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第十二届中国实验动物科学年会

作者：朱光旭王金祥周芳李自安刘菊芬阮光萍白盈盈潘兴华 650032昆明成都军区昆明总医院细胞生物治疗中心干细胞与免疫细胞生物医药技术国家地方联合实验室云南省细胞治疗技术转化医学重点实验室 650032昆明成都军区昆明总医院细胞生物治疗中心干细胞与免疫细胞生物医药技术国家地方联合实验室云南省细胞治疗技术转化医学重点实验室 650032昆明昆明医科大学成都军区昆明总医院临床学院

目的体外培养骨髓脂肪祖细胞(BMAPs),比较其与骨髓间充质干细胞(BMSCs)在形态、表型特征、成脂肪分化能力以及脂肪分化相关基因表达方面的差别.方法确无菌取1～2月龄雄性SD大鼠的股骨和胫骨骨髓制作细胞悬液,EBM-2(含20％FBS、15μ g/... 详细信息

目的体外培养骨髓脂肪祖细胞(BMAPs),比较其与骨髓间充质干细胞(BMSCs)在形态、表型特征、成脂肪分化能力以及脂肪分化相关基因表达方面的差别.方法确无菌取1～2月龄雄性SD大鼠的股骨和胫骨骨髓制作细胞悬液,EBM-2(含20％FBS、15μ g/ml ECGs)培养基差速贴壁法培养第三次贴壁细胞,取3到5代细胞用于实验.流式细胞分析检测CD34、CD44、CD45以及CD90表达;STEMPRO(R) Adipogenesis Differentiation Kit检测细胞成脂肪分化能力;实时荧光定量聚合酶链式反应(real-time qPCR)检测过氧化物酶体增殖激活受体γ(Ppaγ),脂肪酸结合蛋白4(Fabp4),脂蛋白脂肪酶(Lpl),CCAAT/增强子结合蛋白a(Cebpa),葡萄糖转运蛋白4(Slc2a4)以及前脂肪细胞因子1 (pread1) mRNA表达.结果传代接种培养24h,BMSCs形态上呈宽大、扁平状,而BMAPs大部呈长三角状,接种48h后BMSCs排列更为有序,而BMAPs多交织成网状.BMAP表达CD34、CD44、CD45以及CD90,BMSC表达CD44以及CD90,未检测到CD34和CD45表达.诱导培养后第4天,BMAPs成脂率显著高于BMSCs组(P＜0.01),到第8天,BMAPs成脂率为(87.2±11.67)％),BMSCs组成脂率为(18.5±10.2)％,相差更为显著(P＜0.01).诱导分化后第4、8天,Cebpa、Fabp4、Lp1、Ppaγ和Slc2a4 mRNA在BMAPs表达均显著高于BMSCs(P＜0.01).结论本次实验获得养的1种具有干细胞的生物学特性,同时也高表达脂肪分化相关的特异性基因,可以高效均质性地分化为脂肪细胞的BMAPs.

关键词：骨髓脂肪祖细胞间充质干细胞脂肪细胞分化

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骨髓源性脂肪祖细胞培养及生物学特征研究

骨髓源性脂肪祖细胞培养及生物学特征研究

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第十二届中国实验动物科学年会（2016.南宁）

作者：朱光旭王金祥周芳李自安刘菊芬阮光萍白盈盈潘兴华成都军区昆明总医院细胞生物治疗中心干细胞与免疫细胞生物医药技术国家地方联合实验室云南省细胞治疗技术转化医学重点实验室昆明医科大学成都军区昆明总医院临床学院

目的体外培养骨髓脂肪祖细胞(BMAPs),比较其与骨髓间充质干细胞(BMSCs)在形态、表型特征、成脂肪分化能力以及脂肪分化相关基因表达方面的差别。方法确无菌取1～2月龄雄性SD大鼠的股骨和胫骨骨髓制作细胞悬液,EBM-2(含20%FBS、15μg/ml ... 详细信息

目的体外培养骨髓脂肪祖细胞(BMAPs),比较其与骨髓间充质干细胞(BMSCs)在形态、表型特征、成脂肪分化能力以及脂肪分化相关基因表达方面的差别。方法确无菌取1～2月龄雄性SD大鼠的股骨和胫骨骨髓制作细胞悬液,EBM-2(含20%FBS、15μg/ml ECGs)培养基差速贴壁法培养第三次贴壁细胞,取3到5代细胞用于实验。流式细胞分析检测CD34、CD44、CD45以及CD90表达;STEMPRO(?)Adipogenesis Differentiation Kit检测细胞成脂肪分化能力;实时荧光定量聚合酶链式反应(real-time qPCR)检测过氧化物酶体增殖激活受体γ(Ppaγ),脂肪酸结合蛋白4(Fabp4),脂蛋白脂肪酶(Lpl),CCAAT/增强子结合蛋白α(Cebpa),葡萄糖转运蛋白4(S1c2a4)以及前脂肪细胞因子1(pread1)mRNA表达。结果传代接种培养24h,BMSCs形态上呈宽大、扁平状,而BMAPs大部呈长三角状,接种48h后BMSCs排列更为有序,而BMAPs多交织成网状。BMAP表达CD34、CD44、CD45以及CD90,BMSC表达CD44以及CD90,未检测到CD34和CD45表达。诱导培养后第4天,BMAPs成脂率显著高于BMSCs组(P<0.01),到第8天,BMAPs成脂率为(87.2±11.67)%),BMSCs组成脂率为(18.5±10.2)%,相差更为显著(P<0.01)。诱导分化后第4、8天,Cebpa、Fabp4、Lp1、Ppaγ和Slc2a4 mRNA在BMAPs表达均显著高于BMSCs(P<0.01)。结论本次实验获得养的1种具有干细胞的生物学特性,同时也高表达脂肪分化相关的特异性基因,可以高效均质性地分化为脂肪细胞的BMAPs。

关键词：骨髓脂肪祖细胞间充质干细胞脂肪细胞分化

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人脐带间充质干细胞对胶质瘤细胞株U87上皮间质转化及皮下荷瘤能力的影响

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中华细胞与干细胞杂志（电子版） 2016年第6期6卷 369-375页

作者：刘高米洋和法莲陈慧芬陆容李自安何洁赵晶潘兴华成都军区昆明总医院细胞生物治疗中心干细胞与免疫细胞生物医药技术国家地方联合实验室云南省细胞治疗技术转化医学重点实验室昆明650032 昆明医科大学成都军区昆明总医院临床学院 650032 上海市儿童医院中医科 200062

目的研究人脐带间充质干细胞(hUCMSCs)体外模型中对胶质瘤细胞株U87荷瘤能力及其上皮间质转化(EMT)的影响及其可能机制。方法建立裸鼠皮下荷瘤模型,观察hUCMSCs与U87共培养组和U87单独荷瘤组皮下荷瘤能力的差别,免疫组化检测EMT相关基... 详细信息

目的研究人脐带间充质干细胞(hUCMSCs)体外模型中对胶质瘤细胞株U87荷瘤能力及其上皮间质转化(EMT)的影响及其可能机制。方法建立裸鼠皮下荷瘤模型,观察hUCMSCs与U87共培养组和U87单独荷瘤组皮下荷瘤能力的差别,免疫组化检测EMT相关基因组织表达水平,Western Blot检测EMT相关蛋白MMP2,MMP7,MMP9,E-cadherin(E-cad),N-cadherin(N-cad)和Vimentin(VIM)表达情况,q PCR检测EMT相关基因(mmp2,mmp7,mmp9,E-cad,N-cad和vimentin)转录水平。Transwell和Matrigel分别检测hUCMSCs对U87转移能力的影响,两组间比较拟采用独立样本t检验,多组间比较采用单因素方差分析。结果皮下荷瘤结果提示hUCMSCs与U87共培养组皮下荷瘤率高于U87单独荷瘤组,且肿瘤体积较大,RT-PCR结果提示:共培养组和单独培养组相比,E-cad水平下调,N-cad和VIM上调,且基质金属蛋白酶家族MMP2,MMP7,MMP9也有不同程度上调。Western blot结果提示:在蛋白水平共培养组和单独培养组相比,E-cad水平下调2.1倍,N-cad和VIM上调1.0倍,MMP9上调0.9倍;E-cad,N-cad,VIM以及MMP2变化结果与RT-PCR结果一致。免疫组化结果进一步验证hUCMSCs能促进U87表达Ki67,E-cad与N-cad低表达。Transwell和Matrigel实验结果提示hUCMSCs能够促进U87细胞的转移侵袭能力。结论 hUCMSCs能通过促进U87高表达EMT相关基因和增殖相关基因Ki67,从而促进胶质瘤细胞株U87皮下肿瘤形成并发生上皮间质转化,提示hUCMSCs临床应用中应该充分考略受试者是否是潜在胶质瘤患者。

关键词：脐带间质干细胞胶质瘤生物转化

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诊断系统性红斑狼疮新的疾病标志

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国际检验医学杂志 2016年第7期37卷 938-941页

作者：阮光萍姚翔普有明刘菊芬王金祥潘兴华解放军成都军区昆明总医院细胞生物治疗中心/干细胞与免疫细胞生物医药技术国家地方联合工程实验室/云南省细胞治疗技术转化医学重点实验室云南昆明650032 楚雄市人民医院检验科云南楚雄675000

系统性红斑狼疮（SLE）是一种慢性多因素炎症紊乱,由免疫系统变化引起,和基因、环境和激素相互作用引发的一种疾病。超过80%的患者有皮肤和黏膜受累,内部器官受累是病死率增加的一个主要原因。SLE的临床表现是它复杂的免疫病理的结果,... 详细信息

系统性红斑狼疮（SLE）是一种慢性多因素炎症紊乱,由免疫系统变化引起,和基因、环境和激素相互作用引发的一种疾病。超过80%的患者有皮肤和黏膜受累,内部器官受累是病死率增加的一个主要原因。SLE的临床表现是它复杂的免疫病理的结果,包括产生自身抗体和免疫复合物性血管炎,上皮细胞损伤导致的血管破坏和严重的内部器官功能紊乱。

关键词：系统性红斑狼疮肾受累疾病标志

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成体干细胞治疗老年退行性疾病的可行性研究

成体干细胞治疗老年退行性疾病的可行性研究

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第十五届中国西部实验动物管理与学术交流会

作者：潘兴华庞荣清阮光萍朱向情蔡学敏何洁赵晶刘高米洋 650032昆明成都军区昆明总医院细胞生物治疗中心干细胞与免疫细胞生物医药技术国家地方联合工程实验室云南省细胞治疗技术转化医学重点实验室云南省干细胞工程实验室昆明市干细胞与再生医学研究重点实验室

衰老或老年退行性变的原因是组织器官中的衰老死亡细胞更新不足而导致结构与功能减退.成体干细胞具有自我更新和参与、促进损伤修复作用,其生物学特点符合老年退行性疾病治疗要求,多种局部或系统性损伤模型治疗研究结果显示,不同来源的... 详细信息

衰老或老年退行性变的原因是组织器官中的衰老死亡细胞更新不足而导致结构与功能减退.成体干细胞具有自我更新和参与、促进损伤修复作用,其生物学特点符合老年退行性疾病治疗要求,多种局部或系统性损伤模型治疗研究结果显示,不同来源的成体干细胞可用于涉及创伤、缺血、中毒、免疫、衰老等导致的损伤性疾病,将在老年退行性疾病和延缓或逆转衰老治疗中发挥积极作用.

关键词：老年退行性疾病成体干细胞自我更新损伤修复

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脐带间充质干细胞治疗儿童造血干细胞移植后GVHD的疗效观察

脐带间充质干细胞治疗儿童造血干细胞移植后GVHD的疗效观察

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第十五届中国西部实验动物管理与学术交流会

作者：何洁赵晶庞荣清阮光萍蔡学敏朱向情潘兴华 650032 昆明成都军区昆明总医院细胞生物治疗中心干细胞与免疫细胞生物医药技术国家地方联合工程实验室云南省细胞治疗技术转化医学重点实验室云南省干细胞工程实验室昆明市干细胞与再生医学研究重点实验室

随着移植技术的进步,异基因造血干细胞移植(allogeneic hematopoietic stem cell transplantation,allo-HSCT)目前已成为治疗白血病的有效方法,移植后成功率增高,死亡率显著降低,但是与移植相关的并发症尤其是移植物抗宿主病(graft-vers... 详细信息

随着移植技术的进步,异基因造血干细胞移植(allogeneic hematopoietic stem cell transplantation,allo-HSCT)目前已成为治疗白血病的有效方法,移植后成功率增高,死亡率显著降低,但是与移植相关的并发症尤其是移植物抗宿主病(graft-versus-host disease,GVHD)的发生会严重影响患者的生存质量.目前,慢性GVHD(cGVHD)除了应用免疫抑制剂仍无有效应对方法.慢性GVHD的发病机制复杂,几乎影响到所有组织器官,临床表现多样化,其特征类似于自身免疫及其他免疫疾病,如：硬皮病、干燥综合征、免疫性血细胞减少症等.尽管不断有新药出现,为进一步提升患者的长期生存质量,寻求一种慢性移植物抗宿主病的治疗方法是临床亟待解决的问题.脐带间充质干细胞(Umbilical cord Mesenchymal Stem Cells,UC-MSC)免疫原性低,几乎可以影响免疫系统所有的细胞,具有免疫调节、免疫抑制作用,可有效的治疗GVDH.2006年5月Ringden等[3]的报道指出,骨髓间充质干细胞能有效控制常规免疫抑制疗法无效的严重急性GVHD,随后脐带MSC也用于治疗成人aGVHD.本项目组用脐带MSC治疗1例造血干细胞移植后发生GVHD的患儿,取得了较好的疗效,现总结如下.

关键词：造血干细胞移植慢性移植物抗宿主病脐带间充质干细胞治疗临床疗效

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人脐带间充质干细胞制剂创制的关键技术研究

人脐带间充质干细胞制剂创制的关键技术研究

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第十五届中国西部实验动物管理与学术交流会

脐带间充质干细胞(Human Umbilical cord mesenchymal stem cells,HUC-MSC)来源于新生儿脐带,具有自我复制和多向分化能力,在体内外特定环境诱导下,可分化为骨、软骨、肌肉、肝、内皮和心肌等功能细胞.与骨髓和脂肪来源的间充质干细胞(m... 详细信息

脐带间充质干细胞(Human Umbilical cord mesenchymal stem cells,HUC-MSC)来源于新生儿脐带,具有自我复制和多向分化能力,在体内外特定环境诱导下,可分化为骨、软骨、肌肉、肝、内皮和心肌等功能细胞.与骨髓和脂肪来源的间充质干细胞(mesenchymal stem cells,MSC)相比,HUC-MSC采集方便、来源充足、可规模化、标准化生产与储存,无伦理学争论,是最具有产业化和临床应用前景的干细胞之一.鉴于HUC-MSC的可塑性和免疫调节作用,在临床上可用于衰老、退变、损伤性疾病的治疗,例如肝肾损伤、脊髓损伤、退行性病变、移植物抗宿主病(GVHD)以及自身免疫性疾病等的治疗.本文对研制UC-MSC制剂的关键技术进行了概述.

关键词：脐带间充质干细胞制剂制备技术质量控制

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干细胞转染CMV-Luciferase-PGK-Puro慢病毒后化学发光成像

干细胞转染CMV-Luciferase-PGK-Puro慢病毒后化学发光成像

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第十五届中国西部实验动物管理与学术交流会

作者：阮光萍刘菊芬李自安王金祥吕燕波庞荣清潘兴华 650032昆明成都军区昆明总医院细胞生物治疗中心干细胞与免疫细胞生物医药技术国家地方联合工程实验室云南省细胞治疗技术转化医学重点实验室云南省干细胞工程实验室昆明市干细胞与再生医学研究重点实验室

目的：树鼩脐带间充质干细胞转染CMV-Luciferase-PGK-Puro慢病毒后是否成功通常用小动物活体成像仪观察,但活体成像仪价格昂贵,尝试用化学发光成像的方法观察. 方法：用CMV-Luciferase-PGK-Puro慢病毒转染树鼩脐带间充质干细胞,用最... 详细信息

目的：树鼩脐带间充质干细胞转染CMV-Luciferase-PGK-Puro慢病毒后是否成功通常用小动物活体成像仪观察,但活体成像仪价格昂贵,尝试用化学发光成像的方法观察. 方法：用CMV-Luciferase-PGK-Puro慢病毒转染树鼩脐带间充质干细胞,用最适浓度的嘌呤霉素筛选,存活的细胞用6孔板的3个孔培养,贴壁后,3个孔依次加入底物D-荧光素钾盐,用化学发光成像仪拍照,再用软件进行活体成像转换.将转染成功的细胞注入麻醉后的树鼩皮下,树鼩静脉注射底物. 结果：细胞加入底物后有生物发光,发光强度随底物作用时间延长而减弱.树鼩皮下也观察到发光细胞. 结论：C MV-Luciferase-PGK-Puro慢病毒能成功转染树鼩脐带间充质干细胞,转染成功的细胞用于动物模型治疗后,可进行活体成像,观察细胞在动物体内的分布.

关键词：动物模型脐带间充质干细胞慢病毒转染化学发光成像

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人脐带间充质干细胞体外规模化、标准化制备技术研究

人脐带间充质干细胞体外规模化、标准化制备技术研究

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第十二届中国实验动物科学年会

作者：赵晶何洁王金祥蔡学敏庞荣清潘兴华 650032昆明成都军区昆明总医院细胞生物治疗中心干细胞与免疫细胞生物医药技术国家地方联合工程实验室云南省细胞治疗技术转化医学重点实验室云南省干细胞工程实验室昆明市干细胞与再生医学研究重点实验室

目的建立人脐带间充质干细胞标准化、规模化制备技术。方法在无菌条件下,采集剖腹产婴儿脐带30条,长40～50CM,弃被膜、血管后,剪成1mm3的组织块,置于含10％胎牛血清的DMEM/F 12在培养瓶中进行组织块反复贴壁培养,采用倒置相差显微镜... 详细信息

目的建立人脐带间充质干细胞标准化、规模化制备技术。方法在无菌条件下,采集剖腹产婴儿脐带30条,长40～50CM,弃被膜、血管后,剪成1mm3的组织块,置于含10％胎牛血清的DMEM/F 12在培养瓶中进行组织块反复贴壁培养,采用倒置相差显微镜动态观察细胞的生长及形态,对传代培养的第3代细胞采用流式细胞分析法进行细胞周期及表形分析,采用体外定向诱导分化实验观察多向分化潜能。结果组织块贴壁后于第4天开始向周围呈放射状长出细胞,平均12天左右长满瓶底,细胞形态呈均一梭形;传代培养后生长快速,于4～5天达80％融合,连续传代3次,其生长特性和形态不变,CD90、CD29阳性率大于99％,CD105阳性率大于81％,不表达CD34,CD45,在体外能分化成骨,软骨,脂肪细胞。平均每条脐带获得细胞量大于6×109个。结论通过多条人脐带重复分离培养,建立了体外规模化、标准化制备人脐带间充质干细胞的制备与鉴定技术规范及标准,可为人脐带间充质干细胞库建设和临床应用提供技术支持和标准化脐带间充质干细胞。

关键词：脐带间充质干细胞制备鉴定,技术规范

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人脐带间充质干细胞的标准化制备与鉴定

人脐带间充质干细胞的标准化制备与鉴定

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第十五届中国西部实验动物管理与学术交流会

目的：针对临床治疗需要,标准化体外脐带间充质干细胞培养的技术方法. 方法：规范了脐带组织块贴壁法的标准化技术操作,材料的选取,取无菌条件下的剖腹产婴儿脐带,剪成1mm3的组织块,加入含10％胎牛血清的DMEM/F12在培养瓶中培养分离... 详细信息

目的：针对临床治疗需要,标准化体外脐带间充质干细胞培养的技术方法. 方法：规范了脐带组织块贴壁法的标准化技术操作,材料的选取,取无菌条件下的剖腹产婴儿脐带,剪成1mm3的组织块,加入含10％胎牛血清的DMEM/F12在培养瓶中培养分离间充质干细胞,利用倒置相差显微镜观察细胞的生长形态,运用流式细胞仪检测细胞周期及免疫抗原表达,并检测体外多向分化潜能. 结果：脐带组织块贴壁法生长的细胞形态均一,成纤维样的梭形细胞,这些细胞表达CD90,CD105,CD29,不表达CD34,CD45,并在体外成功诱导分化成骨,软骨,脂肪细胞. 结论：在长期重复运用脐带组织块贴壁法可成功从人脐带中分离出间充质干细胞,其生物学特性与骨髓间充质干细胞相似.

关键词：脐带间充质干细胞体外培养质量鉴定标准化体系

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