恢复到接近正常水平。两种方法检测结果显示了较好的一致性,相比之下双色红外荧光技术具有更高的灵敏度、操作方便、节省时间及可以同时检测两种蛋白等优点。结论双色红外荧光技术在蛋白磷酸化的检测方面具有较好的应用前景。

关键词：蛋白质磷酸化双色红外荧光化学发光检测

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人DJ-1蛋白在NIH3T3细胞中的表达与定位

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中国生物化学与分子生物学报 2006年第7期22卷 530-534页

作者：唐靖刘靖华蓝兴国李志杰刘亚伟赵明哲邓鹏姜勇南方医科大学广东省功能蛋白质组学重点实验室和病理生理学教研室广州510515

采用增强型绿色荧光蛋白（EGFP）示踪的方法,研究人DJ-1蛋白在真核细胞中的定位及其对刺激的反应.将克隆在pGEX-KG上的DJ-1亚克隆到载体pEGFP-C2上,对阳性克隆进行PCR、酶切和测序鉴定,用脂质体转染NIH3T3细胞;并用荧光显微镜观察pEGFP-... 详细信息

采用增强型绿色荧光蛋白（EGFP）示踪的方法,研究人DJ-1蛋白在真核细胞中的定位及其对刺激的反应.将克隆在pGEX-KG上的DJ-1亚克隆到载体pEGFP-C2上,对阳性克隆进行PCR、酶切和测序鉴定,用脂质体转染NIH3T3细胞;并用荧光显微镜观察pEGFP-DJ-1在细胞内的定位以及在血清刺激时的移位;探讨在氧化应激时DJ-1对细胞的保护作用,以及其在细胞内定位的变化.重组质粒在NIH3T3细胞中得到高效表达,绿色荧光弥散分布于胞质、胞核中,但以胞质居多;血清刺激后,细胞中的绿色荧光从胞质移位到胞核;在200～600 μmol/L H2O2刺激下,DJ-1能有效保护细胞抵抗氧化应激,并且也能从胞质移位到胞核.上述研究结果为进一步研究DJ-1蛋白的功能提供了一个重要依据.

关键词： DJ-1蛋白增强型绿色荧光蛋白双氧水血清转染

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人高迁移率族蛋白1的原核细胞表达及其功能研究

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中国病理生理杂志 2006年第6期22卷 1119-1123页

作者：赵雷刘靖华唐靖李志杰刘亚伟邓鹏姜勇南方医科大学病理生理学教研室和广东省功能蛋白质组学重点实验室广东广州510515

目的:构建带His标记的人高迁移率族蛋白1(HMGB1)融合蛋白原核细胞表达质粒,表达并纯化人HMGB1重组蛋白,观察其对人脐静脉内皮细胞(HUVEC)释放细胞因子的影响。方法:首先将目的片段HMGB1亚克隆到改造的载体pET14b上,经鉴定、测序证实序... 详细信息

目的:构建带His标记的人高迁移率族蛋白1(HMGB1)融合蛋白原核细胞表达质粒,表达并纯化人HMGB1重组蛋白,观察其对人脐静脉内皮细胞(HUVEC)释放细胞因子的影响。方法:首先将目的片段HMGB1亚克隆到改造的载体pET14b上,经鉴定、测序证实序列正确后转化大肠杆菌BL21(DE3),异丙基-β-D硫代半乳糖苷(IPTG)诱导表达His-HMGB1融合蛋白,用Ni-NTA亲和树脂纯化。将纯化得到的HMGB1蛋白经透析和过滤除菌后,刺激人脐静脉内皮细胞,24h后收集培养上清,经LiquiChip液相蛋白芯片系统检测细胞因子。结果:构建的pET14b/HMGB1表达质粒经酶切和测序验证正确;表达的目的蛋白经Western blotting验证能被His抗体识别;检查了纯化的HMGB1蛋白对HUVEC产生细胞因子的影响,发现重组的HMGB1可诱导白细胞介素8(IL-8)上调,并且呈剂量依赖性关系。结论:成功构建了His-HMGB1原核细胞表达质粒并纯化得到重组的HMGB1;在HUVEC模型上证实所得到的HMGB1蛋白具有生物学活性。本实验为进一步研究HMGB1的功能提供了重要的实验材料。

关键词：高迁移率族蛋白质类原核表达细胞因子类脐静脉内皮细胞

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应激相关的热休克信号转导通路的研究进展

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中国病理生理杂志 2005年第5期21卷 1030-1035页

作者：李煜生姜勇南方医科大学病理生理学教研室和广东省功能蛋白质组学重点实验室广东广州510515

随着社会的发展和医疗技术的不断进步与完善,人们的健康水平有了大幅度的提高.但急性梗塞(如脑梗、心梗)、感染性疾病(如败血症)等仍有较高的发病率和死亡率.

关键词：热休克因子热休克元件热休克蛋白质类信号转导

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人GFP-AWP1融合基因载体的构建及其在293细胞中的表达

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第一军医大学学报 2005年第2期25卷 174-176,180页

作者：曹永宽莫永炎田伏洲刘亚伟邓鹏秦清和姜勇南方医科大学病理生理学教研室和全军休克微循环重点实验室广东广州510515 成都军区总医院全军普外中心四川成都610083 南方医科大学病理生理学教研室和全军休克微循环重点实验室广东广州510515 成都军区总医院全军普外中心四川成都610083

目的克隆、构建绿色荧光蛋白(GFP)-AWP1(associated with protein kinase C related kinase 1,AWP1)表达载体,观察AWP1在293细胞中表达和定位.方法采用逆转录PCR(RT-PCR)法从人ECV304内皮细胞中扩增AWP1 cDNA编码区,并将其重组于GFP表达载体pEGFP-C2中.经酶切、序列鉴定分析后,将该重组质粒通过DOTAP脂质体介导,转染293细胞.荧光显微镜观察AWP1在细胞内的表达和分布.结果GFP-AWP1融合基因表达载体经酶切鉴定和测序分析确认构建成功,并在293细胞中获得了高效表达.荧光显微镜下,在不携带外源基因的空载体pEGFP-C2转染的对照组293细胞,绿色荧光均匀分布于整个细胞中;在重组质粒pEGFP-C2/AWP1转染的293细胞,绿色荧光弥散分布于细胞质内.结论成功构建GFP-AWP1融合基因表达载体并表达于293细胞胞质中.

关键词： AWP1 绿色荧光蛋白 293细胞

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