目的:构建wnt3a重组过表达腺病毒pAd-GV314,并感染小鼠骨髓间充质干细胞中建立能够高表达wnt3a的治疗干细胞。方法:利用腺病毒穿梭质粒pAd-GV314构建载有wnt3a基因的穿梭质粒pAd-GV314-wnt3a载体,并通过基因测序鉴定载体序列正确。将载体用PmeⅠ酶切线性化,与Ad Easy-BJ5183感受态细胞进行基因同源重组。将重组后的腺病毒载体经PacⅠ酶切线性化后,转染到HEK293细胞中进行包裹,根据增强绿色荧光蛋白(enhance green fluorescent protein,EGFP)的表达判断重组腺病毒的包装情况。通过反复离心和低温裂解细胞提取wnt3a重组表达腺病毒。
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