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生物工程学报 2005年第4期21卷 597-603页

作者：徐丽慧洪岸何贤辉暨南大学组织移植与免疫教育部重点实验室广州510632 暨南大学生物工程研究所

以PCR方法从克隆的EGFR胞外区cDNA中扩增编码EGFR_L2结构域的DNA片段,在其3′端加入编码His6标签的序列,与pET_3c连接构建EGFR_L2原核表达载体。该蛋白在大肠杆菌BL21(DE3)中获得高效表达,免疫印迹分析表明表达产物全部以包涵体形式存在... 详细信息

以PCR方法从克隆的EGFR胞外区cDNA中扩增编码EGFR_L2结构域的DNA片段,在其3′端加入编码His6标签的序列,与pET_3c连接构建EGFR_L2原核表达载体。该蛋白在大肠杆菌BL21(DE3)中获得高效表达,免疫印迹分析表明表达产物全部以包涵体形式存在,分步透析法和稀释法都不能获得可溶性复性产物,而Ni2+_NTA柱上复性法不仅能够获得可溶性的EGFR_L2蛋白,而且产物同时得到高度纯化,纯度>95%,复性的EGFR_L2与其配基EGF具有特异性的结合活性,但亲和力较低。这表明His6标签不但便于纯化目标蛋白,而且可利用Ni2+_NTA柱进行柱上复性,适用于不易通过常规方法复性的重组蛋白的制备。

关键词：表皮生长因子受体 L2结构域原核表达包涵体重折叠

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佛波醇酯加离子霉素诱导脐血和成人外周血CD4^+CD25^+ T细胞分泌IL-2的相关机制研究

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中国病理生理杂志 2006年第6期22卷 1133-1137页

作者：肇静娴曾耀英李海仙曾祥凤季煜华何贤辉暨南大学组织移植与免疫教育部重点实验室广东广州510630

目的:以佛波醇酯加离子霉素作为刺激剂,验证CD4+CD25+调节性T细胞本身并不存在分泌IL-2障碍;同时通过对脐血和成人外周血的比较性研究,了解脐血CD4+CD25+T细胞的成熟度。方法:以autoMACS从足月婴儿脐血(CB)和成人外周血(PB)分选CD4+CD25... 详细信息

目的:以佛波醇酯加离子霉素作为刺激剂,验证CD4+CD25+调节性T细胞本身并不存在分泌IL-2障碍;同时通过对脐血和成人外周血的比较性研究,了解脐血CD4+CD25+T细胞的成熟度。方法:以autoMACS从足月婴儿脐血(CB)和成人外周血(PB)分选CD4+CD25+和CD4+CD25-T细胞,以PDB+ionomycin作为刺激剂,培养45h后流式细胞术检测各组细胞表达CD69和CD25水平,并以Luminex多重细胞因子检测技术检测培养上清中7种细胞因子的浓度。结果:经PDB+ionomycin刺激后,CB、PB的CD4+CD25+和CD4+CD25-T细胞均发生增殖,但在培养45h后CD4+CD25+T细胞均出现细胞状态变差或死亡倾向。CB、PB的CD4+CD25+T细胞活化后CD25分子表达进一步上调,高于CD25-细胞活化后的CD25分子密度。经PDB+ionomycin刺激后,PB CD4+CD25+和CD4+CD25-T细胞均分泌高水平的IFN-γ、IL-2和TNF-α,但CD25+细胞分泌IL-5、IL-4和IL-10水平远远高于CD25-细胞;CBCD4+CD25+和CD4+CD25-T细胞亦分泌高水平的IL-2和TNF-α,但IFN-γ水平远远低于PB,基本不分泌IL-5、IL-4和IL-10。结论:CD4+CD25+T细胞本身并不存在合成和分泌IL-2障碍,其可能具有与传统T细胞不同的T细胞受体信息转导模式;脐血CD4+CD25+T细胞功能尚未完全成熟。

关键词： CD4^+CD25^+T细胞佛波醇酯类白细胞介素2 胎血离子霉素

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VEGF诱导血管内皮细胞产生H_2O_2及其促增殖作用

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中国病理生理杂志 2007年第3期23卷 533-535页

作者：钱中清曾耀英王通林羿季煜华肇静娴暨南大学组织移植与免疫教育部重点实验室广东广州510632

目的:研究VEGF诱导血管内皮细胞产生细胞外H2O2及其在VEGF促血管内皮细胞增殖功能中的作用。方法:①以H2DCFDA为H2O2指示剂,检测500μg/LVEGF刺激下,血管内皮细胞H2O2的产生;②以MTT法检测3×106U/L过氧化氢酶(CAT),及外源性加入5-2... 详细信息

目的:研究VEGF诱导血管内皮细胞产生细胞外H2O2及其在VEGF促血管内皮细胞增殖功能中的作用。方法:①以H2DCFDA为H2O2指示剂,检测500μg/LVEGF刺激下,血管内皮细胞H2O2的产生;②以MTT法检测3×106U/L过氧化氢酶(CAT),及外源性加入5-20mmol/LH2O2对VEGF促增殖功能的影响。结果:①在VEGF刺激血管内皮细胞15min后,细胞内开始出现逐渐增强的荧光,且随时间逐渐增强,至45min左右最强,随后逐渐减弱;而同时加入过氧化氢酶组的细胞则仅有微弱荧光产生,且荧光强度不随时间变化;②3×106U/L过氧化氢酶对VEGF的促增殖功能有明显的抑制作用(P<0.01);③外源性加入5-10mmol/LH2O2时对血管内皮细胞有明显促增殖作用(P<0.01),但其对VEGF的促增殖功能却有显著抑制作用(P<0.01)。结论:VEGF可刺激血管内皮细胞产生细胞外H2O2,在促细胞增殖中可能具有重要作用。而外源性H2O2对VEGF的生理功能可能具有抑制作用。

关键词：过氧化氢血管内皮细胞血管内皮细胞生长因子过氧化氢酶

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雌二醇对人树突状细胞成熟和功能的影响

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中国病理生理杂志 2005年第3期21卷 455-458页

作者：沈媛曾耀英肇静娴江逊王通狄静芳暨南大学组织移植与免疫教育部重点实验室广东广州510632

目的 :研究雌二醇 (17β -estradiol,E2 )对人外周血来源树突状细胞 (DCs)成熟和免疫学功能的影响。方法 :在人外周血来源DC体外培养时加入两种浓度的E2 (10 -7mol/L和 10 -6mol/L)处理 ,光镜和电镜下观察DCs的生成情况及形态变化 ,以... 详细信息

目的 :研究雌二醇 (17β -estradiol,E2 )对人外周血来源树突状细胞 (DCs)成熟和免疫学功能的影响。方法 :在人外周血来源DC体外培养时加入两种浓度的E2 (10 -7mol/L和 10 -6mol/L)处理 ,光镜和电镜下观察DCs的生成情况及形态变化 ,以流式细胞仪分析各组细胞的免疫表型 ,用ELISA方法测定其分泌的IL - 12水平 ,[3 H]-TdR掺入法检测体外混合淋巴细胞反应中DCs刺激同种反应性T细胞的增殖能力。结果 :加入E2 培养后 ,DCs树突状和膜面状伪足减少 ,表达低水平MHC -II分子和共刺激分子CD4 0、CD80和CD86 ,其分泌的IL - 12水平明显下降 ,DCs刺激同种反应性T细胞的功能显著下降。结论 :E2 抑制人外周血来源DC的成熟 ,对其免疫学功能具有负性调节作用。

关键词：树突细胞雌二醇免疫功能

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地塞米松诱导小鼠胸腺细胞线粒体去极化与凋亡进程研究

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免疫学杂志 2006年第1期22卷 54-57页

作者：王通曾耀英邢飞跃梁佩燕肇静娴何贤辉暨南大学教育部组织移植与免疫重点实验室广州510630

目的研究地塞米松(DEX)诱导小鼠胸腺细胞凋亡进程中线粒体去极化作用特点。方法无菌获取Balb/c小鼠胸腺细胞,设对照组和DEX组;在5 h时点,利用Annexin V-FITC/PI双染流式细胞术检测细胞凋亡;利用DiOC6(3)/PI双染流式细胞术检测细胞线粒... 详细信息

目的研究地塞米松(DEX)诱导小鼠胸腺细胞凋亡进程中线粒体去极化作用特点。方法无菌获取Balb/c小鼠胸腺细胞,设对照组和DEX组;在5 h时点,利用Annexin V-FITC/PI双染流式细胞术检测细胞凋亡;利用DiOC6(3)/PI双染流式细胞术检测细胞线粒体去极化与死亡;利用DiOC6(3)/Annexin V-PE双染流式细胞术检测凋亡过程中的去极化现象。结果在1×10-6mol/L DEX诱导下,小鼠胸腺细胞在5 h凋亡百分率为(36.20±5.11)%,对照组为(4.10±0.98)%,差异显著(P<0.01);DEX组坏死百分率为(4.07±0.24)%,对照组为(1.25±0.25)%,差异显著(P<0.01)。DEX组线粒体去极化增强仍存活的细胞所占百分率为(46.77±6.21)%,显著高于对照组的(12.80±4.55)%(P<0.01)。DEX组线粒体去极化增强且已启动凋亡的细胞为(35.34±4.19)%,显著高于对照组的(7.21±0.61)%(P<0.01)。DEX组线粒体去极化作用增强未凋亡的细胞为(13.68±1.27)%,显著高于对照组的(6.85±0.92)%(P<0.01)。结论DEX诱导小鼠胸腺细胞发生典型细胞凋亡和线粒体去极化增强,在该进程中,线粒体去极化增强发生在细胞膜磷脂酰丝氨酸外翻之前。

关键词：地塞米松小鼠胸腺细胞去极化凋亡进程线粒体

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Notch配体在诱导淋巴细胞分化中的不同作用

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免疫学杂志 2007年第1期23卷 107-109,111页

作者：于哲邢飞跃曾耀英暨南大学教育部组织移植与免疫重点实验室广州510632

脊椎动物Notch配体为一组单次跨膜蛋白,包括Delta1,Delta3,Delta4,Jagged1和Jagged2,它们与Notch受体结合激活Notch信号通路,决定细胞分化的命运。这些Notch配体具有不同的生物学特性,在诱导造血干/祖细胞和胸腺细胞向T、B和NK细胞分化... 详细信息

脊椎动物Notch配体为一组单次跨膜蛋白,包括Delta1,Delta3,Delta4,Jagged1和Jagged2,它们与Notch受体结合激活Notch信号通路,决定细胞分化的命运。这些Notch配体具有不同的生物学特性,在诱导造血干/祖细胞和胸腺细胞向T、B和NK细胞分化中起着不同作用,可能为免疫性疾病的治疗提供新的药物靶点。

关键词： Delta1 Delta4 Jagged1 Jagged2 淋巴细胞分化

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正常妊娠中人外周血树突状细胞亚群的研究

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中国病理生理杂志 2005年第1期21卷 50-53页

作者：沈媛曾耀英何贤辉肇静娴江逊暨南大学组织移植与免疫教育部重点实验室广东广州510632

目的探讨髓样DC(MDC)和浆细胞淋巴样DC(PDC)在正常妊娠中母胎免疫耐受机制中的作用。方法选择正常妊娠妇女30例,分别在每个妊娠妇女早期、中期和晚期妊娠时采集外周血。应用流式细胞仪术,检测MDC和PDC占外周血单个核细胞的百分率及MDC/... 详细信息

目的探讨髓样DC(MDC)和浆细胞淋巴样DC(PDC)在正常妊娠中母胎免疫耐受机制中的作用。方法选择正常妊娠妇女30例,分别在每个妊娠妇女早期、中期和晚期妊娠时采集外周血。应用流式细胞仪术,检测MDC和PDC占外周血单个核细胞的百分率及MDC/PDC比率,正常未妊娠女性为对照组。结果与未妊娠妇女外周血中MDC和PDC的百分率(MDC,032%±008%;PDC,012%±005%)及MDC/PDC比率(296±139)相比早期妊娠妇女外周血中MDC和PDC的百分率(MDC,029%±007%;PDC,011%±004%)及MDC/PDC比率(295±085)无显著差异(P>005);中期妊娠妇女外周血中MDC和PDC的百分率(MDC,011%±006%;PDC,007%±003%)及MDC/PDC比率(152±044)降低(P<001);晚期妊娠妇女外周血中MDC和PDC的百分率(MDC,012%±006%;PDC,008%±003%)及MDC/PDC比率(154±043)降低(P<001)。与正常早期妊娠妇女外周血中MDC和PDC的百分率及MDC/PDC比率相比,中、晚期妊娠显著降低(P<001)。结论正常妊娠妇女中期和晚期妊娠时外周血中MDC和PDC的百分率及MDC/PDC比率均降低。

关键词：妊娠树突细胞免疫抑制

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多聚次黄苷酸-胞苷酸诱发性小鼠流产模型CD200^+CK7^+滋养层细胞分析

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中国病理生理杂志 2005年第8期21卷 1498-1502页

作者：林羿曾耀英狄静芳曾山肇静娴王通曾祥凤冯铮暨南大学组织移植与免疫教育部重点实验室广东广州510632

目的:在多聚次黄苷酸-胞苷酸[poly(I∶C)]诱发性流产小鼠模型中研究CD200+CK7+细胞与胚胎吸收的关系。方法:采用Balb/c×C57BL/6和Balb/c×Balb/c小鼠,在孕早期注射poly(I∶C)以建立诱发性流产模型,并采用流式细胞术检测胎盘CD2... 详细信息

目的:在多聚次黄苷酸-胞苷酸[poly(I∶C)]诱发性流产小鼠模型中研究CD200+CK7+细胞与胚胎吸收的关系。方法:采用Balb/c×C57BL/6和Balb/c×Balb/c小鼠,在孕早期注射poly(I∶C)以建立诱发性流产模型,并采用流式细胞术检测胎盘CD200+CK7+/CK7+细胞百分率和CD200+CK7+细胞的绝对数,采用免疫组化法对CD200+细胞在母-胎界面的分布情况进行定位检测。结果:在每例检测104个细胞的情况下,poly(I∶C)处理组上述细胞百分率和绝对数均显著低于对照组(Balb/c×C57BL/6小鼠:6·3%±6·2%vs36·1%±9·3%,P<0·01;140±111vs1941±809,P<0·01。Balb/c×Balb/c小鼠:8·5%±4·8%vs26·1%±8·0%,P<0·01;701±499vs1886±1112,P<0·05)。与此相应,poly(I∶C)处理组孕13·5d的胚胎吸收率也显著增高(Balb/c×C57BL/6小鼠:从9·1%升至37·0%,P<0·01;Balb/c×Balb/c小鼠:从5·8%升至29·0%,P<0·01)。免疫组化法检测发现,这些CD200+细胞主要分布在胎盘和子宫交界处的胎盘组织中。结论:在母-胎界面CK7+细胞群中CD200分子适当水平的表达,对于维持小鼠妊娠免疫耐受过程可能具有重要意义。

关键词：流产滋养层角蛋白

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槲皮素对小鼠T细胞体外活化的抑制作用

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中国病理生理杂志 2003年第4期19卷 468-471页

作者：王南曾耀英何贤辉肇静娴邱海霞暨南大学组织移植与免疫教育部重点实验室广东广州510632

目的 :通过分析槲皮素对淋巴细胞早期活化标记物CD6 9表达的影响 ,探讨其对T淋巴细胞体外活化抑制作用的机制。方法 :分离小鼠淋巴结细胞 ,加入多克隆刺激剂及槲皮素共同培养 ,分别于 2、6、2 4h收获细胞 ,进行双色免疫荧光标记 ,以流... 详细信息

目的 :通过分析槲皮素对淋巴细胞早期活化标记物CD6 9表达的影响 ,探讨其对T淋巴细胞体外活化抑制作用的机制。方法 :分离小鼠淋巴结细胞 ,加入多克隆刺激剂及槲皮素共同培养 ,分别于 2、6、2 4h收获细胞 ,进行双色免疫荧光标记 ,以流式细胞仪对T细胞的CD6 9分子表达情况进行分析并计算抑制率。结果 :槲皮素 (终浓度 10 μmol/L)对未受刺激的T细胞CD6 9表达百分率无明显影响 ,而经佛波醇酯 (PDB)及刀豆蛋白A(ConA)活化同时加入槲皮素的T细胞CD6 9表达百分率在 2h、6h及 2 4h均显著下降 (P <0 .0 1)。槲皮素对PDB的抑制率随作用时间延长而明显下降 ,对ConA的抑制率平缓而持久。结论 :槲皮素对PDB、ConA活化的T淋巴细胞均显示明显的抑制效应 ,表明该药可能作用于T细胞活化信号传递通路蛋白激酶Cθ或其下游部位 ,并且 ,这种抑制效应表现出一定的可逆性。

关键词：槲皮素小鼠 T细胞体外活化抑制作用流式细胞术

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CD4^+CD25^+调节性T细胞的发育与胸腺CD4^-CD25^+细胞关联性的探讨

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中国病理生理杂志 2005年第7期21卷 1406-1410页

作者：肇静娴曾耀英暨南大学组织移植与免疫教育部重点实验室广东广州510632

目的:探讨CD4+CD25+调节性T细胞(CD4+CD25+regulatoryTcells,CD4+CD25+Tr)的发育及其与胸腺CD4-CD25+细胞的关系。方法:以流式细胞术检测小鼠从出生至发育成熟过程中,胸腺、脾脏、淋巴结和外周血中CD4+CD25+Tr比例变化,以及胸腺CD4-CD25... 详细信息

目的:探讨CD4+CD25+调节性T细胞(CD4+CD25+regulatoryTcells,CD4+CD25+Tr)的发育及其与胸腺CD4-CD25+细胞的关系。方法:以流式细胞术检测小鼠从出生至发育成熟过程中,胸腺、脾脏、淋巴结和外周血中CD4+CD25+Tr比例变化,以及胸腺CD4-CD25+细胞比例变化;通过磁激活细胞分选(MACS)从小鼠淋巴结纯化CD4+CD25+T和CD4+CD25-T细胞,经CFDA-SE标记,以多种刺激形式诱导增殖。结果:小鼠出生1d到10周的发育过程中,胸腺CD4+CD25+Tr比例一直比较恒定,但在脾脏、淋巴结和外周血,随鼠龄增加而不断升高,从1d龄到1周时升高最迅速,其后的升高速度逐渐减慢,10周龄时达平台期。胸腺中CD4-CD25+细胞在出生1d的小鼠比例非常高,1d龄到1周龄期间迅速下降,10周龄时达平台期。ConA不能诱导CD4+CD25+Tr和CD4+CD25-T细胞增殖,但CD4+CD25+Tr出现一过性细胞增大;佛波醇酯加离子霉素能诱导CD4+CD25+Tr和CD4+CD25-T细胞增殖;包被的抗CD3抗体加可溶性抗CD28抗体能刺激CD4+CD25-T细胞增殖,但CD4+CD25+Tr不增殖,加入高浓度IL-2,CD4+CD25-T细胞增殖更强,CD4+CD25+Tr出现增殖。结论:胸腺CD4-CD25+细胞很有可能是CD4+CD25+Tr的前体。

关键词： CD4^+CD25^+ 调节性T细胞胸腺 CD4^-CD25^+细胞

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