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第十五届中国西部实验动物管理与学术交流会

作者：蔡学敏朱向情沈丽蓉赵晶何洁庞荣清潘兴华 650032昆明成都军区昆明总医院细胞生物治疗中心干细胞与免疫细胞生物医药技术国家地方联合工程实验室云南省细胞治疗技术转化医学重点实验室云南省干细胞工程实验室昆明市干细胞与再生医学研究重点实验室

目的：初步观察自体DC-CTL免疫细胞回输对四种恶性肿瘤治疗的临床疗效. 方法：50例肿瘤患者分为4组,乳腺癌组12例,肺癌组27例,结直肠癌组8例,卵巢癌组3例.分离患者外周血单个核细胞(PBMC),分别诱导培养细胞毒T淋巴细胞(CTL)、树突状... 详细信息

目的：初步观察自体DC-CTL免疫细胞回输对四种恶性肿瘤治疗的临床疗效. 方法：50例肿瘤患者分为4组,乳腺癌组12例,肺癌组27例,结直肠癌组8例,卵巢癌组3例.分离患者外周血单个核细胞(PBMC),分别诱导培养细胞毒T淋巴细胞(CTL)、树突状细胞(DC),诱导10天后,流式细胞术检测治疗前后患者外周血淋巴细胞CD3+、CD4+、CD8+、CD19+、CD16+CD56+细胞的比例和数量并进行分析;分别在治疗前后进行CT和肿瘤标志物检查,并采用主观问卷调查对卡氏行为能力(KPS)进行评分,对治疗疗效进行评价. 结果：免疫细胞治疗总有效率达86.0％,治疗后患者生活质量均有改善,治疗后卡氏评分显著高于治疗前(P＜0.05);治疗后患者的免疫细胞比例自然杀伤细胞(NK)为17.4％、细胞因子激活的杀伤细胞(CIK)为11.9％,显著高于治疗前7.8％和3.8％(P＜0.05);肿瘤标志物CEA、FER、CA199、CA153较治疗前有明显下降(P＜0.05). 结论：自体免疫细胞治疗对改善癌症患者生活质量,提高患者的免疫功能有明显作用,为肿瘤患者的治疗提供了一个新的方向.

关键词：恶性肿瘤树突状细胞细胞毒T淋巴细胞免疫治疗临床疗效

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人脐带间充质干细胞体外规模化、标准化制备技术研究

人脐带间充质干细胞体外规模化、标准化制备技术研究

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第十二届中国实验动物科学年会（2016.南宁）

作者：赵晶何洁王金祥蔡学敏庞荣清潘兴华成都军区昆明总医院细胞生物治疗中心干细胞与免疫细胞生物医药技术国家地方联合工程实验室云南省细胞治疗技术转化医学重点实验室云南省干细胞工程实验室昆明市干细胞与再生医学研究重点实验室

目的建立人脐带间充质干细胞标准化、规模化制备技术。方法在无菌条件下,采集剖腹产婴儿脐带30条,长40～50CM,弃被膜、血管后,剪成1mm的组织块,置于含10%胎牛血清的DMEM/F12在培养瓶中进行组织块反复贴壁培养,采用倒置相差显微镜动态观... 详细信息

目的建立人脐带间充质干细胞标准化、规模化制备技术。方法在无菌条件下,采集剖腹产婴儿脐带30条,长40～50CM,弃被膜、血管后,剪成1mm的组织块,置于含10%胎牛血清的DMEM/F12在培养瓶中进行组织块反复贴壁培养,采用倒置相差显微镜动态观察细胞的生长及形态,对传代培养的第3代细胞采用流式细胞分析法进行细胞周期及表形分析,采用体外定向诱导分化实验观察多向分化潜能。结果组织块贴壁后于第4天开始向周围呈放射状长出细胞,平均12天左右长满瓶底,细胞形态呈均一梭形;传代培养后生长快速,于4～5天达80%融合,连续传代3次,其生长特性和形态不变,CD90、CD29阳性率大于99%,CD105阳性率大于81%,不表达CD34,CD45,在体外能分化成骨,软骨,脂肪细胞。平均每条脐带获得细胞量大于6×10～9个。结论通过多条人脐带重复分离培养,建立了体外规模化、标准化制备人脐带间充质干细胞的制备与鉴定技术规范及标准,可为人脐带间充质干细胞库建设和临床应用提供技术支持和标准化脐带间充质干细胞。

关键词：脐带间充质干细胞制备鉴定技术规范

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骨髓单个核细胞体外培养诱导分化为脂肪细胞

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西南国防医药 2016年第12期26卷 1382-1385页

作者：周芳王金祥李自安刘菊芬白盈盈杨建勇朱光旭潘兴华成都军区昆明总医院细胞生物治疗中心、干细胞与免疫细胞生物医药技术国家地方联合实验室、云南省细胞治疗技术转化医学重点实验室昆明650032 昆明医科大学成都军区昆明总医院临床学院

目的体外培养骨髓单个核细胞（BMNCs），并观察其成脂肪细胞分化能力。方法无菌取SD大鼠骨髓制作细胞悬液，差速贴壁法培养第三次贴壁细胞，传代扩增，取3-5代细胞用于实验。流式细胞分析检测CD34、CD44、CD45、CD90、CD144（VE—cadhe... 详细信息

目的体外培养骨髓单个核细胞（BMNCs），并观察其成脂肪细胞分化能力。方法无菌取SD大鼠骨髓制作细胞悬液，差速贴壁法培养第三次贴壁细胞，传代扩增，取3-5代细胞用于实验。流式细胞分析检测CD34、CD44、CD45、CD90、CD144（VE—cadherin）和血管内皮细胞生长因子受体．2（KDR）表达；STEMPRO Adipogenesis Differentiation Kit检测细胞成脂肪分化能力。结果通过差速贴壁法可获得相对单一的BMNCs，流式细胞分析表明培养的BMNCs细胞表达CD34、CD44、CD45及CD90等表面标志，但不表达CDl44和KDR；在未经诱导的情况下，培养的BMNCs能自发分化为脂肪细胞；培养BMNCs成脂肪细胞诱导后在第3、5、7d，成脂率分别为（22．4±3．8）％、（55．6±11．4）％以及（82．4±17．7）％，显著高于诱导培养第1d[（1．3±1．1）％，P〈0．011。结论骨髓单个核细胞体外培养后可以诱导分化为脂肪细胞。

关键词：骨髓单个核细胞间充质干细胞脂肪细胞分化

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骨髓单个核细胞体外培养诱导分化为脂肪细胞

骨髓单个核细胞体外培养诱导分化为脂肪细胞

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第十五届中国西部实验动物管理与学术交流会

作者：周芳王金祥李自安刘菊芬白盈盈杨建勇朱光旭潘兴华 650032昆明成都军区昆明总医院细胞生物治疗中心干细胞与免疫细胞生物医药技术国家地方联合实验室云南省细胞治疗技术转化医学重点实验室 650032昆明昆明医科大学成都军区昆明总医院临床学院 650032昆明成都军区昆明总医院细胞生物治疗中心干细胞与免疫细胞生物医药技术国家地方联合实验室云南省细胞治疗技术转化医学重点实验室

目的：体外培养骨髓单个核细胞(BMNCs),并观察其成脂肪细胞分化能力. 方法：脱臼处死1～2月龄雄性SD大鼠,无菌取股骨和胫骨骨髓制作细胞悬液,EBM-2(含20％FBS、15μg/ml ECGs)培养基差速贴壁法培养第三次贴壁细胞,传代扩增,3到5代细... 详细信息

目的：体外培养骨髓单个核细胞(BMNCs),并观察其成脂肪细胞分化能力. 方法：脱臼处死1～2月龄雄性SD大鼠,无菌取股骨和胫骨骨髓制作细胞悬液,EBM-2(含20％FBS、15μg/ml ECGs)培养基差速贴壁法培养第三次贴壁细胞,传代扩增,3到5代细胞用于实验.流式细胞分析检测CD34、CD44、CD45、CD90、CD144(VE-cadherin)和血管内皮细胞生长因子受体-2(KDR)表达;STEMPRO Adipogenesis Differentiation Kit检测细胞成脂肪分化能力. 结果：通过差速贴壁法可以有效去除淋巴细胞、红细胞、骨髓间充质干细胞(BMSCs)等细胞而获得相对单一的骨髓单个核细胞(BMNCs),流式细胞分析表明培养的BMNCs细胞表达CD34、CD44、CD45以及CD90等表面标志,但是几乎不表达CD144和KDR;在未经诱导的情况下,培养的BMNCs也可能自发分化为脂肪细胞;培养BMNCs具有极强的脂肪细胞分化能力,成脂肪细胞诱导后在第3、5、7天,BMNCs成脂率分别为(22.4±3.8)％、(55.6±11.4)％以及(82.4±17.7)％,显著高于诱导培养第1天((1.3±1.1)％,P＜0.01). 结论：骨髓单个核细胞体外培养后可以诱导分化为脂肪细胞.

关键词：骨髓单个核细胞体外培养脂肪细胞定向分化

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诊断系统性红斑狼疮新的疾病标志

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国际检验医学杂志 2016年第7期37卷 938-941页

作者：阮光萍姚翔普有明刘菊芬王金祥潘兴华解放军成都军区昆明总医院细胞生物治疗中心/干细胞与免疫细胞生物医药技术国家地方联合工程实验室/云南省细胞治疗技术转化医学重点实验室云南昆明650032 楚雄市人民医院检验科云南楚雄675000

系统性红斑狼疮（SLE）是一种慢性多因素炎症紊乱,由免疫系统变化引起,和基因、环境和激素相互作用引发的一种疾病。超过80%的患者有皮肤和黏膜受累,内部器官受累是病死率增加的一个主要原因。SLE的临床表现是它复杂的免疫病理的结果,... 详细信息

系统性红斑狼疮（SLE）是一种慢性多因素炎症紊乱,由免疫系统变化引起,和基因、环境和激素相互作用引发的一种疾病。超过80%的患者有皮肤和黏膜受累,内部器官受累是病死率增加的一个主要原因。SLE的临床表现是它复杂的免疫病理的结果,包括产生自身抗体和免疫复合物性血管炎,上皮细胞损伤导致的血管破坏和严重的内部器官功能紊乱。

关键词：系统性红斑狼疮肾受累疾病标志

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骨髓源性脂肪祖细胞培养及生物学特征研究

骨髓源性脂肪祖细胞培养及生物学特征研究

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第十二届中国实验动物科学年会

作者：朱光旭王金祥周芳李自安刘菊芬阮光萍白盈盈潘兴华 650032昆明成都军区昆明总医院细胞生物治疗中心干细胞与免疫细胞生物医药技术国家地方联合实验室云南省细胞治疗技术转化医学重点实验室 650032昆明成都军区昆明总医院细胞生物治疗中心干细胞与免疫细胞生物医药技术国家地方联合实验室云南省细胞治疗技术转化医学重点实验室 650032昆明昆明医科大学成都军区昆明总医院临床学院

目的体外培养骨髓脂肪祖细胞(BMAPs),比较其与骨髓间充质干细胞(BMSCs)在形态、表型特征、成脂肪分化能力以及脂肪分化相关基因表达方面的差别.方法确无菌取1～2月龄雄性SD大鼠的股骨和胫骨骨髓制作细胞悬液,EBM-2(含20％FBS、15μ g/... 详细信息

目的体外培养骨髓脂肪祖细胞(BMAPs),比较其与骨髓间充质干细胞(BMSCs)在形态、表型特征、成脂肪分化能力以及脂肪分化相关基因表达方面的差别.方法确无菌取1～2月龄雄性SD大鼠的股骨和胫骨骨髓制作细胞悬液,EBM-2(含20％FBS、15μ g/ml ECGs)培养基差速贴壁法培养第三次贴壁细胞,取3到5代细胞用于实验.流式细胞分析检测CD34、CD44、CD45以及CD90表达;STEMPRO(R) Adipogenesis Differentiation Kit检测细胞成脂肪分化能力;实时荧光定量聚合酶链式反应(real-time qPCR)检测过氧化物酶体增殖激活受体γ(Ppaγ),脂肪酸结合蛋白4(Fabp4),脂蛋白脂肪酶(Lpl),CCAAT/增强子结合蛋白a(Cebpa),葡萄糖转运蛋白4(Slc2a4)以及前脂肪细胞因子1 (pread1) mRNA表达.结果传代接种培养24h,BMSCs形态上呈宽大、扁平状,而BMAPs大部呈长三角状,接种48h后BMSCs排列更为有序,而BMAPs多交织成网状.BMAP表达CD34、CD44、CD45以及CD90,BMSC表达CD44以及CD90,未检测到CD34和CD45表达.诱导培养后第4天,BMAPs成脂率显著高于BMSCs组(P＜0.01),到第8天,BMAPs成脂率为(87.2±11.67)％),BMSCs组成脂率为(18.5±10.2)％,相差更为显著(P＜0.01).诱导分化后第4、8天,Cebpa、Fabp4、Lp1、Ppaγ和Slc2a4 mRNA在BMAPs表达均显著高于BMSCs(P＜0.01).结论本次实验获得养的1种具有干细胞的生物学特性,同时也高表达脂肪分化相关的特异性基因,可以高效均质性地分化为脂肪细胞的BMAPs.

关键词：骨髓脂肪祖细胞间充质干细胞脂肪细胞分化

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骨髓源性脂肪祖细胞培养及生物学特征研究

骨髓源性脂肪祖细胞培养及生物学特征研究

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第十二届中国实验动物科学年会（2016.南宁）

作者：朱光旭王金祥周芳李自安刘菊芬阮光萍白盈盈潘兴华成都军区昆明总医院细胞生物治疗中心干细胞与免疫细胞生物医药技术国家地方联合实验室云南省细胞治疗技术转化医学重点实验室昆明医科大学成都军区昆明总医院临床学院

目的体外培养骨髓脂肪祖细胞(BMAPs),比较其与骨髓间充质干细胞(BMSCs)在形态、表型特征、成脂肪分化能力以及脂肪分化相关基因表达方面的差别。方法确无菌取1～2月龄雄性SD大鼠的股骨和胫骨骨髓制作细胞悬液,EBM-2(含20%FBS、15μg/ml ... 详细信息

目的体外培养骨髓脂肪祖细胞(BMAPs),比较其与骨髓间充质干细胞(BMSCs)在形态、表型特征、成脂肪分化能力以及脂肪分化相关基因表达方面的差别。方法确无菌取1～2月龄雄性SD大鼠的股骨和胫骨骨髓制作细胞悬液,EBM-2(含20%FBS、15μg/ml ECGs)培养基差速贴壁法培养第三次贴壁细胞,取3到5代细胞用于实验。流式细胞分析检测CD34、CD44、CD45以及CD90表达;STEMPRO(?)Adipogenesis Differentiation Kit检测细胞成脂肪分化能力;实时荧光定量聚合酶链式反应(real-time qPCR)检测过氧化物酶体增殖激活受体γ(Ppaγ),脂肪酸结合蛋白4(Fabp4),脂蛋白脂肪酶(Lpl),CCAAT/增强子结合蛋白α(Cebpa),葡萄糖转运蛋白4(S1c2a4)以及前脂肪细胞因子1(pread1)mRNA表达。结果传代接种培养24h,BMSCs形态上呈宽大、扁平状,而BMAPs大部呈长三角状,接种48h后BMSCs排列更为有序,而BMAPs多交织成网状。BMAP表达CD34、CD44、CD45以及CD90,BMSC表达CD44以及CD90,未检测到CD34和CD45表达。诱导培养后第4天,BMAPs成脂率显著高于BMSCs组(P<0.01),到第8天,BMAPs成脂率为(87.2±11.67)%),BMSCs组成脂率为(18.5±10.2)%,相差更为显著(P<0.01)。诱导分化后第4、8天,Cebpa、Fabp4、Lp1、Ppaγ和Slc2a4 mRNA在BMAPs表达均显著高于BMSCs(P<0.01)。结论本次实验获得养的1种具有干细胞的生物学特性,同时也高表达脂肪分化相关的特异性基因,可以高效均质性地分化为脂肪细胞的BMAPs。

关键词：骨髓脂肪祖细胞间充质干细胞脂肪细胞分化

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人脐带间充质干细胞对胶质瘤细胞株U87上皮间质转化及皮下荷瘤能力的影响

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中华细胞与干细胞杂志（电子版） 2016年第6期6卷 369-375页

作者：刘高米洋和法莲陈慧芬陆容李自安何洁赵晶潘兴华成都军区昆明总医院细胞生物治疗中心干细胞与免疫细胞生物医药技术国家地方联合实验室云南省细胞治疗技术转化医学重点实验室昆明650032 昆明医科大学成都军区昆明总医院临床学院 650032 上海市儿童医院中医科 200062

目的研究人脐带间充质干细胞(hUCMSCs)体外模型中对胶质瘤细胞株U87荷瘤能力及其上皮间质转化(EMT)的影响及其可能机制。方法建立裸鼠皮下荷瘤模型,观察hUCMSCs与U87共培养组和U87单独荷瘤组皮下荷瘤能力的差别,免疫组化检测EMT相关基... 详细信息

目的研究人脐带间充质干细胞(hUCMSCs)体外模型中对胶质瘤细胞株U87荷瘤能力及其上皮间质转化(EMT)的影响及其可能机制。方法建立裸鼠皮下荷瘤模型,观察hUCMSCs与U87共培养组和U87单独荷瘤组皮下荷瘤能力的差别,免疫组化检测EMT相关基因组织表达水平,Western Blot检测EMT相关蛋白MMP2,MMP7,MMP9,E-cadherin(E-cad),N-cadherin(N-cad)和Vimentin(VIM)表达情况,q PCR检测EMT相关基因(mmp2,mmp7,mmp9,E-cad,N-cad和vimentin)转录水平。Transwell和Matrigel分别检测hUCMSCs对U87转移能力的影响,两组间比较拟采用独立样本t检验,多组间比较采用单因素方差分析。结果皮下荷瘤结果提示hUCMSCs与U87共培养组皮下荷瘤率高于U87单独荷瘤组,且肿瘤体积较大,RT-PCR结果提示:共培养组和单独培养组相比,E-cad水平下调,N-cad和VIM上调,且基质金属蛋白酶家族MMP2,MMP7,MMP9也有不同程度上调。Western blot结果提示:在蛋白水平共培养组和单独培养组相比,E-cad水平下调2.1倍,N-cad和VIM上调1.0倍,MMP9上调0.9倍;E-cad,N-cad,VIM以及MMP2变化结果与RT-PCR结果一致。免疫组化结果进一步验证hUCMSCs能促进U87表达Ki67,E-cad与N-cad低表达。Transwell和Matrigel实验结果提示hUCMSCs能够促进U87细胞的转移侵袭能力。结论 hUCMSCs能通过促进U87高表达EMT相关基因和增殖相关基因Ki67,从而促进胶质瘤细胞株U87皮下肿瘤形成并发生上皮间质转化,提示hUCMSCs临床应用中应该充分考略受试者是否是潜在胶质瘤患者。

关键词：脐带间质干细胞胶质瘤生物转化

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骨髓源性脂肪祖细胞培养及生物学特征研究

骨髓源性脂肪祖细胞培养及生物学特征研究

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第十五届中国西部实验动物管理与学术交流会

作者：朱光旭王小华周芳李自安刘菊芬阮光萍白盈盈康华利庞荣清潘兴华 650032昆明成都军区昆明总医院细胞生物治疗中心干细胞与免疫细胞生物医药技术国家地方联合工程实验室云南省细胞治疗技术转化医学重点实验室云南省干细胞工程实验室昆明市干细胞与再生医学研究重点实 400013重庆重庆市公安局渝中区分局物证鉴定所 400037重庆第三军医大学新桥医院全军心血管疾病研究所 650032昆明成都军区昆明总医院细胞生物治疗中心干细胞与免疫细胞生物医药技术国家地方联合工程实验室云南省细胞治疗技术转化医学重点实验室云南省干细胞工程实验室昆明市干细胞与再生医学研究重点实 400037重庆第三军医大学新桥医院全军心血管疾病研究所

目的：体外培养骨髓脂肪祖细胞(BMAPs),比较其与骨髓间充质干细胞(BMSCs)在形态、表型、成脂肪分化能力及相关基因表达方面的差别. 方法：脱臼处死SD大鼠,取骨髓制作细胞悬液,EBM-2培养基差速贴壁法培养第三次贴壁细胞,取3到5代细胞... 详细信息

目的：体外培养骨髓脂肪祖细胞(BMAPs),比较其与骨髓间充质干细胞(BMSCs)在形态、表型、成脂肪分化能力及相关基因表达方面的差别. 方法：脱臼处死SD大鼠,取骨髓制作细胞悬液,EBM-2培养基差速贴壁法培养第三次贴壁细胞,取3到5代细胞用于实验.流式细胞分析检测CD34、CD44、CD45以及CDg0表达;STEMPRO Adipogenesis Differentiation Kit检测细胞成脂肪分化能力;实时荧光定量聚合酶链式反应(real-time qPCR)检测过氧化物酶体增殖激活受体γ(Ppaγ),脂肪酸结合蛋白4(Fabp4),脂蛋白脂肪酶(Lpl),CCAAT/增强子结合蛋白α[(Cebpa),葡萄糖转运蛋白4(S1c2a4)以及前脂肪细胞因子1(pread1)mRNA表达. 结果：传代接种培养24h,BMSCs形态上呈宽大、扁平状,而BMAPs大部呈长三角状,接种48h后BMSCs排列更为有序,而BMAPs多交织成网状.BMAP表达CD34、CD44、CD45以及CD90,BMSC仅表达CD44以及CD90.诱导培养后第4天,BMAPs成脂率显著高于BMSCs组(P＜0.01),到第8天,BMAPs与BMSCs组相差更为显著(P＜0.01).在未进行诱导分化前,Cebpa、Ppaγ和Fabp4mRNA,特别是Fabp4mRNA在BMAPs的表达已显著高于BMSCs组(P＜0.01),诱导分化第4、8天,Cebpa、Fabp4、Lp1、Ppaγ和Slc2a4mRNA在BMAPs表达均显著高于在BMSCs的表达(P＜0.01). 结论：本次实验培养的细胞具有干细胞的生物学特性,同时也高表达脂肪分化相关的特异性基因,因此认为实验所培养的细胞可以定义为BMAPs.

关键词：骨髓脂肪祖细胞骨髓间充质干细胞体外培养生物学特征

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间充质干细胞治疗杜氏肌营养不良症：如何优化移植方案？

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中国组织工程研究 2015年第1期19卷 140-145页

作者：朱慧庞荣清潘兴华阮光萍成都军区昆明总医院细胞生物治疗中心细胞生物医药技术国家地方联合工程实验室、云南省干细胞工程实验室、云南省细胞治疗技术转化医学重点实验室、昆明市干细胞与再生医学重点实验室云南省昆明市650032 昆明医科大学成都军区昆明总医院临床学院云南省昆明市650032

背景:药物治疗杜氏肌营养不良症并不理想,近年来越来越多的科学家尝试用间充质干细胞移植治疗杜氏肌营养不良症。目的:旨在通过间充质干细胞治疗杜氏肌营养不良症进展的总结,指导动物实验,以促进其临床应用。方法:由第一作者应用计算机... 详细信息

背景:药物治疗杜氏肌营养不良症并不理想,近年来越来越多的科学家尝试用间充质干细胞移植治疗杜氏肌营养不良症。目的:旨在通过间充质干细胞治疗杜氏肌营养不良症进展的总结,指导动物实验,以促进其临床应用。方法:由第一作者应用计算机检索Pub Med,中国期刊全文数据库(CNKI)2005年1月至2014年6月相关文献。在标题、摘要、关键词中以"Duchenne muscular dystrophy,mesenchymal stem cells,stem cell transplantation"或以"杜氏肌营养不良症,间充质干细胞,干细胞移植"为检索词进行检索。选择文章内容与间充质干细胞治疗杜氏肌营养不良症有关者,同一领域文献选择近期发表在权威杂志的文章。结果与结论:初检得到317篇文献,根据纳入标准选择41篇文献进行综述。主要通过增加间充质干细胞归巢数量,提高抗肌萎缩蛋白的表达来达到治疗杜氏肌营养不良症目的,常用方法有选择较理想的种子细胞、预处理细胞、改善移植途径、干预归巢过程等。间充质干细胞可以从根本上治疗杜氏肌营养不良症,并且能避免药物治疗的不良反应,具有广阔应用前景。

关键词：间质干细胞间质干细胞移植肌营养不良,杜氏干细胞移植杜氏肌营养不良症间充质干细胞干细胞移植脐带间充质干细胞非常小的胚胎样干细胞云南省自然科学基金

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