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干细胞转染CMV-Luciferase-PGK-Puro慢病毒后化学发光成像

西南国防医药 2016年第12期26卷 1378-1381页

作者：阮光萍刘菊芬李自安王金祥吕燕波庞荣清潘兴华成都军区昆明总医院细胞生物治疗中心、干细胞与免疫细胞生物医药技术国家地方联合工程实验室、云南省细胞治疗技术转化医学重点实验室、云南省干细胞工程实验室、昆明市干细胞与再生医学研究重点实验室昆明650032

目的研究用化学发光成像的方法观察脐带间充质干细胞转染CMV-Luciferase-PGK-Puro慢病毒后的情况,代替活体成像仪的可行性。方法用CMV-Luciferase-PGK-Puro慢病毒转染树鼩脐带间充质干细胞,用最适浓度的嘌呤霉素筛选,存活的细胞用6孔板... 详细信息

目的研究用化学发光成像的方法观察脐带间充质干细胞转染CMV-Luciferase-PGK-Puro慢病毒后的情况,代替活体成像仪的可行性。方法用CMV-Luciferase-PGK-Puro慢病毒转染树鼩脐带间充质干细胞,用最适浓度的嘌呤霉素筛选,存活的细胞用6孔板的3个孔培养,贴壁后,3个孔依次加入底物D-荧光素钾盐,用化学发光成像仪拍照,再用软件进行活体成像转换。将转染成功的细胞注入麻醉后的树鼩皮下,树鼩静脉注射底物。结果细胞加入底物后有生物发光,发光强度随底物作用时间延长而减弱。树鼩皮下也观察到发光细胞。结论 CMV-Luciferase-PGK-Puro慢病毒能成功转染树鼩脐带间充质干细胞,转染成功的细胞用于动物模型治疗后,可进行活体成像,观察细胞在动物体内的分布。

关键词：树鼩脐带间充质干细胞 CMV-Luciferase—PGK-Puro慢病毒转染化学发光成像

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DC-CTL免疫细胞对4种恶性肿瘤治疗疗效观察

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西南国防医药 2016年第12期26卷 1371-1374页

作者：蔡学敏朱向情沈丽蓉赵晶何洁庞荣清潘兴华成都军区昆明总医院细胞生物治疗中心、干细胞与免疫细胞生物医药技术国家地方联合工程实验室、云南省细胞治疗技术转化医学重点实验室、云南省干细胞工程实验室、昆明市干细胞与再生医学研究重点实验室昆明650032

目的初步观察自体DC-CTL免疫细胞回输对4种恶性肿瘤治疗的临床疗效。方法 50例肿瘤患者分为4组,乳腺癌组12例,肺癌组27例,结直肠癌组8例,卵巢癌组3例。分离患者外周血单个核细胞(PBMC),分别诱导培养细胞毒T淋巴细胞(CTL)、树突状细胞(D... 详细信息

目的初步观察自体DC-CTL免疫细胞回输对4种恶性肿瘤治疗的临床疗效。方法 50例肿瘤患者分为4组,乳腺癌组12例,肺癌组27例,结直肠癌组8例,卵巢癌组3例。分离患者外周血单个核细胞(PBMC),分别诱导培养细胞毒T淋巴细胞(CTL)、树突状细胞(DC),诱导培养细胞达足够数量后回输给患者。分别在治疗前后采用流式细胞术检测患者外周血淋巴细胞CD3+、CD4+、CD8+、CD4+/CD8+和肿瘤标志物的变化,采用主观问卷调查对卡氏行为能力(KPS)进行评分,并对治疗疗效进行评价。结果治疗1个月后,总有效率达82.0%,且未见明显副作用。治疗后1 w,各组外周血CD3、CD4、CD8均显著升高(P<0.05),而CD4+/CD8+无显著变化;各组外周血NK、CIK和KPS评分均显著升高(P<0.05),而CEA、FRP、CA19,CA153均较治疗前明显下降(P<0.05)。结论自体免疫细胞治疗对改善恶性肿瘤患者生活质量,提高患者的免疫功能有明显作用,且安全性好,为恶性肿瘤的治疗提供了一个新的方向。

关键词：树突状细胞细胞毒T细胞免疫细胞治疗疗效

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大剂量人脐带间充质干细胞制剂给予CD-1小鼠的安全性评价

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西南国防医药 2016年第12期26卷 1362-1365页

作者：何洁赵晶王金祥蔡学敏朱向情马丽花庞荣清潘兴华成都军区昆明总医院细胞生物治疗中心、干细胞与免疫细胞生物医药技术国家地方联合工程实验室、云南省细胞治疗技术转化医学重点实验室、云南省干细胞工程实验室、昆明市干细胞与再生医学研究重点实验室昆明650032

目的观察单次大剂量输入自制的人脐带间充质干细胞(h UC-MSCs)制剂的急性反应,为临床研究提供安全保障。方法 60只SPF级CD-1小鼠随机分为阴性对照组、溶剂对照组和制剂组,每组雌雄各半(n=10),制剂组按1×108个细胞/kg的剂量给CD-1... 详细信息

目的观察单次大剂量输入自制的人脐带间充质干细胞(h UC-MSCs)制剂的急性反应,为临床研究提供安全保障。方法 60只SPF级CD-1小鼠随机分为阴性对照组、溶剂对照组和制剂组,每组雌雄各半(n=10),制剂组按1×108个细胞/kg的剂量给CD-1小鼠单次静脉注射h UC-MSCs制剂,阴性对照组和溶剂对照组分别输注同等容量的0.9%氯化钠注射液和勃脉力A溶液。输注后连续观察小鼠的临床表现、体重和摄食量。观察15 d后,将动物安乐死,进行大体解剖,观察并行组织病理学分析。结果实验期间,制剂组1只小鼠输注细胞的尾尖静脉处出现细胞堆积,引起局部毛细血管堵塞,从而导致尾尖部组织坏死。其余动物均未见异常表现和体重、食量差异,大体解剖和组织学观察未见明显与输注细胞相关的病理改变。结论 h UCMSCs制剂单次静脉注射给予CD-1小鼠无急性毒性反应。

关键词：脐带间充质干细胞急性毒性实验 CD.1小鼠

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冻存脐带间充质干细胞的临床前制备

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西南国防医药 2016年第12期26卷 1365-1369页

作者：何洁赵晶王金祥蔡学敏庞荣清潘兴华成都军区昆明总医院细胞生物治疗中心、干细胞与免疫细胞生物医药技术国家地方联合工程实验室、云南省细胞治疗技术转化医学重点实验室、云南省干细胞工程实验室、昆明市干细胞与再生医学研究重点实验室昆明650032

目的将冻存的人脐带间充质干细胞(UC-MSCs)制备成一种复苏后可直接用于临床的制剂,并进行质量检定。方法从种子细胞库复苏冻存的UC-MSCs,待细胞培养至P3代时,收集UC-MSCs,按照4×107/剂的规格加入含5%人血白蛋白、10%DMSO、85%复方... 详细信息

目的将冻存的人脐带间充质干细胞(UC-MSCs)制备成一种复苏后可直接用于临床的制剂,并进行质量检定。方法从种子细胞库复苏冻存的UC-MSCs,待细胞培养至P3代时,收集UC-MSCs,按照4×107/剂的规格加入含5%人血白蛋白、10%DMSO、85%复方电解质溶液的细胞保护液,形成制剂,并对其进行质量检定,包括无菌检测、支原体检测、细胞内外源致病因子检测、内毒素检测、免疫表型检测、稳定性检测、异常免疫学反应检测以及残留物检测。结果制备的UC-MSCs制剂无菌、无支原体污染,无内外致病因子,毒素<2 EU,能抑制异源淋巴细胞的增殖,抑制率随脐带间充质干细胞数量增加而增大。牛血清残留<50 ng/袋,制剂冻存前细胞活性>90%,复苏后活性>85%。结论按照此方法制备的UC-MSCs制剂符合临床治疗要求的质量检定标准。

关键词：脐带间充质干细胞制剂制备质量检定

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脐带间充质干细胞治疗儿童造血干细胞移植后GVHD的疗效观察

脐带间充质干细胞治疗儿童造血干细胞移植后GVHD的疗效观察

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第十五届中国西部实验动物管理与学术交流会

作者：何洁赵晶庞荣清阮光萍蔡学敏朱向情潘兴华 650032 昆明成都军区昆明总医院细胞生物治疗中心干细胞与免疫细胞生物医药技术国家地方联合工程实验室云南省细胞治疗技术转化医学重点实验室云南省干细胞工程实验室昆明市干细胞与再生医学研究重点实验室

随着移植技术的进步,异基因造血干细胞移植(allogeneic hematopoietic stem cell transplantation,allo-HSCT)目前已成为治疗白血病的有效方法,移植后成功率增高,死亡率显著降低,但是与移植相关的并发症尤其是移植物抗宿主病(graft-vers... 详细信息

随着移植技术的进步,异基因造血干细胞移植(allogeneic hematopoietic stem cell transplantation,allo-HSCT)目前已成为治疗白血病的有效方法,移植后成功率增高,死亡率显著降低,但是与移植相关的并发症尤其是移植物抗宿主病(graft-versus-host disease,GVHD)的发生会严重影响患者的生存质量.目前,慢性GVHD(cGVHD)除了应用免疫抑制剂仍无有效应对方法.慢性GVHD的发病机制复杂,几乎影响到所有组织器官,临床表现多样化,其特征类似于自身免疫及其他免疫疾病,如：硬皮病、干燥综合征、免疫性血细胞减少症等.尽管不断有新药出现,为进一步提升患者的长期生存质量,寻求一种慢性移植物抗宿主病的治疗方法是临床亟待解决的问题.脐带间充质干细胞(Umbilical cord Mesenchymal Stem Cells,UC-MSC)免疫原性低,几乎可以影响免疫系统所有的细胞,具有免疫调节、免疫抑制作用,可有效的治疗GVDH.2006年5月Ringden等[3]的报道指出,骨髓间充质干细胞能有效控制常规免疫抑制疗法无效的严重急性GVHD,随后脐带MSC也用于治疗成人aGVHD.本项目组用脐带MSC治疗1例造血干细胞移植后发生GVHD的患儿,取得了较好的疗效,现总结如下.

关键词：造血干细胞移植慢性移植物抗宿主病脐带间充质干细胞治疗临床疗效

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成体干细胞治疗老年退行性疾病的可行性研究

成体干细胞治疗老年退行性疾病的可行性研究

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第十五届中国西部实验动物管理与学术交流会

作者：潘兴华庞荣清阮光萍朱向情蔡学敏何洁赵晶刘高米洋 650032昆明成都军区昆明总医院细胞生物治疗中心干细胞与免疫细胞生物医药技术国家地方联合工程实验室云南省细胞治疗技术转化医学重点实验室云南省干细胞工程实验室昆明市干细胞与再生医学研究重点实验室

衰老或老年退行性变的原因是组织器官中的衰老死亡细胞更新不足而导致结构与功能减退.成体干细胞具有自我更新和参与、促进损伤修复作用,其生物学特点符合老年退行性疾病治疗要求,多种局部或系统性损伤模型治疗研究结果显示,不同来源的... 详细信息

衰老或老年退行性变的原因是组织器官中的衰老死亡细胞更新不足而导致结构与功能减退.成体干细胞具有自我更新和参与、促进损伤修复作用,其生物学特点符合老年退行性疾病治疗要求,多种局部或系统性损伤模型治疗研究结果显示,不同来源的成体干细胞可用于涉及创伤、缺血、中毒、免疫、衰老等导致的损伤性疾病,将在老年退行性疾病和延缓或逆转衰老治疗中发挥积极作用.

关键词：老年退行性疾病成体干细胞自我更新损伤修复

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人脐带间充质干细胞制剂创制的关键技术研究

人脐带间充质干细胞制剂创制的关键技术研究

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第十五届中国西部实验动物管理与学术交流会

脐带间充质干细胞(Human Umbilical cord mesenchymal stem cells,HUC-MSC)来源于新生儿脐带,具有自我复制和多向分化能力,在体内外特定环境诱导下,可分化为骨、软骨、肌肉、肝、内皮和心肌等功能细胞.与骨髓和脂肪来源的间充质干细胞(m... 详细信息

脐带间充质干细胞(Human Umbilical cord mesenchymal stem cells,HUC-MSC)来源于新生儿脐带,具有自我复制和多向分化能力,在体内外特定环境诱导下,可分化为骨、软骨、肌肉、肝、内皮和心肌等功能细胞.与骨髓和脂肪来源的间充质干细胞(mesenchymal stem cells,MSC)相比,HUC-MSC采集方便、来源充足、可规模化、标准化生产与储存,无伦理学争论,是最具有产业化和临床应用前景的干细胞之一.鉴于HUC-MSC的可塑性和免疫调节作用,在临床上可用于衰老、退变、损伤性疾病的治疗,例如肝肾损伤、脊髓损伤、退行性病变、移植物抗宿主病(GVHD)以及自身免疫性疾病等的治疗.本文对研制UC-MSC制剂的关键技术进行了概述.

关键词：脐带间充质干细胞制剂制备技术质量控制

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干细胞转染CMV-Luciferase-PGK-Puro慢病毒后化学发光成像

干细胞转染CMV-Luciferase-PGK-Puro慢病毒后化学发光成像

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第十五届中国西部实验动物管理与学术交流会

作者：阮光萍刘菊芬李自安王金祥吕燕波庞荣清潘兴华 650032昆明成都军区昆明总医院细胞生物治疗中心干细胞与免疫细胞生物医药技术国家地方联合工程实验室云南省细胞治疗技术转化医学重点实验室云南省干细胞工程实验室昆明市干细胞与再生医学研究重点实验室

目的：树鼩脐带间充质干细胞转染CMV-Luciferase-PGK-Puro慢病毒后是否成功通常用小动物活体成像仪观察,但活体成像仪价格昂贵,尝试用化学发光成像的方法观察. 方法：用CMV-Luciferase-PGK-Puro慢病毒转染树鼩脐带间充质干细胞,用最... 详细信息

目的：树鼩脐带间充质干细胞转染CMV-Luciferase-PGK-Puro慢病毒后是否成功通常用小动物活体成像仪观察,但活体成像仪价格昂贵,尝试用化学发光成像的方法观察. 方法：用CMV-Luciferase-PGK-Puro慢病毒转染树鼩脐带间充质干细胞,用最适浓度的嘌呤霉素筛选,存活的细胞用6孔板的3个孔培养,贴壁后,3个孔依次加入底物D-荧光素钾盐,用化学发光成像仪拍照,再用软件进行活体成像转换.将转染成功的细胞注入麻醉后的树鼩皮下,树鼩静脉注射底物. 结果：细胞加入底物后有生物发光,发光强度随底物作用时间延长而减弱.树鼩皮下也观察到发光细胞. 结论：C MV-Luciferase-PGK-Puro慢病毒能成功转染树鼩脐带间充质干细胞,转染成功的细胞用于动物模型治疗后,可进行活体成像,观察细胞在动物体内的分布.

关键词：动物模型脐带间充质干细胞慢病毒转染化学发光成像

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人脐带间充质干细胞的标准化制备与鉴定

人脐带间充质干细胞的标准化制备与鉴定

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第十五届中国西部实验动物管理与学术交流会

作者：赵晶何洁王金祥蔡学敏庞荣清潘兴华 650032昆明成都军区昆明总医院细胞生物治疗中心干细胞与免疫细胞生物医药技术国家地方联合工程实验室云南省细胞治疗技术转化医学重点实验室云南省干细胞工程实验室昆明市干细胞与再生医学研究重点实验室

目的：针对临床治疗需要,标准化体外脐带间充质干细胞培养的技术方法. 方法：规范了脐带组织块贴壁法的标准化技术操作,材料的选取,取无菌条件下的剖腹产婴儿脐带,剪成1mm3的组织块,加入含10％胎牛血清的DMEM/F12在培养瓶中培养分离... 详细信息

目的：针对临床治疗需要,标准化体外脐带间充质干细胞培养的技术方法. 方法：规范了脐带组织块贴壁法的标准化技术操作,材料的选取,取无菌条件下的剖腹产婴儿脐带,剪成1mm3的组织块,加入含10％胎牛血清的DMEM/F12在培养瓶中培养分离间充质干细胞,利用倒置相差显微镜观察细胞的生长形态,运用流式细胞仪检测细胞周期及免疫抗原表达,并检测体外多向分化潜能. 结果：脐带组织块贴壁法生长的细胞形态均一,成纤维样的梭形细胞,这些细胞表达CD90,CD105,CD29,不表达CD34,CD45,并在体外成功诱导分化成骨,软骨,脂肪细胞. 结论：在长期重复运用脐带组织块贴壁法可成功从人脐带中分离出间充质干细胞,其生物学特性与骨髓间充质干细胞相似.

关键词：脐带间充质干细胞体外培养质量鉴定标准化体系

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人脐带间充质干细胞体外规模化、标准化制备技术研究

人脐带间充质干细胞体外规模化、标准化制备技术研究

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第十二届中国实验动物科学年会

目的建立人脐带间充质干细胞标准化、规模化制备技术。方法在无菌条件下,采集剖腹产婴儿脐带30条,长40～50CM,弃被膜、血管后,剪成1mm3的组织块,置于含10％胎牛血清的DMEM/F 12在培养瓶中进行组织块反复贴壁培养,采用倒置相差显微镜... 详细信息

目的建立人脐带间充质干细胞标准化、规模化制备技术。方法在无菌条件下,采集剖腹产婴儿脐带30条,长40～50CM,弃被膜、血管后,剪成1mm3的组织块,置于含10％胎牛血清的DMEM/F 12在培养瓶中进行组织块反复贴壁培养,采用倒置相差显微镜动态观察细胞的生长及形态,对传代培养的第3代细胞采用流式细胞分析法进行细胞周期及表形分析,采用体外定向诱导分化实验观察多向分化潜能。结果组织块贴壁后于第4天开始向周围呈放射状长出细胞,平均12天左右长满瓶底,细胞形态呈均一梭形;传代培养后生长快速,于4～5天达80％融合,连续传代3次,其生长特性和形态不变,CD90、CD29阳性率大于99％,CD105阳性率大于81％,不表达CD34,CD45,在体外能分化成骨,软骨,脂肪细胞。平均每条脐带获得细胞量大于6×109个。结论通过多条人脐带重复分离培养,建立了体外规模化、标准化制备人脐带间充质干细胞的制备与鉴定技术规范及标准,可为人脐带间充质干细胞库建设和临床应用提供技术支持和标准化脐带间充质干细胞。

关键词：脐带间充质干细胞制备鉴定,技术规范

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