检索结果-内蒙古大学图书馆

中国兽医学报 2006年第1期26卷 20-23页

作者：张体银孙蕾梁萍刘秀梵扬州大学农业部畜禽传染病学重点开放实验室江苏扬州225009

将转移载体P11SF和PN11SF分别与282E4株鸡痘病毒(282E4strain fowlpox virus,282E4FPV)和大空斑株鸡痘病毒(large plaque strain fowlpox *** FPV)共转染鸡胚成纤维细胞,通过蓝斑筛选,得到4株重组鸡痘病毒rFPV282E4-SFA、rFPVLP-SFA、rFPV282E4-SFB和rFPVLP-SFB,通过PCR和间接免疫荧光鉴定均为阳性,另外将各重组病毒分别传20代,测其遗传稳定性,结果显示均具有良好的稳定性。对SPF鸡进行免疫效力试验,攻毒后均100%保护,而对于商品鸡,保护率分别为64%、60%、52%和88%。

关键词：新城疫病毒 F基因重组鸡痘病毒筛选免疫效力

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H5N1亚型禽流感病毒血凝素单克隆抗体的制备及其应用

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中国兽医科技 2005年第6期35卷 450-454页

作者：龙进学郝贵杰唐应华刘秀梵扬州大学农业部畜禽传染病学重点开放实验室江苏扬州225009

采用活病毒免疫,常规杂交瘤融合的方法,获得了4株针对H5N1亚型禽流感病毒(AIV)A/duck/Shandong/093/2004(A/D/SD/04)株血凝素(HA)的单克隆抗体A8E8、D2F8、A8C8和C3G4。其中A8E8可以与11株不同来源的H5N1AIV发生交叉免疫抑制性反应(HI),具有广谱性。采用间接免疫荧光试验(IFA),用A8E8单克隆抗体测定A/D/SD/04株对COS1和MDCK2种细胞的半数感染量(TCID50),结果显示,A/D/SD/04株在COS1上的TCID50为10-5.33/0.1mL,在MDCK上的为10-7.33/0.1mL。将编码A/D/SD/04株的HA基因质粒与PR8质粒共转染COS1细胞后,用A8E8进行IFA,能观察到特异性绿色荧光,这与鸡胚接种结果相符。表明,用此单克隆抗体能准确地检测到H5重组病毒。

关键词： H5N1亚型禽流感病毒血凝素单克隆抗体制备间接免疫荧光试验

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非抗性RNAi载体及沙门氏菌递送系统的构建

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扬州大学学报（农业与生命科学版） 2006年第1期27卷 1-4页

作者：刘文博张小荣曹永忠吴艳涛焦新安刘秀梵扬州大学农业部畜禽传染病学重点开放实验室江苏扬州225009

为了获得一种新型、高效、安全的s iRNA片段的递送系统,应用PCR方法扩增的RNA i-R eady pS IREN-R etroQZsG reen载体中包含了U 6启动子的3.6 kb的产物,特产物与限制性内切酶B g lⅡ酶切平衡致死系统质粒PYA 3334所得的1.8 kb携带链球菌... 详细信息

为了获得一种新型、高效、安全的s iRNA片段的递送系统,应用PCR方法扩增的RNA i-R eady pS IREN-R etroQZsG reen载体中包含了U 6启动子的3.6 kb的产物,特产物与限制性内切酶B g lⅡ酶切平衡致死系统质粒PYA 3334所得的1.8 kb携带链球菌asd基因的DNA片段相连接,转化X 6212感受态细胞,通过平衡致死系统和抗性筛选得到非抗性的目的克隆。结果成功构建了非抗性RNA i载体,命名为pS IREN-A SD ZsG reen,并将此转化X 4550,最终获得稳定性的递送系统。该载体及减毒鼠伤寒沙门氏菌递送系统为今后RNA i干扰技术应用于动物病毒性疾病预防和控制的研究及转基因生物工程产品的研制打下了基础。

关键词：非抗性 RNA干扰载体递送系统

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表达H5亚型禽流感病毒HA基因的重组马立克氏病病毒的构建

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中国兽医学报 2009年第10期29卷 1264-1268页

作者：郦晓琼吴艳涛徐晓静王郁杨扬州大学农业部畜禽传染病学重点开放实验室江苏扬州225009

采用聚合酶链反应或反转录-聚合酶链反应扩增出H5亚型禽流感病毒(AIV)的HA基因、网状内皮增生症病毒的长末端重复序列(LTR)、马立克氏病病毒(MDV)Rispens CVI988毒株基因组的sorf 1和sorf 2序列、两端带loxp位点的lac/smGFP标志基因,构... 详细信息

采用聚合酶链反应或反转录-聚合酶链反应扩增出H5亚型禽流感病毒(AIV)的HA基因、网状内皮增生症病毒的长末端重复序列(LTR)、马立克氏病病毒(MDV)Rispens CVI988毒株基因组的sorf 1和sorf 2序列、两端带loxp位点的lac/smGFP标志基因,构建含这些基因的转移载体质粒pMHA;以MDV Rispens CVI988毒株的基因组DNA和pMHA质粒DNA共转染鸡胚成纤维细胞(CEF),采用同源重组方法将LTR、lac/smGFP和HA基因插入到MDV基因组,获得重组病毒rMDV-HA/GFP;以cre介导的同源重组去除lac/smGFP标志基因,再转染CEF,获得仅带LTR启动子和HA基因的重组MDV疫苗毒株rMDV-HA。rMDV-HA仍保留了MDV RispensCVI988疫苗毒株的复制特点,并能稳定表达AIV的HA。

关键词：禽流感病毒马立克氏病病毒血凝素同源重组

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抗H5亚型禽流感病毒血凝素蛋白特异性单克隆抗体的研制及鉴定

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中国兽医学报 2007年第5期27卷 664-666页

作者：郝贵杰提金凤陈清刘文博吴艳涛扬州大学农业部畜禽传染病学重点开放实验室江苏扬州225009

以抗H5亚型禽流感病毒(AIV)JSD株鸡胚尿囊液免疫8周龄BALB/c小鼠,第4次免疫后取其脾淋巴细胞与SP2/0-Ag-14骨髓瘤细胞融合,用血凝抑制试验(HI)对杂交瘤进行筛选,经3次亚克隆后,共获得4株针对血凝素(HA)蛋白的特异性单克隆抗体,分别命名... 详细信息

以抗H5亚型禽流感病毒(AIV)JSD株鸡胚尿囊液免疫8周龄BALB/c小鼠,第4次免疫后取其脾淋巴细胞与SP2/0-Ag-14骨髓瘤细胞融合,用血凝抑制试验(HI)对杂交瘤进行筛选,经3次亚克隆后,共获得4株针对血凝素(HA)蛋白的特异性单克隆抗体,分别命名为:2D2、2C8、3D3和3D11。该4株单抗的小鼠腹水的HI效价在213～215,ELISA效价为1.2×105～5.1×105。亚类鉴定结果表明,2D2和3D11属于IgG1,2C8属于IgG3,3D3属于IgG2a亚类;特异性试验结果表明,上述4株单抗仅与H5 AIV毒株发生特异性反应,而不与其他亚型AIV以及NDV、IBV和EDSV-76等病毒反应;鸡胚中和试验结果显示,4株单抗均具有较好的中和活性。本研究成功获得4株针对H5 AIVHA蛋白的特异性单抗,为临床H5 AIV的血清学监测及鉴定提供了必需的试剂。

关键词：禽流感病毒单克隆抗体血凝抑制试验

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多重PCR方法快速检测粪样中产气荚膜梭菌

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中国预防兽医学报 2002年第1期24卷 48-51页

作者：文其乙刘秀梵扬州大学农业部畜禽传染病学重点开放实验室江苏扬州225009

建立了多重聚合酶链反应 (multiplexPCR)检测产气荚膜梭菌的α_毒素和肠毒素 (enterotoxin)基因。该方法可以检测猪粪便样品或小肠内容物中肠毒性产气荚膜梭菌。首先猪粪便样品经前处理后 ,接种选择性培养基 ,再挑取单个菌落溶于超纯水... 详细信息

建立了多重聚合酶链反应 (multiplexPCR)检测产气荚膜梭菌的α_毒素和肠毒素 (enterotoxin)基因。该方法可以检测猪粪便样品或小肠内容物中肠毒性产气荚膜梭菌。首先猪粪便样品经前处理后 ,接种选择性培养基 ,再挑取单个菌落溶于超纯水中 ,煮沸提抽 ,制备样品DNA ,进行PCR检测。从实验中我们成功的扩增出 32 4bp的α毒素基因片段和 2 33bp的肠毒素基因片段。以人工污染样品 10倍系例稀释后进行检测 ,该方法的检测灵敏度达到 1.0× 10 4 CFU/g并对 5 8份猪粪便样品检测 ,获得 5 3株产气荚膜梭菌 ,分离率为 91%,其中 4株为带有肠毒素的产气荚膜杆菌 ,占整个分离菌株的 7.5 %。因此多重PCR方法在检测粪样中的产气荚膜梭菌是一种非常有用的方法并可以快速检出肠毒素 ,从而避免了使用动物作定型试验。

关键词：产气荚膜梭菌 α-毒素肠毒素多重聚合酶链反应粪样检测

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检测鸭呼肠孤病毒抗体间接ELISA方法的建立

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中国兽医学报 2014年第1期34卷 26-29,38页

作者：孙陈莉杨瑞王义敏赵娜张小荣彭大新吴艳涛扬州大学农业部畜禽传染病学重点开放实验室江苏扬州225009

RT-PCR扩增鸭呼肠孤病毒(Duck reovirus,DRV)的σB基因,克隆到pET-32a(+)表达载体,再转化大肠杆菌Transetta(DE3);含有重组质粒pET-σB的大肠杆菌经IPTG诱导,获得大小为55 000的以包涵体形式表达的σB重组蛋白。Western blotting显示,σ... 详细信息

RT-PCR扩增鸭呼肠孤病毒(Duck reovirus,DRV)的σB基因,克隆到pET-32a(+)表达载体,再转化大肠杆菌Transetta(DE3);含有重组质粒pET-σB的大肠杆菌经IPTG诱导,获得大小为55 000的以包涵体形式表达的σB重组蛋白。Western blotting显示,σB重组蛋白能够与兔抗DRV多抗血清特异性结合。以高亲和NI-NTA树脂在变性条件下纯化、梯度尿素复性的σB重组蛋白为包被抗原,建立了检测DRV抗体的间接ELSIA方法。分别以间接ELSIA方法和血清中和试验对DRV感染鸭血清和SPF鸭血清进行检测,两者的符合率为100%。该间接ELSIA方法对鸭瘟病毒、鸭病毒性肝炎病毒和禽流感病毒阳性血清均无交叉反应。

关键词：鸭呼肠孤病毒 σB重组蛋白原核表达间接ELISA

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鹅源新城疫病毒F和HN基因的表达及功能鉴定

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扬州大学学报（农业与生命科学版） 2006年第4期27卷 8-11页

作者：胡顺林张艳梅孙庆吴艳涛刘玉良刘秀梵扬州大学农业部畜禽传染病学重点开放实验室江苏扬州225009

鹅源新城疫病毒的F和HN基因经RT-PCR方法从尿囊液中扩增后分别克隆进pCR2．1载体,再分别亚克隆到真核表达载体pCI-neo上,构建了F基因的表达载体(pCI-F)和HN基因的表达载体(pCI-HN)。间接免疫荧光(IFA)鉴定结果表明:F和HN基因均能在细胞... 详细信息

鹅源新城疫病毒的F和HN基因经RT-PCR方法从尿囊液中扩增后分别克隆进pCR2．1载体,再分别亚克隆到真核表达载体pCI-neo上,构建了F基因的表达载体(pCI-F)和HN基因的表达载体(pCI-HN)。间接免疫荧光(IFA)鉴定结果表明:F和HN基因均能在细胞中得到较好的表达;将pCI-F和pCI-HN共转染CEF和COS细胞,转染的细胞中能形成明显的合胞体。而用pCI-F单独进行转染时,不能产生合胞体,说明F蛋白要发挥其融合作用必须要有HN蛋白的参与,同时也进一步证明F和HN蛋白与病毒的融合特性密切相关。

关键词：鹅新城疫病毒 F蛋白表达合胞体

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表达鸡Ⅱ型干扰素基因的重组鸡痘病毒的构建

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农业生物技术学报 2002年第2期10卷 152-155页

作者：程坚刘秀梵彭大新吴艳涛扬州大学畜禽传染病学农业部重点开放实验室扬州大学畜禽传染病学农业部重点开放实验室扬州225009

以插入鸡Ⅱ型干扰素(IFN-Ⅱ)cDNA序列的重组质粒AIFN为模板,根据鸡痘病毒早晚期启动子PE/L的序列设计上游引物,鸡IFN-Ⅱ基因的cDNA3’端序列设计下游引物,采用PCR法扩增包括启动子PE/L和鸡IFN-Ⅱ全长cDNA序列的基因片段。将该扩增片段... 详细信息

以插入鸡Ⅱ型干扰素(IFN-Ⅱ)cDNA序列的重组质粒AIFN为模板,根据鸡痘病毒早晚期启动子PE/L的序列设计上游引物,鸡IFN-Ⅱ基因的cDNA3’端序列设计下游引物,采用PCR法扩增包括启动子PE/L和鸡IFN-Ⅱ全长cDNA序列的基因片段。将该扩增片段定向插入鸡痘病毒转移载体1175中,获重组转移载体1175IFN,用以转染已感染鸡痘病毒282E4疫苗株(wt-FPV)的鸡(Gallusgallus)胚成纤维细胞(CEF)。1175IFN与wt-FPV基因组DNA之间的同源重组产生了表达IFN-Ⅱ的重组鸡痘病毒rFPV-IFN-Ⅱ。通过在含X-gal的营养琼脂上连续挑选蓝色病毒蚀斑获得并纯化rFPV-IFN-Ⅱ。以细胞病变抑制实验证实,rFPV-IFN-Ⅱ感染的CEF表达了具有抗水泡性口炎病毒(VSV)活性的鸡IFN-Ⅱ。rFPV-IFN-Ⅱ(M.O.I=0.01)感染CEF72h后,培养上清中IFN-Ⅱ的表达量为1280U/mL。动物实验表明,rFPV-IFN-Ⅱ接种雏鸡7d或14d后,其在体内表达的IFN-Ⅱ可显著减轻载体鸡痘病毒对1日龄SPF雏鸡体重增长的抑制作用。

关键词：鸡Ⅱ型干扰素重组鸡痘病毒表达

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一株鸭源H4N8亚型禽流感病毒的全基因测序及遗传进化分析

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中国农业科学 2015年第15期48卷 3040-3049页

作者：赵晴晴李群辉朱杰钟蕾刘晶晶顾敏王晓泉刘文博刘秀梵扬州大学兽医学院/农业部畜禽传染病学重点开放实验室

【目的】禽流感病毒(avian influenza virus,AIV)根据其表面糖蛋白血凝素(hemagglutinin,HA)和神经氨酸(neuraminidase,NA)的不同,可分为16种HA和9种NA亚型。根据其致病力的差异可分为高致病性禽流感病毒(highly pathogenic avian influenza virus,HPAIV)和低致病性禽流感病毒(low pathogenic avian influenza virus,LPAIV)。虽然H4亚型禽流感病毒为低致病性AIV,感染家禽表现为无症状感染,但其对禽类甚至是哺乳动物是一个潜在的威胁,因此必须要加强对H4亚型禽流感病毒的调查监控。【方法】为了探讨H4亚型禽流感病毒的分子特征及遗传演化规律,对2010年在中国华东地区某活禽市场进行流行病学监测时分离到的一株H4N8亚型禽流感病毒A/duck/Nanjing/1102/2010(简称DK/NJ/1102)进行了全基因组序列测定及遗传进化分析。通过常规的血清学试验确定其HA亚型,提取病毒总RNA,并通过RT-PCR方法分别扩增出其各基因片段,连接p GEM-Teasy载体上后进行序列测定。利用Gen Bank中的BLAST工具进行核苷酸序列的同源性分析,并与Gene Bank中的H4亚型流感病毒及其它相关序列进行遗传进化分析。【结果】DK/NJ/1102的HA基因与Mongolia分离株A/duck/Mongolia/274/2007(H4N3)的核苷酸同源性最高,为98.9%。推导的氨基酸剪切位点序列为"P-E-K-A-S-R-G",符合典型的低致病性禽流感病毒特征;NA基因与华东地区分离的鸭源毒株A/Duck/Eastern China/n91/2009(H3N8)核苷酸同源性最高,达99.4%;PB1、PA和NP基因均与H1亚型禽流感病毒亲缘关系最近;M基因与A/wild duck/Korea/CSM4-12/2009(H5N1)核苷酸同源性最高,高达99.9%;NS基因与韩国2009年分离的H7N7亚型流感病毒遗传距离最近。NS1蛋白的80-84处氨基酸没有发生氨基酸缺失。【结论】该H4N8亚型禽流感病毒基因组构成比较复杂,可能是一株多基因重组病毒。

关键词：禽流感病毒 H4N8亚型遗传进化分析重组

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