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中国兽医科技 2005年第9期35卷 684-688页

作者：张评浒唐应华薛峰刘晓文钱忠明郝贵杰刘秀梵扬州大学农业部畜禽传染病学重点开放实验室江苏扬州225009

采用血清学试验和RT-PCR方法从华东地区家养水禽中分离鉴定出多株H10亚型禽流感病毒,对其中1株A/Duck/Yangzhou/502/2003(简称Dk/YZ/502/03)的血凝素(HA)基因进行了序列测定,并与GenBank中登录的其他序列进行了比较。结果显示,Dk/YZ/502... 详细信息

采用血清学试验和RT-PCR方法从华东地区家养水禽中分离鉴定出多株H10亚型禽流感病毒,对其中1株A/Duck/Yangzhou/502/2003(简称Dk/YZ/502/03)的血凝素(HA)基因进行了序列测定,并与GenBank中登录的其他序列进行了比较。结果显示,Dk/YZ/502/03株血凝素基因与哺乳动物水貂分离株A/Mink/Sweden/84(H10N4)的同源性最高;其推导的氨基酸剪切位点序列为P-E-I-M-Q-G-R,为典型低致病性禽流感病毒的特征序列,这与该毒株对SPF鸡和BALB/c小鼠的低致病特性相吻合。

关键词：禽流感病毒测序 H10亚型血凝素致病性剪切位点

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H5N1亚型禽流感病毒A/duck/Shandong/093/2004株的全基因克隆及序列分析

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微生物学报 2005年第5期45卷 690-696页

作者：龙进学王曲直卢建红刘玉良刘秀梵扬州大学畜牧兽医学院农业部畜禽传染病学重点开放实验室扬州225009

应用流感病毒通用引物[4]和H5N1亚型禽流感(Avian influenza virus,AIV)的型特异性引物,成功的扩增出H5N1亚型禽流感病毒A/duck/Shandong/093/2004株(简称A/D/SD/04)的全基因序列(包括5′和3′端的非编码区序列).A/D/SD/04的基因组核苷酸全序列与18株网上公布的禽流感基因序列进行比较和分析,结果与4株鸭源H5N1的5～7个基因具99%以上的同源性;与14株H5N1有至少一个以上内部基因同源性在95%以上.与H9亚型AIV代表株A/Quail/Hongkong/G1/97(简称G1株)和A/Chicken/Beijing/1/94(简称BJ94)比较,除了非结构基因(Nonstructural gene,NS)与G1株的同源性为95.3%外,其余基因均在36.6%～92.1%之间.说明A/D/SD/04没有H9N2基因的直接整合,是H5N1毒株在自然界的重组株.推导的HA氨基酸序列分析,A/D/SD/04 的血凝素(Heamgglutinin,HA)裂解位点与比较的16株AIV的序列一致,是高致病性禽流感的分子特征(PQRERRRKKR/G),第226位氨基酸是对禽类和哺乳细胞均具有亲嗜性的蛋氨酸(Met).神经氨酸酶(Neuraminidase,NA)在第48位氨基酸(颈部)后有20个氨基酸的缺失,但非结构蛋白(NS)没有在79～84氨基酸发生缺失.碱性聚合酶2(PB2)的627位氨基酸是亲禽类细胞的谷氨酸(Glu,E).结合生物学特性和分子特征,A/D/SD/04对小鼠的致病力是由多种因素决定,其可能是一株对鸡高度致病,并逐渐获得对哺乳动物致病能力的中间重组病毒.

关键词： H5N1亚型禽流感病毒通用引物全基因组序列序列分析

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致断奶仔猪腹泻、水肿病大肠杆菌F18菌毛a因子单克隆抗体的研制及其初步应用

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中国兽医学报 2004年第6期24卷 541-544页

作者：郭玉广高崧刘秀梵扬州大学农业部畜禽传染病学重点开放实验室江苏扬州225009

以表达 F18ac菌毛参考菌株 2 134(O15 7∶ H19)为研究对象 ,摸索出了 F18ac菌毛表达的最佳条件 ,采用热洗脱法获得了较纯的 F18ac菌毛 ,并以之免疫小鼠 ,利用淋巴细胞杂交瘤技术 ,用直接玻板凝集法筛选出 1株杂交瘤细胞株 19B4 ,能稳定... 详细信息

以表达 F18ac菌毛参考菌株 2 134(O15 7∶ H19)为研究对象 ,摸索出了 F18ac菌毛表达的最佳条件 ,采用热洗脱法获得了较纯的 F18ac菌毛 ,并以之免疫小鼠 ,利用淋巴细胞杂交瘤技术 ,用直接玻板凝集法筛选出 1株杂交瘤细胞株 19B4 ,能稳定分泌针对 F18ac菌毛和 F18ab菌毛共同抗原表位 a因子的单克隆抗体。细胞培养上清对 F18ac菌毛参考菌株 2 134和 F18ab菌毛参考菌株 10 7/ 86的直接凝集价均可达 1∶ 8,腹水单抗直接凝集效价可达 1∶ 10 2 4 ,而与猪源产 F4、F5、F6和 F4 1粘附素大肠杆菌菌株、鸡源产型菌毛大肠杆菌菌株及沙门氏菌不发生凝集反应。免疫印迹试验结果显示 ,腹水单抗可同时特异识别 F18ac菌毛 170 0 0和 F18ab菌毛 15 0 0 0左右的主要亚单位多肽。应用所研制的单抗对 2 15株断奶仔猪腹泻大肠杆菌分离株进行了检测 ,结果上述分离株 TSB培养物的 F18菌毛的检出率为13.4 % ,TSA培养物的检出率为 8.4 %。F18菌毛阳性分离株的 O血清型除了常见血清型 O139、O14 1外 ,还有非常见血清型 O10 7、O131和 O9等。TSB培养物的 F18菌毛检出率明显高于 TSA培养物的检出率 ,表明 F18菌毛在 TSB培养基中比在 TSA培养基上更容易表达 ,TSB培养基是适合 F18菌毛检测。

关键词：断奶仔猪腹泻水肿病大肠杆菌 F18菌毛 a因子单克隆抗体研制技术

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华东地区部分猪源大肠杆菌K 88黏附素的生物学特性

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中国兽医学报 2005年第5期25卷 474-477页

作者：陈祥高崧王雷李文杰曹传闺焦新安刘秀梵扬州大学农业部畜禽传染病学重点开放实验室江苏扬州225009

近年来,从华东地区患腹泻仔猪中分离到一些表达K 88菌毛的大肠杆菌,这些菌株只与K 88 a因子单抗反应,而不与b、c、d因子单抗反应。通过K 88常规血清交叉吸收试验、SDS-PAGE、W estern印迹,表明这些菌株不仅与K 88ac参考菌株C 83907制备... 详细信息

近年来,从华东地区患腹泻仔猪中分离到一些表达K 88菌毛的大肠杆菌,这些菌株只与K 88 a因子单抗反应,而不与b、c、d因子单抗反应。通过K 88常规血清交叉吸收试验、SDS-PAGE、W estern印迹,表明这些菌株不仅与K 88ac参考菌株C 83907制备的c因子血清反应,而且与以分离株SEC 586制备且经K 88ab、K 88ac、K 88ad参考菌株吸收后的血清也反应。对分离株SEC 586、SEC 464的K 88主要亚单位结构基因faeG的克隆、测序,发现该基因由846对核苷酸组成,编码菌毛主要亚单位的262个氨基酸及21个氨基酸的信号肽,比国外报道的K 88ac F aeG亚单位(263个氨基酸)少了1个氨基酸,比K 88ab、K 88ad(265个氨基酸)少了3个氨基酸。SEC 586、SEC 464菌株的F aeG亚单位氨基酸序列的同源性为97.7%,它们与K 88ac的同源性为94.7%和96.2%;与K 88ab的同源性为90.1%和91.2%;与K 88ad的同源性为87.0%和88.6%。结果表明,新分离的K 88ac大肠杆菌黏附素主要亚单位已发生了部分变异。

关键词：大肠杆菌 K88黏附素单克隆抗体 faeG

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PRRSV间接免疫荧光检测法的建立和应用

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中国兽医科技 2005年第4期35卷 256-260页

作者：彭长凌高崧刘秀梵扬州大学农业部畜禽传染病学重点开放实验室江苏扬州225009

以猪生殖与呼吸综合征病毒(PRRSV) ATCC VR 2332 株人工单独感染3 头3 周龄仔猪,并用PRRSV ATCC VR 2332株和猪圆环病毒2型(PCV2)联合感染2 头3 周龄仔猪,每日检查试验猪体温、采食情况及临床表现,并用HerdChek IDEXX 试剂盒测其血清抗... 详细信息

以猪生殖与呼吸综合征病毒(PRRSV) ATCC VR 2332 株人工单独感染3 头3 周龄仔猪,并用PRRSV ATCC VR 2332株和猪圆环病毒2型(PCV2)联合感染2 头3 周龄仔猪,每日检查试验猪体温、采食情况及临床表现,并用HerdChek IDEXX 试剂盒测其血清抗体。PRRSV+PCV2联合感染猪分别在感染后1、3周剖杀,PRRSV单独感染猪和健康对照猪分别在感染后1、2和3周剖杀,对全部试验猪的肺组织进行灌洗处理以获得肺泡巨噬细胞(PAM),用PAM进行抹片,同时用肺组织直接进行触片做间接免疫荧光(IIF)检测。结果表明,用所获得的3 株单克隆抗体均检测到人工感染猪肺组织中的PRRSV抗原。另外,用IIF检测7 头临床疑似PRRS病猪的PAM抹片,其中沭阳县的2头猪呈现阳性反应;对这2头猪的肺组织进行病毒分离,在盲传到第4代时Marc 145细胞上产生明显的细胞病变,进一步证实用所获得的3株单克隆抗体检测临床样品的结果准确而可靠,且获得的3株单克隆抗体均可通过IIF用于检测猪肺组织中的PRRSV抗原。

关键词： PRRSV 荧光检测法猪生殖与呼吸综合征病毒猪圆环病毒2型单克隆抗体应用肺泡巨噬细胞间接免疫荧光联合感染肺组织 ATCC 检查试验临床表现采食情况血清抗体人工感染阳性反应病毒分离细胞病变临床样品抗体检测

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表达新城疫病毒F基因重组鸡痘病毒的遗传稳定性

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中国预防兽医学报 2006年第4期28卷 405-407页

作者：张体银孙蕾刘武杰刘秀梵扬州大学农业部畜禽传染病学重点开放实验室江苏扬州225009

本实验为了评价表达新城疫病毒F基因重组鸡痘病毒(rFPV282E4-SF,rFPVLp-SF)的遗传稳定性,将其在鸡胚成纤维细胞连续培养20代。通过蓝斑来鉴定重组鸡痘病毒纯度,结果所有蚀斑100%变蓝。通过对第0、10和20代F基因扩增并进行序列测定,所有... 详细信息

本实验为了评价表达新城疫病毒F基因重组鸡痘病毒(rFPV282E4-SF,rFPVLp-SF)的遗传稳定性,将其在鸡胚成纤维细胞连续培养20代。通过蓝斑来鉴定重组鸡痘病毒纯度,结果所有蚀斑100%变蓝。通过对第0、10和20代F基因扩增并进行序列测定,所有碱基和氨基酸序列均和原始转移载体序列完全一致,没有发生任何改变。随后又通过间接免疫荧光证实rFPV282E4-FS和rFPVLP-FS各个代次F基因的特异表达。所有结果均显示了上述重组鸡痘病毒具有良好的遗传稳定性,满足兽医生物制品的遗传稳定性要求。

关键词：新城疫病毒 F基因重组鸡痘病毒遗传稳定性

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近年来大肠杆菌K88ac菌毛的变异和生物学特性

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农业生物技术学报 2006年第5期14卷 757-762页

作者：陈祥苗晓青刘静黄莉莉高崧焦新安刘秀梵扬州大学农业部畜禽传染病学重点开放实验室扬州大学农业部畜禽传染病学重点开放实验室扬州225009

2000￣2005年,从猪大肠杆菌病(colibacillosis)中分离到一些表达K88菌毛的大肠杆菌(Escherichiacoli),这些分离株只与K88a因子单抗反应,而不与K88b、c和d因子单抗反应。分离的菌株(13/16)以O149为常见血清型,且全部拥有STb毒素基因,通过... 详细信息

2000￣2005年,从猪大肠杆菌病(colibacillosis)中分离到一些表达K88菌毛的大肠杆菌(Escherichiacoli),这些分离株只与K88a因子单抗反应,而不与K88b、c和d因子单抗反应。分离的菌株(13/16)以O149为常见血清型,且全部拥有STb毒素基因,通过K88常规血清交叉吸收试验、SDS-PAGE和Western印迹,表明这些菌株不仅与K88ac参考菌株C83907制备的c因子血清反应,而且与以分离株SEC586制备且经K88ab、K88ac和K88ad参考菌株吸收后的血清也反应,表明这些分离株仍为K88ac大肠杆菌。对新近分离的SEC464、SEC525、SEC586、SEC799和EC910株及80年代我国分离的TM128株的K88主要亚单位结构基因faeG进行克隆、测序,发现新近分离株的faeG基因由846对核苷酸组成,编码菌毛主要亚单位的261个氨基酸及21个氨基酸的信号肽,比国内外报道的K88acFaeG亚单位(262个氨基酸)少了一个氨基酸,比K88ab、K88ad(264个氨基酸)少了3个氨基酸。TM128株的FaeG氨基酸序列与K88ac(M29375)的同源性为100.0%,SEC464、SEC525、SEC586、SEC799和SEC910株的FaeG亚单位氨基酸序列的同源性为97.7%￣99.6%,它们与K88ac的同源性为94.6%￣96.6%;与K88ab的同源性为90.0%￣91.6%;与K88ad的同源性为87.0%￣88.9%。结果表明新分离的K88ac大肠杆菌黏附素主要亚单位已发生了部分变异。

关键词：大肠杆菌 K88黏附素单克隆抗体 faeG基因

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鸡痘病毒通用高效表达载体的构建及其初步应用

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中国兽医学报 2004年第5期24卷 429-432页

作者：孙蕾吴艳涛张体银陈素娟刘秀梵扬州大学农业部畜禽传染病学重点开放实验室江苏扬州225009

利用分子克隆技术对本室构建的高效鸡痘病毒表达载体 p1 1 S进行改造 ,在其人工合成禽痘病毒 ( FPV)强启动子 Ps的下游引入含 7个单一酶切位点的多克隆位点 ( MCS) ,构建了便于外源基因插入的通用性更强的高效单表达载体 p N1 1 S。然后... 详细信息

利用分子克隆技术对本室构建的高效鸡痘病毒表达载体 p1 1 S进行改造 ,在其人工合成禽痘病毒 ( FPV)强启动子 Ps的下游引入含 7个单一酶切位点的多克隆位点 ( MCS) ,构建了便于外源基因插入的通用性更强的高效单表达载体 p N1 1 S。然后将 FPV早晚期启动子 PE/ L 及其启动的鹅源新城疫病毒 NDV ZJ1株的 F基因一并插入 p N1 1 S中 ,使PE/ L 与 Ps反向串联 ,从而构建出 1个含 NDV ZJ1株 F基因的重组 FPV高效双表达载体 p N1 1 SEF,其 MCS可以用于插入其他外源基因。在此基础上 ,将 NDV ZJ1株的 HN基因插入 p N1 1 SEF的 Ps启动子下游的 MCS中 ,构建了共表达 NDV ZJ1株 F和 HN基因的重组 FPV双表达载体 p N1 1 SEFHN。将 p H1 1 SEFHN质粒 DNA与 FPV2 82 E4株共转染 CEF,得到共表达 NDV ZJ1株和 HN基因的重组 FPV,间接免疫荧光实验初步证明外源基因得到了较好的表达。表明所构建的通用高效 FPV表达载体有利于高效基因工程活载体疫苗的研制。

关键词：鸡痘病毒表达载体新城疫病毒 F基因 HN基因疫苗

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以减毒鼠伤寒沙门氏菌运送的H5亚型禽流感病毒DNA疫苗的安全性与免疫效力

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中国兽医学报 2004年第6期24卷 531-533页

作者：张小荣焦新安潘志明张晓明黄金林张如宽刘秀梵扬州大学农业部畜禽传染病学重点开放实验室江苏扬州225009

将运送 H5亚型高致病力禽流感病毒 DNA疫苗的重组减毒鼠伤寒沙门氏菌 X4 5 5 0 (p VAX1- HA)和 X4 5 5 0 (asd-p VAX1- HA )以 115; 10 1 0 CFU的剂量腹腔注射 1日龄 SPF白莱航雏鸡 ,结果表明 ,二者均具有良好的安全性。对 SPF白莱... 详细信息

将运送 H5亚型高致病力禽流感病毒 DNA疫苗的重组减毒鼠伤寒沙门氏菌 X4 5 5 0 (p VAX1- HA)和 X4 5 5 0 (asd-p VAX1- HA )以 1× 10 1 0 CFU的剂量腹腔注射 1日龄 SPF白莱航雏鸡 ,结果表明 ,二者均具有良好的安全性。对 SPF白莱航鸡的免疫原性试验结果表明 ,这 2种细菌均能刺激鸡体产生高水平的肠道粘膜免疫应答 ,但是不能有效地激发血清抗体应答。对商品代伊莎褐蛋鸡的免疫效力试验初步结果显示 ,X4 5 5 0 (asd- p VAX1- HA)免疫鸡能够抵抗强毒的攻击 ,保护指数为 77.8% ,而 X4 5 5 0 (p VAX1- HA)

关键词：减毒鼠伤寒沙门氏菌 H5亚型禽流感病毒 DNA疫苗安全性免疫效力

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两株家鸭禽流感病毒H3N1亚型分离株的致病性及其表面糖蛋白基因序列分析

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中国兽医科学 2006年第8期36卷 621-624页

作者：薛峰彭宜顾敏徐利军张评浒刘秀梵扬州大学农业部畜禽传染病学重点开放实验室江苏扬州225009

测定了2株禽流感病毒(AIV)Dk/YZ/231/02和Dk/YZ/3/04对SPF鸡和BALB/c小鼠的致病性；对其血凝素(HA)基因和神经氨酸酶(NA)基因的序列进行了测定,并与GenBank中收录的其他序列进行了比较。结果,此2株AIV对SPF鸡具有较低的致病性,而对BALB/... 详细信息

测定了2株禽流感病毒(AIV)Dk/YZ/231/02和Dk/YZ/3/04对SPF鸡和BALB/c小鼠的致病性；对其血凝素(HA)基因和神经氨酸酶(NA)基因的序列进行了测定,并与GenBank中收录的其他序列进行了比较。结果,此2株AIV对SPF鸡具有较低的致病性,而对BALB/c小鼠无致病性；Dk/YZ/231/02株的HA基因与Dk/Ukraine/1/63(H3N8)株的同源率最高,Dk/YZ/3/ 04株的HA基因与Petbird/HK/1559/99(H3N8)株的同源率最高；而Dk/YZ/231/02株的NA基因与Dk/Fujian/17/2001(H5N1)株的同源率最高,Dk/YZ/3/04株的NA基因与Gs/Guangdong/ 1/96(H5N1)株的同源率最高。进化分析结果表明,Dk/YZ/231/02和Dk/YZ/3/04株的NA基因均可能起源于水禽源H5N1亚型AIV,这可能是不同亚型AIV在水禽体内基因重组的结果。推导的氨基酸剪切位点序列均为PEKQTR,属于非高致病性AIV的特征序列。

关键词：禽流感病毒 HA基因 NA基因

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