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植物生理学报 2024年第1期60卷 97-107页

作者：李文静张新业张智研冯恰刘薇李红敬张艳霞赵金萍王聪艳赵楠楠朱姝廊坊师范学院生命科学学院河北廊坊065000 廊坊市细胞工程与应用研究重点实验室河北廊坊065000

硝酸盐转运蛋白2(Nitrate transporter 2,NRT2),是一种高亲和硝酸盐转运蛋白,在植物对硝酸盐的吸收和转运过程中发挥重要作用。本研究通过生物信息学方法对番茄(Solanum lycopersicum)NRT2(SlNRT2)家族基因进行鉴定,利用热图分析SlNRT2... 详细信息

硝酸盐转运蛋白2(Nitrate transporter 2,NRT2),是一种高亲和硝酸盐转运蛋白,在植物对硝酸盐的吸收和转运过程中发挥重要作用。本研究通过生物信息学方法对番茄(Solanum lycopersicum)NRT2(SlNRT2)家族基因进行鉴定,利用热图分析SlNRT2家族成员基因表达模式,并利用启动子嵌合GUS报告基因转化拟南芥对SlNRT2启动子活性进行分析。结果表明番茄基因组中鉴定到5个NRT2基因,定位于细胞膜,氨基酸序列长度介于458~531 aa,等电点介于9.05~9.33,不稳定性指数介于31.84~40.70。基因结构分析表明,该基因家族由3~4个外显子构成。染色体定位分析显示,SlNRT2基因分布于3条染色体上。系统进化和保守结构域分析显示,SlNRT2分别归属于I和II两个类群,具有10种保守基序,蛋白保守性很高。番茄不同组织热图分析表明SlNRT2.1和SlNRT2.2呈组成型表达;SlNRT2.3~SlNRT2.5主要在根部表达。启动子顺式作用元件及GUS组织化学染色分析结果表明,SlNRT2.4启动子驱动GUS基因在拟南芥根部特异性表达,而SlNRT2.3和SlNRT2.5除驱动GUS基因在拟南芥根部表达,叶片也有表达。本研究为后续开展SlNRT2基因的功能研究提供依据,同时为培育氮素高效利用型转基因番茄奠定了基础。

关键词：番茄硝酸盐转运蛋白基因家族启动子 GUS组织化学染色

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番茄SlTIP-1基因的克隆、表达及启动子活性分析

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植物生理学报 2020年第6期56卷 1221-1230页

作者：李文静李甜饴乔洁朱姝程兴茹王聪艳张新业廊坊师范学院生命科学学院河北廊坊065000 河北省动物多样性重点实验室河北廊坊065000 廊坊市细胞工程与应用研究重点实验室河北廊坊065000

为研究水孔蛋白分子功能,本研究以番茄(Solanum lycopersicum)矮化品种‘Micro-Tom’为材料,采用RTPCR技术克隆得到1个液泡膜内在蛋白(tonoplast intrinsic proteins,TIPs)类的水孔蛋白基因,命名为SlTIP-1,其开放阅读框(ORF)长753 bp,编码250个氨基酸。基因结构分析发现SlTIP-1有3个外显子和2个内含子。生物信息学分析表明SlTIP-1蛋白含有6个跨膜区及2个NPA(天冬酰胺-脯氨酸-丙氨酸)基序,具有MIP超家族典型的蛋白保守区序列特征。系统进化分析表明,SlTIP-1蛋白与野生种潘那利番茄TIP共聚于一支。实时定量PCR结果表明,SlTIP-1在番茄根中特异性表达。将SlTIP-1基因起始密码子上游1085 bp的序列构建到植物表达载体pBI121中,转化拟南芥(Arabidopsis thaliana)并进行GUS组织化学染色分析。结果表明,SlTIP-1基因启动子驱动GUS基因在拟南芥根部特异性表达,与实时定量PCR结果一致。本研究拟为进一步探索该基因的功能及番茄分子辅助育种提供理论依据。

关键词：番茄水孔蛋白基因克隆根特异性启动子 GUS组织化学染色

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菊芋木质素合成相关基因HtHCT的克隆及表达分析

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植物生理学报 2020年第5期56卷 1023-1032页

作者：张新业王聪艳苏彦苹冯雪贾永红李文静廊坊师范学院生命科学学院河北廊坊065000 河北省动物多样性重点实验室河北廊坊065000 廊坊市细胞工程与应用研究重点实验室河北廊坊065000

羟基肉桂酰辅酶A:莽草酸/奎宁酸羟基肉桂酰转移酶(hydroxycinnamoyl-CoA:shikimate/quinate hydroxycin-namoyltransferase,HCT)在植物木质素合成过程中具有重要作用。本研究以菊芋‘廊芋8号’为材料,成功克隆到一个菊芋HCT基因——HtH... 详细信息

羟基肉桂酰辅酶A:莽草酸/奎宁酸羟基肉桂酰转移酶(hydroxycinnamoyl-CoA:shikimate/quinate hydroxycin-namoyltransferase,HCT)在植物木质素合成过程中具有重要作用。本研究以菊芋‘廊芋8号’为材料,成功克隆到一个菊芋HCT基因——HtHCT,其不含内含子,开放阅读框(ORF)为1293 bp,编码430个氨基酸。HtHCT含有HCT蛋白共有的保守序列HXXXD和DFGWG。系统进化分析表明,HtHCT与向日葵HCT蛋白(QBM78942.1)亲缘关系最近,共聚于一支。原核表达结果表明,HtHCT蛋白成功被诱导表达。荧光定量PCR结果显示,Ht HCT基因在菊芋各组织中均有表达,其中茎中表达量最高。此外,HtHCT基因能够响应盐胁迫(150 mmol·L-1 NaCl)和干旱胁迫(20%PEG-6000),NaCl处理24 h的Ht HCT基因表达量显著高于对照,PEG处理12 h的HtHCT表达量与对照相比显著上调了10倍。

关键词：菊芋羟基肉桂酰辅酶A:莽草酸/奎宁酸羟基肉桂酰转移酶(HCT) 木质素合成原核表达荧光定量PCR 胁迫处理

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番茄金属硫蛋白基因家族鉴定、SlMT3基因表达及启动子活性分析

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植物生理学报 2021年第9期57卷 1755-1766页

作者：李文静王秋平黄丽婕刘文杰冯珂刘亚雯朱姝王聪艳王晓铮蒋秀虹张新业廊坊师范学院生命科学学院河北廊坊065000 河北省动物多样性重点实验室河北廊坊065000 廊坊市细胞工程与应用研究重点实验室河北廊坊065000

金属硫蛋白(metallothioneins,MTs)是一类低分子量、富含半胱氨酸的金属结合蛋白,在维持金属稳态和去除金属毒性方面具有重要作用。本研究通过生物信息学方法对番茄(Solanum lycopersicum)MT家族基因(SlMT)进行鉴定,利用荧光定量PCR技... 详细信息

金属硫蛋白(metallothioneins,MTs)是一类低分子量、富含半胱氨酸的金属结合蛋白,在维持金属稳态和去除金属毒性方面具有重要作用。本研究通过生物信息学方法对番茄(Solanum lycopersicum)MT家族基因(SlMT)进行鉴定,利用荧光定量PCR技术分析家族成员SlMT3基因表达模式,并利用GUS报告基因对SlMT3启动子活性进行分析。结果表明番茄基因组中共鉴定到5个MT基因,主要定位于细胞质,蛋白序列长度在72~112 aa,等电点介于4.49~5.71。基因结构分析表明,该基因家族由2~3个外显子构成。染色体分布结果显示,SlMT基因分布于3条染色体上。系统进化和保守结构域分析显示,SlMT分别归属于Ⅰ、Ⅱ和Ⅲ三个亚族,具有3种保守基序,蛋白保守性很高。荧光定量PCR结果表明,SlMT3在番茄根中特异性表达。启动子顺式作用元件及GUS组织化学染色分析结果表明,SlMT3基因启动子驱动GUS基因在拟南芥根部特异性表达,与荧光定量PCR结果一致。本研究为后续开展SlMT基因的功能研究和番茄遗传改良提供理论依据。

关键词：番茄金属硫蛋白基因家族根特异性启动子 GUS组织化学染色

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热应激应答过程中酪蛋白来源的环状RNA表达谱分析

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农业生物技术学报 2022年第10期30卷 1926-1935页

作者：齐颖解春艳刑静李秋玲廊坊师范学院生命科学学院/河北省动物多样性重点实验室/廊坊市细胞工程与应用研究重点实验室

热应激会导致牛乳中酪蛋白含量减少，降低牛乳品质。本研究拟鉴定参与热应激应答的酪蛋白基因来源的环状RNA，为今后阐明热应激导致酪蛋白表达减少的分子机制提供理论依据。本课题组前期工作通过RNA-seq获取了环状RNA在非热应激及热应... 详细信息

热应激会导致牛乳中酪蛋白含量减少，降低牛乳品质。本研究拟鉴定参与热应激应答的酪蛋白基因来源的环状RNA，为今后阐明热应激导致酪蛋白表达减少的分子机制提供理论依据。本课题组前期工作通过RNA-seq获取了环状RNA在非热应激及热应激奶牛(Bos taurus)乳腺组织中的表达数据。本研究随机挑选4个环状RNA，通过Sanger测序法验证了其反向剪接位点的存在；通过实时荧光定量PCR技术验证了其在非热应激及热应激组中的相对表达水平，所得结果与高通量测序分析结果一致。酪蛋白的编码基因包括αs1酪蛋白(casein alpha s1, CSN1S1)、αs2酪蛋白(CSN1S2)、β酪蛋白(casein beta, CSN2)以及κ酪蛋白(casein kappa, CSN3)。通过统计分析环状RNA的宿主基因数据，分别统计了来源于各个编码基因的环状RNA，通过聚类热图及韦恩图展示了这些环状RNA在不同样本及不同组别中的表达模式。最后，通过RNA-seq的TPM (transcripts per million)数据分析了酪蛋白基因来源的环状RNA的相对表达水平。本研究鉴定出源于酪蛋白基因的环状RNA共52个，其中来源于CSN1S1、CSN1S2和CSN2的环状RNA种类分别为29、16和7个，未检测到来源于CSN3的环状RNA。这些环状RNA中，与非热应激组相比，显著上调的环状RNA有5种，其中3种在热应激条件下特异性表达。所鉴定的酪蛋白来源的环状RNA，在热应激应答过程中显著差异表达(P<0.05)，可能参与了热应激应答过程的乳蛋白合成调控。本研究鉴定了热应激应答过程中酪蛋白来源的环状RNA差异表达谱，有助于阐明热应激导致牛乳中酪蛋白含量减少的分子机制，为提高牛乳品质提供了理论依据。

关键词：环状RNA 热应激牛乳 αs1酪蛋白(CSN1S1) αs2酪蛋白(CSN1S2) β酪蛋白(CSN2)

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LOC112447378/miR-15a/PRLR信号轴对MAC-T细胞增殖及凋亡的调控及机制

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农业生物技术学报 2024年第10期32卷 2293-2305页

作者：高梦静韩承芮张晓雨郭月美刘思萌谢圣浩李秋玲齐颖廊坊师范学院生命科学学院河北省动物多样性重点实验室/廊坊市细胞工程与应用研究重点实验室

全球气候变暖使奶牛(Bos taurus)热应激问题日益突出，给乳业带来巨大的经济损失。阐明奶牛热应激发生及应答的分子机制，可以更好地解决热应激问题。本研究团队前期通过高通量测序技术筛选出热应激与非热应激差异表达的长链非编码RNA (... 详细信息

全球气候变暖使奶牛(Bos taurus)热应激问题日益突出，给乳业带来巨大的经济损失。阐明奶牛热应激发生及应答的分子机制，可以更好地解决热应激问题。本研究团队前期通过高通量测序技术筛选出热应激与非热应激差异表达的长链非编码RNA (long non-coding RNA, lncRNA)、微小RNA(microRNAs, miRNA)及mRNA表达谱。本研究通过生物信息学分析，筛选并确定LOC112447378/miR-15a/PRLR为热应激应答关键竞争性内源RNA(competing endogenous RNA, ceRNA)网络。通过牛乳腺上皮细胞(mammary alveolar cells-large T antigen cells, MAC-T)构建体外热应激模型，以此模型为基础，通过qRT-PCR技术确定LOC112447378、miR-15a和催乳素受体(prolactin receptor, PRLR)的mRNA表达水平，通过Western blot技术确定PRLR的蛋白质水平，均与高通量测序结果一致。过表达miR-15a后，LOC112447378的mRNA表达水平显著下调；PRLR的m RNA及蛋白质水平均显著下调。敲降miR-15a后，LOC112447378的mRNA表达水平显著上调；PRLR的m RNA及蛋白质水平均显著上调。噻唑蓝(methyl thiazolyl tetrazolium, MTT)检测结果显示，miR-15a抑制MAC-T的增殖。Annexin V-FITC/PI双染检测结果显示，miR-15a促进MAC-T的凋亡。这些结果表明，miR-15a可以靶向调控靶基因LOC112447378和PRLR，进而实现抑制MAC-T增殖、促进凋亡的调控作用。LOC112447378/miR-15a/PRLR信号轴可以影响MAC-T的增殖及凋亡，进而在MAC-T的热应激应答过程中发挥重要调控作用。本研究为今后筛选耐热、高产奶牛的分子育种工作提供新的思路和理论依据。

关键词：热应激牛乳腺上皮细胞(MAC-T) miR-15a 催乳素受体(PRLR) 长链非编码RNA (lncRNA)

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胡萝卜4CL基因家族的鉴定及分析

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西北农业学报 2023年第9期32卷 1365-1375页

作者：张新业李文静闫训友郑京朱姝王聪艳周志国廊坊师范学院生命科学学院河北廊坊065000 河北省动物多样性重点实验室河北廊坊065000 廊坊市细胞工程与应用研究重点实验室河北廊坊065000

旨在全基因组水平上鉴定胡萝卜4CL基因,揭示该基因家族成员的理化性质、系统进化、基因结构、组织表达模式及胁迫响应情况,为胡萝卜4CL的功能研究和利用奠定基础。基于AMP结合结构域(PF00501)的隐马尔可夫模型文件,利用HMMER软件对胡萝... 详细信息

旨在全基因组水平上鉴定胡萝卜4CL基因,揭示该基因家族成员的理化性质、系统进化、基因结构、组织表达模式及胁迫响应情况,为胡萝卜4CL的功能研究和利用奠定基础。基于AMP结合结构域(PF00501)的隐马尔可夫模型文件,利用HMMER软件对胡萝卜蛋白质数据库进行检索,获得胡萝卜4CL基因(命名为Dc4CL);利用ProtParam分析Dc4CL的理化性质;利用MEGA6对Dc4CL进行系统进化分析;使用GSDS2.0、MEME分析Dc4CL的基因及蛋白结构;利用荧光定量PCR技术对Dc4CL的组织表达模式及胁迫响应情况进行研究。结果表明,胡萝卜基因组中存在12个4CL基因,分别为Dc4CL1~Dc4CL12。Dc4CL基因开放阅读框(ORF)长度为1350~3363 bp,编码蛋白质长度为449~1120 aa,编码蛋白的分子质量和等电点分别为48.92~123.73 ku和5.34~8.82。系统进化分析表明,Dc4CL与其他来自水稻、拟南芥、二穗短柄草、高粱、大白菜的4CL蛋白可分为两个类群。结构分析表明,Dc4CL基因外显子数目为4~11个,其蛋白序列中均含有BoxⅠ(SSGTTGLPKGV)和BoxⅡ(GEICIRG)两个保守序列。荧光定量PCR结果表明,Dc4CL3、Dc4CL12在胡萝卜叶片及肉质根中均有表达,而Dc4CL8主要在叶片中表达,盐胁迫和低温胁迫均使Dc4CL3、Dc4CL8、Dc4CL12的表达降低。总之,胡萝卜的12个Dc4CL基因在影响4CL蛋白功能的关键位点处具有保守性,而在其他位置上存在一定的差异,且部分成员在逆境胁迫应答过程中可能发挥了一定的作用。

关键词：胡萝卜(Daucus carota) 4-香豆酰CoA连接酶(4CL) 基因家族生物信息学分析基因表达分析

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菊芋HtCCR1基因的克隆与表达分析

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西北植物学报 2019年第11期39卷 1919-1928页

作者：张新业苏彦苹乔洁王聪艳李文静廊坊师范学院生命科学学院河北廊坊065000 河北省动物多样性重点实验室河北廊坊065000 廊坊市细胞工程与应用研究重点实验室河北廊坊065000

肉桂酰辅酶A还原酶(cinnamoyl-CoA reductase,CCR)是木质素合成代谢的关键酶。该研究以菊芋(Helianthus tuberosus L.)‘廊芋8号’为材料,克隆到1个菊芋的CCR基因,命名为HtCCR 1(GenBank登录号为MN205540),其开放阅读框(ORF)长975 bp,编码324个氨基酸,其中含有FR_SDR_e保守结构域。系统进化分析表明,HtCCR1与向日葵CCR蛋白(XP_021989763.1)共聚于一支,二者亲缘关系最近。实时定量PCR分析表明,HtCCR 1基因在菊芋茎和叶中的表达量显著高于在根和块茎中;盐(150 mmol·L^-1 NaCl)胁迫处理6、12和24 h后,处理组HtCCR 1基因的表达量均显著高于对照组;干旱(20%PEG6000)胁迫6和12 h后,处理组HtCCR 1基因的表达较对照组均显著上调。成功构建pET-28a-HtCCR 1原核表达载体,转化大肠杆菌BL21(DE3)并诱导出了符合预期大小的蛋白,表明HtCCR1重组蛋白已成功表达。该研究结果为进一步研究HtCCR 1基因的功能及利用基因工程手段调节菊芋中木质素的生物合成奠定了基础。

关键词：菊芋肉桂酰辅酶A还原酶(CCR) 原核表达荧光定量PCR 胁迫处理

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菊芋查尔酮合成酶基因的克隆与表达分析

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西北农业学报 2020年第4期29卷 603-612页

作者：李文静孙艳香付亚娟苏彦苹王聪艳侯晓强张新业廊坊师范学院生命科学学院河北廊坊065000 河北省动物多样性重点实验室河北廊坊065000 廊坊市细胞工程与应用研究重点实验室河北廊坊065000

为揭示菊芋(Helianthus tuberosus L.)查尔酮合成酶(chalcone synthase,CHS)基因的功能,以菊芋‘廊芋8号’叶片为材料,采用同源克隆和RT-PCR技术,克隆得到菊芋CHS基因命名为HtCHS,其编码区全长为1197 bp(GenBank登录号MN124515),编码398个氨基酸。HtCHS的基因组DNA(gDNA)全长为1567 bp,含2个外显子和1个内含子。序列比对和系统进化树分析显示,不同植物中的CHS氨基酸序列具有极高的同源性,菊芋与同属的向日葵CHS氨基酸序列一致性达到99.25%,共聚于一个分支。HtCHS蛋白相对分子质量为43.61 ku,等电点为6.33。HtCHS蛋白具有查尔酮合成酶结构域,属于查尔酮合成酶超家族成员,HtCHS不含信号肽和跨膜区,属于非分泌蛋白。实时荧光定量PCR结果显示,HtCHS在根中表达量最高。与对照相比,150 mmol·L-1 NaCl和20%PEG 6000处理6 h时HtCHS表达显著上调,处理12 h时显著下调。原核诱导表达分析结果显示,成功诱导出与预测蛋白大小一致的目的蛋白。

关键词：菊芋查尔酮合成酶基因克隆生物信息学分析原核表达基因表达分析

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异源表达菊芋HtHCT基因对受体植物木质素相关生理生化指标的影响

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西北农业学报 2022年第1期31卷 63-71页

作者：张新业苏彦苹朱姝王聪艳侯晓强李文静廊坊师范学院生命科学学院河北廊坊065000 河北省动物多样性重点实验室河北廊坊065000 廊坊市细胞工程与应用研究重点实验室河北廊坊065000

羟基肉桂酰辅酶A:莽草酸/奎宁酸羟基肉桂酰转移酶(HCT)是木质素合成过程中的关键酶之一。本研究构建了菊芋HtHCT基因的植物表达载体pCAMBIA1390-HtHCT,分别对拟南芥和本氏烟进行遗传转化,并对转基因植株进行生理生化指标测定。PCR和RT-... 详细信息

羟基肉桂酰辅酶A:莽草酸/奎宁酸羟基肉桂酰转移酶(HCT)是木质素合成过程中的关键酶之一。本研究构建了菊芋HtHCT基因的植物表达载体pCAMBIA1390-HtHCT,分别对拟南芥和本氏烟进行遗传转化,并对转基因植株进行生理生化指标测定。PCR和RT-PCR结果表明,HtHCT基因已经插入到受体植物基因组中,并能进行转录;转基因植株生理生化指标检测表明,HtHCT基因能够调节拟南芥和本氏烟中木质素的含量及组成,并对受体材料的类黄酮合成亦有一定的影响。

关键词：菊芋 HtHCT基因木质素类黄酮功能研究

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