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携带人OCT4A基因的慢病毒载体的构建及其稳定转染K562白血病细胞株的建立

中国实验血液学杂志 2014年第6期22卷 1514-1520页

作者：孟凡静曹江周俊吴庆运陈翀徐开林徐州医学院移植免疫实验室江苏徐州221002 徐州医学院附属医院血液科江苏徐州221002

本研究旨在构建共表达人OCT4A与绿色荧光蛋白(GFP)慢病毒载体p LVX-OCT4A-Zs Green1,并通过感染获得稳定表达重组质粒的白血病K562细胞系,观察OCT4A在其中的表达。根据Gen Bank数据库提供的OCT4A mRNA序列,合成编码mRNA基因的特异性引... 详细信息

本研究旨在构建共表达人OCT4A与绿色荧光蛋白(GFP)慢病毒载体p LVX-OCT4A-Zs Green1,并通过感染获得稳定表达重组质粒的白血病K562细胞系,观察OCT4A在其中的表达。根据Gen Bank数据库提供的OCT4A mRNA序列,合成编码mRNA基因的特异性引物序列,通过RT-PCR技术扩增出OCT4A全长片段,克隆至p CR-Blunt载体。将OCT4A DNA片段酶切回收后克隆至经EcoR1酶切线性化的慢病毒载体p LVX-IRES-ZsGreen1,构建p LVX-OCT4A-Zs Green1慢病毒重组质粒,利用测序鉴定所构建的重组载体是否正确。经三质粒包装系统包装后获得高滴度慢病毒颗粒并感染人白血病细胞系K562,通过流式细胞仪分选获得稳定表达的白血病细胞系,应用Real-time PCR和Western blot方法分别检测稳定转染细胞系的OCT4A mRNA和OCT4A蛋白表达。应用CCK-8法和平板细胞克隆形成试验测定OCT4A对K562细胞增殖能力的影响。结果表明,经限制性内切酶检测及基因测序证实成功构建了携带OCT4A基因的重组慢病毒;包装病毒颗粒超速离心后病毒滴度达(1.43±0.25)×108U/ml;病毒感染K562细胞后经流式细胞仪分选获得GFP+细胞,实时定量PCR及Western blot证实病毒感染后OCT4A基因及蛋白的表达可有效上调;CCK-8法及平板集落形成试验显示病毒感染的K562细胞体外增殖活性明显升高,与对照组相比均有统计学差异(P<0.05)。结论:成功构建了表达OCT4A基因的慢病毒载体,并且获得可稳定上调OCT4A表达的K562细胞株。

关键词： OCT4A基因慢病毒载体白血病载体构建 K562细胞

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NLRP1在血液疾病中作用的研究进展

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中国实验血液学杂志 2014年第5期22卷 1476-1479页

作者：吴进燕曾令宇徐州医学院附属医院血液科江苏徐州221002 徐州医学院移植免疫实验室江苏徐州221002

炎性复合体是存在于胞浆中的一组多蛋白复合体,它能够活化胱天蛋白酶(caspase)-1,后者介导IL(interleukin)-1β、IL-18和IL-33等促炎因子的成熟与释放。NALP1(NACHT leucine-rich-repeat protein 1)也称NLRP1,是最早被鉴定出来的具有明... 详细信息

炎性复合体是存在于胞浆中的一组多蛋白复合体,它能够活化胱天蛋白酶(caspase)-1,后者介导IL(interleukin)-1β、IL-18和IL-33等促炎因子的成熟与释放。NALP1(NACHT leucine-rich-repeat protein 1)也称NLRP1,是最早被鉴定出来的具有明确配体的炎性复合体之一,它参与多种炎症反应和细胞凋亡的调节作用。此外,还有研究发现NLRP1在急性白血病的发生发展及诱导骨髓造血干细胞凋亡等血液系统疾病中也发挥着重要作用。本文将对NLRP1的结构、活化机制、调控及在造血系统中的作用进行综述。

关键词： NLRP1 炎性复合体血液病固有免疫

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炎性复合体在造血干细胞移植后肝静脉闭塞病中作用的研究进展

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国际输血及血液学杂志 2015年第1期38卷 50-52页

作者：黄玉金曾令宇新沂市人民医院血液科 221400 徐州医学院附属医院血液科实验室 221002

肝静脉闭塞病（HVOD）是造血干细胞移植（HSCT）后的严重肝脏损伤并发症,典型HVOD一般发生在HSCT后1个月内.HVOD的发生机制迄今尚未完全清楚,其中炎症是影响HVOD的常见因素之一.炎症是以固有免疫细胞活化、分泌白细胞介素（IL）-1α,-1... 详细信息

肝静脉闭塞病（HVOD）是造血干细胞移植（HSCT）后的严重肝脏损伤并发症,典型HVOD一般发生在HSCT后1个月内.HVOD的发生机制迄今尚未完全清楚,其中炎症是影响HVOD的常见因素之一.炎症是以固有免疫细胞活化、分泌白细胞介素（IL）-1α,-1β及肿瘤坏死因子（TNF）-α等促炎因子为特征的损伤性反应,而炎性复合体是促炎因子水解活化的蛋白平台,可间接影响炎性损伤程度.笔者拟就炎性复合体在HSCT后HVOD发生中的研究进展进行综述如下.

关键词：造血干细胞移植肝静脉闭塞病炎症细胞因子类

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NLRP3炎性复合体表达水平与小鼠异基因造血干细胞移植肝损伤的关系研究

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中华血液学杂志 2014年第8期35卷 684-688页

作者：黄玉金付金玉吴进燕房婷化静刘迷迷郭娜徐开林曾令宇徐州医学院附属医院血液科实验室 221002

目的探索NOD样受体蛋白3（NLRP3）炎性复合体表达与小鼠异基因造血干细胞移植（allo-HSCT）肝损伤的关系.方法建立allo-HSCT小鼠模型,流式细胞术检测受鼠骨髓嵌合率;通过HE染色、免疫组化染色及Masson染色观察肝组织病理形态,通过病... 详细信息

目的探索NOD样受体蛋白3（NLRP3）炎性复合体表达与小鼠异基因造血干细胞移植（allo-HSCT）肝损伤的关系.方法建立allo-HSCT小鼠模型,流式细胞术检测受鼠骨髓嵌合率;通过HE染色、免疫组化染色及Masson染色观察肝组织病理形态,通过病理损伤评分评价肝损伤程度;用Western blot法检测肝脏组织炎性细胞及NLRP3炎性复合体表达水平;用实时荧光定量PCR法检测肝组织NLRP3炎性复合体组分相关基因及细胞因子IL-1β、IL-18 mRNA表达水平.结果 allo-HSCT后第10天（＋10 d）,供鼠造血干细胞基本上完全植入,嵌合率大于97％,同时肝脏病理形态显示有肝损伤,＋15d肝损伤最重,随后逐渐减轻;在肝损伤过程中伴有IL-1β、IL-18 mRNA表达水平增高,＋15d时二者表达量分别为正常组的（1.19±0.40）倍和（1.64±0.76）倍;在肝损伤最严重时伴有caspase-1mRNA表达水平增高,为正常组的（3.51±0.46）倍;移植后肝组织细胞NLRP1、NLRP3、NLRC4、NLRP5mRNA均有一定程度的表达,其中NLRP3表达水平最高,其mRNA及蛋白表达水平与肝损伤程度同步,＋15d时mRNA表达量为正常组的（2.91±0.41）倍.结论 NLRP3在allo-HSCT小鼠表达水平明显增高,可能为移植后肝脏炎症性损伤的因素之一.

关键词：造血干细胞移植肝脏损伤细胞因子基因,NLRP3

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白细胞介素22对移植物抗宿主病小鼠胸腺的修复作用及功能的影响

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中华血液学杂志 2014年第9期35卷 822-825页

作者：赵恺赵冬梅尹玲玲潘彬徐开林徐州医学院附属医院血液科实验室 221002

目的探讨白细胞介素22（IL-22）对异基因骨髓移植（allo-BMT）后并发移植物抗宿主病（GVHD）小鼠胸腺的修复作用及其对胸腺免疫功能的影响.方法分别以6～8周龄、雄性C57BL/6和BALB/c小鼠为供受鼠,建立GVHD模型.实验分为正常对照组、G... 详细信息

目的探讨白细胞介素22（IL-22）对异基因骨髓移植（allo-BMT）后并发移植物抗宿主病（GVHD）小鼠胸腺的修复作用及其对胸腺免疫功能的影响.方法分别以6～8周龄、雄性C57BL/6和BALB/c小鼠为供受鼠,建立GVHD模型.实验分为正常对照组、GVHD小鼠注射IL-22组（BS＋IL-22）、GVHD小鼠注射PBS组（BS＋PBS）.采用锥虫蓝染色法检测移植后不同时间点小鼠胸腺细胞数量.采用流式细胞术检测胸腺T细胞各亚群的比例、分泌IFN-γ和IL-17效应性T细胞及CD4＋T和CD8＋T细胞比例.结果＋14d时BS＋IL-22组小鼠的胸腺细胞总数[（14.6±5.1）×10^4]明显高于BS＋PBS组[（6.2±2.9）×10^4];BS＋IL-22组小鼠胸腺细胞数量随移植时间延长持续增多,到＋21和＋28 d细胞数量与正常对照组小鼠相比差异无统计学意义,且仍高于BS＋PBS组.小鼠allo-BMT后注射IL-22对胸腺成熟CD4＋和CD8＋T细胞的比例无影响,但可显著提高未成熟CD4＋CD8＋T细胞亚群的比例.IL-22可上调胸腺IFN-γ＋CD4＋T细胞[（2.42±0.75）％]和IFN-γ＋CD8＋T细胞[（5.44±0.47）％]比例,而对IL-17＋CD4＋T细胞和IL-17＋CD8＋T细胞无影响.结论 IL-22可加速allo-BMT后小鼠胸腺的修复过程,并增强胸腺CD4＋和CD8＋T细胞分泌IFN-γ的能力.

关键词：白细胞介素22 骨髓移植移植物抗宿主病 T淋巴细胞

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慢病毒载体介导SPROUTY2基因过表达对多发性骨髓瘤RPMI8226细胞增殖作用的影响

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白血病．淋巴瘤 2014年第11期23卷 658-663页

作者：边月平姚瑶夏丹丹赵恺潘彬牛铭山曾令宇徐开林徐州医学院移植免疫实验室徐州医学院附属医院血液科 221002

目的探讨慢病毒表达载体介导的人SPROUTY2基因过表达对多发性骨髓瘤RPMI8226细胞增殖、克隆性生长和细胞外调节蛋白激酶（ERK）抑制剂敏感性等生物学特性的影响.方法克隆人SPROUTY2基因,构建SPROUTY2基因与绿色荧光蛋白（GFP）的重组... 详细信息

目的探讨慢病毒表达载体介导的人SPROUTY2基因过表达对多发性骨髓瘤RPMI8226细胞增殖、克隆性生长和细胞外调节蛋白激酶（ERK）抑制剂敏感性等生物学特性的影响.方法克隆人SPROUTY2基因,构建SPROUTY2基因与绿色荧光蛋白（GFP）的重组慢病毒表达载体LV-S-GFP及对照载体LV-GFP.脂质体法包装病毒;优化慢病毒感染RPMI8226细胞的条件;荧光显微镜观察GFP表达;反转录聚合酶链反应（PCR）、蛋白质印迹法（Western blot）方法分别检测目的基因及其蛋白的表达,CCK-8法检测RPMI8226细胞增殖及其对ERK 1 /2抑制剂AS703026敏感性的影响,软琼脂克隆形成实验检测细胞的克隆性生长能力.结果成功地构建了共表达SPROUTY2基因和报告GFP的高滴度慢病毒颗粒.LV-S-GFP实验组RPMI8226细胞中SPROUTY2的表达明显高于LV-GFP对照组,灰度值分别为（230.85±32.12）％和（140.35±36.62）％（P＜ 0.05）.过表达SPROUTY2基因对骨髓瘤细胞增殖具有抑制作用,并可以增强ERK1/2抑制剂AS703026对RPMI8226细胞的杀伤作用.过表达SPROUTY2基因可明显抑制RPMI8226细胞的克隆性生长.结论慢病毒载体系统可高效介导SPROUTY2基因在RPMI8226细胞中的表达,抑制骨髓瘤细胞增殖及克隆性生长,并能够提高其对ERK抑制剂的敏感性.

关键词：多发性骨髓瘤慢病毒载体 RPMI8226 SPROUTY2 细胞外调节蛋白激酶

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NF-κB信号通路在异基因骨髓移植并发肝静脉闭塞病中的作用分析

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国际输血及血液学杂志 2014年第3期37卷 210-215页

作者：吴进燕刘迷迷黄玉金化静徐开林曾令宇徐州医学院附属医院血液科徐州医学院移植免疫实验室江苏徐州221002

目的探讨核因子（NF）-κB信号通路在异基因骨髓移植（allo-BMT）后并发肝静脉闭塞病（H VOD）中的作用.方法选择50只8～10周龄雄性BALB/c（H-2Kd）小鼠作为研究对象.小鼠经致死剂量全身照射（TBI）预处理后,根据移植方案不同,将其分... 详细信息

目的探讨核因子（NF）-κB信号通路在异基因骨髓移植（allo-BMT）后并发肝静脉闭塞病（H VOD）中的作用.方法选择50只8～10周龄雄性BALB/c（H-2Kd）小鼠作为研究对象.小鼠经致死剂量全身照射（TBI）预处理后,根据移植方案不同,将其分为骨髓移植（BMT）组（n=20）和骨髓联合内皮祖细胞（EPC）移植组（EPC组）（n=20）;另设TBI对照组（n=5）和正常对照组（n=5）（实验过程中对动物的处置符合动物伦理学标准）.于移植后7d、15d和33 d,检测移植后受鼠肝功能及血清肿瘤坏死因子（TNF）-α及白细胞介素（IL）-6水平.受鼠肝脏组织经苏木精-伊红（HE）染色法及Masson染色法染色后,光镜下观察小鼠肝脏的病理改变.荧光定量聚合酶链反应及Western免疫印迹法（WB）法检测受鼠肝细胞内NF-κB信号通路的活化情况.结果 ①移植后,EPC组受鼠与BMT组相比,天冬氨酸转氨酶、丙氨酸转氨酶和总胆红素水平明显降低,两组比较,差异有统计学意义（P＜0.05）.②移植后第7天,EPC组受鼠TNF-α表达量为（138.73＆#177;10.42）pg/mL,显著高于BMT组的（95.31＆#177;19.09） pg/mL,两组相比,差异有统计学意义（t=6.907,P＜0.05）,而IL-6的表达量为（169.50＆#177;10.21） pg/mL,低于BMT组的（215.01＆#177;22.13）pg/mL,两组比较,差异有统计学意义（t=-6.372,P＜0.05）;第15天EPC组受鼠的IL-6水平升高至（201.49＆#177;14.97） pg/mL,明显高于BMT组的（151.51＆#177;26.43） pg/mL,两组比较,差异有统计学意义（t=5.51,P＜0.05）.③移植后第33天,EPC组受鼠转化生长因子（TGF）-β、CXCL2、CCL2和CCR2水平均较BMT组明显降低,两组上述各项指标比较,差异均有统计学意义（P＜0.05）.④移植后小鼠肝细胞内NF-κB信号通路相关分子IKKβ于移植后第15天达峰值.IKKβ的活化、IκBα的磷酸化及P65的活化水平与IKKβ的表达水平一致.结论 allo-BMT并发HVOD受鼠早期肝细胞内NF-κB信号通路的活化,可促进损伤肝细胞的修复,但在肝细胞修复后,NF-κB信号通路的持续活化可促进肝纤维化.

关键词：骨髓移植肝静脉闭塞病内皮祖细胞

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肝静脉闭塞病及其他疾病中肝细胞损伤机制的研究进展

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国际输血及血液学杂志 2014年第4期37卷 377-380页

作者：杨娜曾令宇徐州医学院移植免疫实验室 221002 徐州医学院附属医院血液科

肝脏是人体重要的解毒器官，当机体受到外界因素影响时，肝脏即发挥其解毒功能，当超出其解毒能力时，则可导致肝脏结构及功能损伤。肝静脉闭塞病（HVOD）是造血干细胞移植（HSCT）后常见并发症之一，移植预处理方案所致的肝窦内皮细胞... 详细信息

肝脏是人体重要的解毒器官，当机体受到外界因素影响时，肝脏即发挥其解毒功能，当超出其解毒能力时，则可导致肝脏结构及功能损伤。肝静脉闭塞病（HVOD）是造血干细胞移植（HSCT）后常见并发症之一，移植预处理方案所致的肝窦内皮细胞及肝细胞损伤是HVOD的始发因素，其中肝细胞损伤程度决定HVOD患者的肝功能恢复情况。另外，其他多种疾病，如药物性肝病、病毒性肝炎、爆发性肝炎等，也严重影响肝脏正常生理结构及功能。笔者主要从自由基的产生及脂质过氧化反应、线粒体损伤、炎性细胞浸润及炎性细胞因子的产生3个方面总结不同肝脏疾病中肝细胞损伤机制，为临床HVOD及其他疾病的肝细胞损伤的治疗和预防提供新的策略。

关键词：肝细胞损伤肝炎肝静脉闭塞性疾病

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肝窦内皮细胞与造血干细胞移植后肝静脉闭塞病的研究进展

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国际输血及血液学杂志 2014年第1期37卷 35-37页

作者：韩莉莉(综述) 曾令宇(审校) 徐州医学院移植免疫实验室徐州医学院附属医院血液科江苏徐州221002

肝静脉闭塞病（HV（）D）是造血干细胞移植（HSCT）后常见的严重并发症之一，部分HVOD患者预后极差，严重影响患者移植预后。肝窦内皮细胞（sEc）损伤是HVOD发生的始动因素，修复损伤的SEC已成为防治HVOD的研究热点之一。笔者将对SEC的... 详细信息

肝静脉闭塞病（HV（）D）是造血干细胞移植（HSCT）后常见的严重并发症之一，部分HVOD患者预后极差，严重影响患者移植预后。肝窦内皮细胞（sEc）损伤是HVOD发生的始动因素，修复损伤的SEC已成为防治HVOD的研究热点之一。笔者将对SEC的结构及生物学功能，以及其损伤在HVOD中的作用机理进行综述，并展望内皮祖细胞修复损伤的SEC在防治HVOD中的潜在价值。

关键词：肝静脉闭塞病造血干细胞移植肝窦内皮细胞内皮祖细胞

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肝小静脉闭塞病中肝细胞损伤的机制

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国际输血及血液学杂志 2014年第2期37卷 168-169页

作者：郭娜曾令宇徐州医学院移植免疫实验室徐州医学院附属医院血液科江苏徐州221002

造血干细胞移植（HSCT）预处理药物的应用,可造成个体全身内皮的广泛损伤,也是肝小静脉闭塞病（HVOD）发生的诱因.HVOD是HSCT术的常见并发症之一,以肝腺泡小叶中心区（Ⅲ区）肝窦内皮细胞和肝细胞损伤、炎症和纤维化导致的肝窦及肝小静... 详细信息

造血干细胞移植（HSCT）预处理药物的应用,可造成个体全身内皮的广泛损伤,也是肝小静脉闭塞病（HVOD）发生的诱因.HVOD是HSCT术的常见并发症之一,以肝腺泡小叶中心区（Ⅲ区）肝窦内皮细胞和肝细胞损伤、炎症和纤维化导致的肝窦及肝小静脉阻塞为主要特征.肝细胞作为肝脏的主要实质细胞,是肝脏正常功能活动的物质基础.肝细胞的炎症损伤、坏死所导致肝细胞正常功能受损,最终可引起一系列临床表现,从而影响移植患者的预后及生存率.现就HVOD中肝细胞受损机制的研究进展进行综述如下.

关键词：肝小静脉闭塞病肝细胞损伤

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