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长非编码RNA lnc-ALVE1-AS1抑制ALV-J在鸡巨噬细胞中增殖

中国动物传染病学报 2024年第1期32卷 18-25页

作者：柴文娴骆欢金松王姣罗坚强洪雅琴耿拓宇崔恒宓胡序明常州市动物疫病预防控制中心常州213002 扬州大学动物科学与技术学院/表观遗传学及表观基因组学研究所扬州225009 扬州大学教育部农业与农产品安全国际合作联合实验室扬州225009

研究表明,源自内源性反转录病毒的长非编码RNA可能是巨噬细胞抗病毒免疫反应的重要组成部分。鸡内源性反转录病毒衍生的长非编码RNA lnc-ALVE1-AS1与宿主遗传抗性有关,能够激活非免疫细胞抗病毒天然免疫反应。为进一步探讨lnc-ALVE1-AS... 详细信息

研究表明,源自内源性反转录病毒的长非编码RNA可能是巨噬细胞抗病毒免疫反应的重要组成部分。鸡内源性反转录病毒衍生的长非编码RNA lnc-ALVE1-AS1与宿主遗传抗性有关,能够激活非免疫细胞抗病毒天然免疫反应。为进一步探讨lnc-ALVE1-AS1在鸡巨噬细胞中的抗病毒作用及其机制,本研究通过荧光定量PCR发现lnc-ALVE1-AS1在ALV-J感染鸡巨噬细胞系HD11后24 h显著下调。进一步通过lnc-ALVE1-AS1过表达实验证实,lnc-ALVE1-AS1可以显著抑制ALV-J在HD11细胞中增殖。机制上,lnc-ALVE1-AS1显著上调HD11细胞dsRNA识别受体(TLR3)、Ⅰ型干扰素(IFN-α和IFN-β)和其他抗病毒天然免疫基因(IRF7、MX1、OASL和IFITM3)表达。然而,干扰TLR3或者抑制TLR3信号后lnc-ALVE1-AS1诱导Ⅰ型干扰素(IFN-α和IFN-β)的能力显著减弱。共聚焦定位分析显示在HD11细胞中lnc-ALVE1-AS1可以与TLR3蛋白直接结合。这说明激活TLR3信号可能是lnc-ALVE1-AS1抑制ALV-J在巨噬细胞中增殖的一个重要机制。本研究揭示了lnc-ALVE1-AS1在巨噬细胞中抗病毒功能及其作用机制,为抗病育种研究提供了新的遗传基础。

关键词：内源性反转录病毒 lnc-ALVE1-AS1 禽白血病病毒鸡巨噬细胞

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长非编码RNA lnc-ALVE1-AS1与禽白血病病毒抗性和易感品系鸡相关性分析

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中国动物传染病学报 2023年第4期31卷 26-32页

作者：柴文娴骆欢陈绪靖陈世豪耿拓宇崔恒宓胡序明常州市动物疫病预防控制中心常州213002 扬州大学动物科学与技术学院表观遗传学及表观基因组学研究所扬州225009 扬州大学教育部农业与农产品安全国际合作联合实验室扬州225009

内源性反转录病毒是长非编码RNA的重要来源,在抗病毒先天性免疫中发挥重要作用。鸡内源性反转录病毒衍生的长非编码RNA lnc-ALVE1-AS1能够激活细胞免疫功能并抑制禽白血病病毒增殖。为进一步探讨lnc-ALVE1-AS1在ALV抗性和易感品系鸡中... 详细信息

内源性反转录病毒是长非编码RNA的重要来源,在抗病毒先天性免疫中发挥重要作用。鸡内源性反转录病毒衍生的长非编码RNA lnc-ALVE1-AS1能够激活细胞免疫功能并抑制禽白血病病毒增殖。为进一步探讨lnc-ALVE1-AS1在ALV抗性和易感品系鸡中的表达规律及其与禽白血病病毒抗性的相关性,本研究通过荧光定量PCR发现,lnc-ALVE1-AS1在ALV抗性(G1)品系鸡免疫器官(胸腺、脾脏和法氏囊)和CEF细胞中的表达水平显著高于ALV易感(G3)品系鸡。病毒感染实验表明lnc-ALVE1-AS1在ALVJ感染CEF(G1和G3来源)细胞24h和96h后均显著下调;但是,lnc-ALVE1-AS1在G3来源CEF细胞中的表达水平下降更为明显,且ALVJ病毒复制水平显著高于G1鸡来源的CEF细胞。进一步通过lnc-ALVE1-AS1过表达实验证实,lnc-ALVE1-AS1不仅可以显著上调G3来源CEF细胞dsRNA识别受体(TLR3和IFIH1)和抗病毒天然免疫基因(IFI27-L2、IFIT5、IFITM3、IFN-β、ISG12-2和RASD2)表达,还显著抑制ALVJ复制。本研究揭示了lnc-ALVE1-AS1在禽白血病病毒抗性和易感品系鸡细胞和免疫组织器官中的表达规律和抗病毒功能,为抗病育种研究提供了新的遗传基础。

关键词：内源性反转录病毒 lnc-ALVE1-AS1 禽白血病病毒鸡胚成纤维细胞

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鸡c-myc原癌基因反义RNA的鉴定及其抗ALV-J能力的分析

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中国预防兽医学报 2022年第1期44卷 59-65页

作者：骆欢张瑾麒朱姝桐柴文娴陈绪靖陈世豪耿拓宇崔恒宓胡序明扬州大学动物科学与技术学院/表观遗传学及表观基因组学研究所江苏扬州225009 扬州大学教育部农业与农产品安全国际合作联合实验室江苏扬州225009 常州市动物疫病预防控制中心江苏常州213002

原癌基因c-myc被鉴定为J亚群禽白血病病毒(ALV-J)诱导髓样细胞瘤的常见整合位点,其异常激活可能是ALV-J最重要的分子致病机制。为了鉴定c-myc反义RNA对c-myc基因表达的影响及其在ALV-J增殖中的作用,本研究通过cDNA末端快速扩增(RACE)技... 详细信息

原癌基因c-myc被鉴定为J亚群禽白血病病毒(ALV-J)诱导髓样细胞瘤的常见整合位点,其异常激活可能是ALV-J最重要的分子致病机制。为了鉴定c-myc反义RNA对c-myc基因表达的影响及其在ALV-J增殖中的作用,本研究通过cDNA末端快速扩增(RACE)技术、PCR扩增5’-race和3’-race后对其编码属性的分析鉴定结果显示,鸡c-myc原癌基因反义RNA全长621 bp,且不编码蛋白;该反义RNA序列定位于鸡2号染色体,且源自c-myc外显子3反向序列,因此将其命名为ch-MYC-AS1。将ch-MYC-AS1连接载体pcDNA3.1,构建真核表达质粒pcDNA3.1-ch-MYC-AS1,将其转染至鸡巨噬细胞细胞系HD11,培养48 h后利用荧光定量PCR和western blot检测ch-MYC-AS1过表达对c-myc表达的影响,结果显示,过表达ch-MYC-AS1可以显著抑制c-myc原癌基因在HD11中的表达。以MOI 5的ALV-J(JS09GY3株)感染HD11细胞4 h后,将pcDNA3.1-ch-MYC-AS1质粒转染该细胞,48 h后采用IDEXX禽白血病抗原检测试剂盒检测细胞上清中ALV-J p27蛋白的表达水平,结果显示过表达ch-MYC-S1显著减少细胞上清中ALV-J p27蛋白的表达;进一步通过荧光定量PCR、western blot检测过表达ch-MYC-AS1对ALV-J复制的影响,结果显示,ALV-J env基因mRNA转录水平和蛋白表达水平在ch-MYC-AS1转染后48 h的HD11细胞中均显著下调(P<0.01);利用间接免疫荧光技术检测DF-1细胞上清中ALV-J的病毒效价,结果显示:与对照组相比,HD11细胞上清中ALV-J的病毒效价在ch-MYC-AS1转染后48 h明显降低。上述结果表明过表达ch-MYC-AS1可以显著抑制ALV-J在HD11细胞中的增殖。本研究首次揭示了原癌基因c-myc反义RNA的抗病毒功能,为进一步探究c-myc基因在ALV-J致病机理中的作用提供了参考依据。

关键词： c-myc原癌基因反义RNA 禽白血病病毒巨噬细胞

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鸡巨噬细胞CCL4抗禽白血病病毒作用及其机制初探

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中国兽医学报 2021年第4期41卷 670-675页

作者：陈绪靖赵宗仪吉紫荆豆春峰吴挺陈世豪耿拓宇胡序明崔恒宓扬州大学动物科学与技术学院/表观遗传学及表观基因组学研究所江苏扬州225009 扬州大学教育部农业与农产品安全国际合作联合实验室江苏扬州225009

为了探究CCL4基因抗J亚群禽白血病病毒(ALV-J)的作用机制,观察了CCL4基因在ALV-J感染鸡巨噬细胞(HD11)不同时间(6,12,24,36,48h)后的表达规律,分别构建CCL4、ALV-J env、ALV-J GP85和ALV-J GP37真核表达载体并转染HD11细胞,通过RT-qPCR检测CCL4过表达对ALV-J复制水平及CCL4受体CCR5和其下游天然免疫相关基因及其他抗病毒基因的表达水平的影响,同时分析ALV-J env对CCL4基因表达的影响。结果显示:ALV-J感染HD11细胞后主要抑制CCL4表达(P<0.01);ALV-J env蛋白对CCL4有显著抑制作用(P<0.01);而过表达CCL4显著抑制了ALV-J病毒复制(P<0.01);CCL4可能通过激活抗病毒基因S100A9及其上、下游通路抑制ALV-J病毒增殖。本研究揭示了CCL4在病毒感染后巨噬细胞中的动态表达规律及其抗ALV-J作用,为今后研究CCL4的功能及其宿主遗传抗性奠定基础。

关键词： CCL4 巨噬细胞天然免疫 ALV-J

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ALV-J下调鸡MARCO转录水平拮抗宿主抗病毒天然免疫应答的研究

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扬州大学学报（农业与生命科学版） 2021年第2期42卷 46-51页

作者：陈绪靖吉紫荆赵宗仪豆春峰柴文娴陈世豪耿拓宇胡序明崔恒宓扬州大学动物科学与技术学院/表观遗传学及表观基因组学研究所/教育部农业与农产品安全国际合作联合实验室江苏扬州225009 常州市动物疫病预防控制中心江苏常州213002

为研究鸡巨噬细胞受体(MARCO)基因与J亚群禽白血病病毒(ALV-J)感染两者间的关联,先过表达ALV-J env基因不同结构域后通过RT-qPCR检测MARCO基因mRNA的转录水平,再构建MARCO真核表达载体并转染HD11细胞,通过RT-qPCR和Western blot检测MARC... 详细信息

为研究鸡巨噬细胞受体(MARCO)基因与J亚群禽白血病病毒(ALV-J)感染两者间的关联,先过表达ALV-J env基因不同结构域后通过RT-qPCR检测MARCO基因mRNA的转录水平,再构建MARCO真核表达载体并转染HD11细胞,通过RT-qPCR和Western blot检测MARCO过表达对ALV-J复制水平的影响,最后通过RT-qPCR检测MARCO过表达对巨噬细胞天然免疫相关基因TLR3和IFIH1转录水平的影响。结果表明:ALV-J env蛋白对MARCO基因mRNA转录水平有极显著抑制作用;过表达MARCO极显著抑制ALV-J病毒的复制;过表达MARCO后,TLR3和IFIH1基因mRNA转录水平均极显著上调。这一研究揭示了MARCO基因在ALV-J感染巨噬细胞后的动态转录水平规律及其抑制ALV-J增殖的功能,其可能通过诱导天然免疫基因TLR3、IFIH1高转录水平的途径来实现抗病毒作用,为今后研究MARCO的功能及治疗禽白血病提供了新的思路。

关键词： MARCO基因巨噬细胞天然免疫基因克隆 J亚群禽白血病病毒

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DNA甲基化抑制剂DAC处理对鸡Wnt10a基因表达及其启动子甲基化的影响

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扬州大学学报（农业与生命科学版） 2021年第1期42卷 1-6页

作者：吴挺陈绪靖陈世豪胡序明崔恒宓扬州大学动物科学与技术学院/表观遗传学及表观基因组学研究所江苏扬州225009 扬州大学教育部农业与农产品安全国际合作联合实验室江苏扬州225009 扬州大学江苏高校动物重要疫病与人兽共患病防控协同创新中心江苏扬州225009

Wnt10a基因在细胞增殖、分化及迁移中发挥着重要作用,参与调控机体生长发育的诸多生物学过程,但对鸡Wnt10a基因表达的表观遗传调控机制尚不清楚。为探究DNA甲基化对Wnt10a基因表达的影响,以DMSO处理为对照组,5-Aza-2’-deoxycytidine (D... 详细信息

Wnt10a基因在细胞增殖、分化及迁移中发挥着重要作用,参与调控机体生长发育的诸多生物学过程,但对鸡Wnt10a基因表达的表观遗传调控机制尚不清楚。为探究DNA甲基化对Wnt10a基因表达的影响,以DMSO处理为对照组,5-Aza-2’-deoxycytidine (DAC)处理为试验组,分别用0.25、0.5、1.0、2.5、5.0μmol·L^(-1)浓度的DAC处理鸡胚成纤维细胞DF-1,通过RT-qPCR分析比较Wnt10a基因在DAC和DMSO处理后的表达水平;同时通过NCBI数据获取Wnt10a启动子区序列,设计亚硫酸氢盐测序(BSP)引物,5.0μmol·L^(-1) DAC处理鸡胚成纤维细胞DF-1 48 h,焦磷酸测序分析鸡Wnt10a基因上游部分CpG位点的甲基化水平。结果表明:相对于DMSO处理,DAC处理Wnt10a基因表达量极显著上调,且上调幅度随DAC处理浓度的升高而升高;同时Wnt10a基因上游CpG位点甲基化水平显著下降。综合而言,DNA甲基化抑制剂DAC可显著降低鸡Wnt10a基因起始位点上游序列部分CpG位点的甲基化水平,并激活Wnt10a基因的表达。

关键词：鸡DF-1细胞 DAC Wnt10a基因基因表达量甲基化亚硫酸氢盐测序

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脐带间充质干细胞及其外泌体对宫颈癌HeLa细胞的作用初探

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扬州大学学报（农业与生命科学版） 2020年第4期41卷 54-58,70页

作者：吕达崔恒宓扬州大学动物科学与技术学院/表观遗传学及表观基因组学研究所江苏扬州225009 扬州大学教育部农业与农产品安全国际合作联合实验室江苏扬州225009

人脐带间充质干细胞是一种多能干细胞,可用于多种疾病的临床治疗。利用从人类脐带分离的间充质干细胞,以及从该间充质干细胞的培养液中分离提取的外泌体,通过与宫颈癌HeLa细胞共培养,研究间充质干细胞及其外泌体对HeLa细胞生物学表型的... 详细信息

人脐带间充质干细胞是一种多能干细胞,可用于多种疾病的临床治疗。利用从人类脐带分离的间充质干细胞,以及从该间充质干细胞的培养液中分离提取的外泌体,通过与宫颈癌HeLa细胞共培养,研究间充质干细胞及其外泌体对HeLa细胞生物学表型的影响。结果表明:脐带间充质干细胞共培养均极显著抑制HeLa细胞的增殖、迁移及侵袭等表型,并极显著促进HeLa细胞凋亡。脐带间充质干细胞来源的外泌体处理HeLa细胞后,细胞增殖、迁移及侵袭也同样受到极显著抑制,并极显著促进细胞凋亡。这一研究提示脐带间充质干细胞及其外泌体并未在体外培养条件下促进HeLa细胞的生长、迁移,相反对HeLa细胞的表型具有一定的抑制作用。

关键词：人脐带间充质干细胞外泌体 HeLa细胞抑癌作用

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DNA甲基转移酶N6AMT1基因敲降和过表达及其功能初探

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扬州大学学报（农业与生命科学版） 2019年第5期40卷 26-32页

作者：杨钰孙振薛松磊胡序明崔恒宓扬州大学动物科学与技术学院/表观遗传学及表观基因组学研究所江苏扬州225009 扬州大学教育部农业与农产品安全国际合作联合实验室江苏扬州225009

6mA甲基化是DNA甲基化修饰的一种重要方式,受甲基转移酶N6AMT1基因的调控。为研究N6AMT1基因的功能,利用CRISPR/Cas9基因编辑技术构建N6AMT1基因敲降的HEK293细胞系,同时在Hela细胞系中过表达N6AMT1基因,检测N6AMT1基因表达变化对细胞... 详细信息

6mA甲基化是DNA甲基化修饰的一种重要方式,受甲基转移酶N6AMT1基因的调控。为研究N6AMT1基因的功能,利用CRISPR/Cas9基因编辑技术构建N6AMT1基因敲降的HEK293细胞系,同时在Hela细胞系中过表达N6AMT1基因,检测N6AMT1基因表达变化对细胞增殖和迁移能力的影响。结果表明:正常肾上皮组织细胞系HEK293中N6AMT1基因表达水平显著高于癌细胞;正常肝细胞系LO2中N6AMT1基因表达水平显著高于肝癌细胞系HepG2和SMMC-7721;N6AMT1基因敲降显著增强HEK293细胞的增殖及迁移能力;而Hela细胞过表达N6AMT1基因后,细胞的增殖和迁移均显著受到抑制。这一研究提示N6AMT1基因介导的6mA甲基化可能对细胞增殖和迁移有重要影响。

关键词： DNA 6mA甲基化 N6AMT1基因 CRISPR/Cas9 肿瘤

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白来航鸡IFITM1基因表达规律分析及其对鸡内源性反转录病毒转录的影响

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扬州大学学报（农业与生命科学版） 2019年第3期40卷 34-40页

作者：豆春峰吴挺胡序明冯仕章陈绪靖王丽萍耿拓宇崔恒宓扬州大学动物科学与技术学院/表观遗传学及表观基因组学研究所江苏扬州225009 扬州大学比较医学研究院江苏扬州225009 扬州大学江苏高校动物重要疫病与人兽共患病防控协同创新中心/教育部农业与农产品安全国际合作联合实验室江苏扬州225009

IFITMs在天然免疫中发挥重要作用,抑制多种病毒复制。试验取5和30日龄白来航鸡心、肝、脾、胸腺和法氏囊,RT-qPCR检测其IFITM1基因的表达差异;用0.5μmol·L^-1 DNA甲基化酶抑制剂DAC处理鸡成纤维细胞CEF和鸡巨噬细胞HD11,RT-qPCR... 详细信息

IFITMs在天然免疫中发挥重要作用,抑制多种病毒复制。试验取5和30日龄白来航鸡心、肝、脾、胸腺和法氏囊,RT-qPCR检测其IFITM1基因的表达差异;用0.5μmol·L^-1 DNA甲基化酶抑制剂DAC处理鸡成纤维细胞CEF和鸡巨噬细胞HD11,RT-qPCR检测处理后IFITM1的表达水平;PCR扩增IFITM1基因CDS区克隆、测序,进而构建pcDNA3.1-IFITM1真核表达载体;将过表达载体转染至CEF和HD11细胞,RT-qPCR检测IFITM1过表达对鸡内源性反转录病毒ALVE1、OVEX1和EAV-HP转录的影响。结果表明:IFITM1基因在胸腺、法氏囊等免疫器官中的表达量高于心、肝和脾等非免疫器官,且随着日龄的增长,在胸腺中的表达量上升,而在法氏囊中的表达量下降;DAC处理后,IFITM1表达极显著上调;测序发现IFITM1基因CDS区大小为342bp;IFITM1过表达后,ALVE1、OVEX1在CEF和HD11细胞中转录均极显著下调,EAV-HP只在CEF细胞中极显著下调,而在HD11细胞中无显著变化。这一研究初步分析了鸡IFITM1基因的表达规律,构建了其真核表达载体,检测了其对鸡内源性反转录病毒转录的影响,为进一步研究其功能奠定了基础。

关键词：鸡 IFITM1基因内源性反转录病毒基因克隆真核表达

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中国动物传染病学报 2019年第3期27卷 22-26页

作者：豆春峰王芳胡序明欧阳娟陈世豪贾崇信薛松磊徐慧齐田羽耿拓宇崔恒宓扬州大学表观遗传学及表观基因组学研究所扬州225009 扬州大学动物科学和技术学院扬州225009 扬州大学兽医学院扬州225009 扬州大学比较医学研究院扬州225009 江苏高校动物重要疫病与人兽共患病防控协同创新中心扬州225009 教育部农业与农产品安全国际合作联合实验室扬州225009

本研究旨在探讨二甲双胍(metformin)处理对鸡巨噬细胞HD11天然免疫相关基因表达及禽白血病病毒(Avian leukosisvirus,ALV)复制水平的影响。用2mmol/L二甲双胍处理鸡巨噬细胞HD11,处理48h后收集细胞,荧光定量PCR(RT-qPCR)检测天然免疫基... 详细信息

本研究旨在探讨二甲双胍(metformin)处理对鸡巨噬细胞HD11天然免疫相关基因表达及禽白血病病毒(Avian leukosisvirus,ALV)复制水平的影响。用2mmol/L二甲双胍处理鸡巨噬细胞HD11,处理48h后收集细胞,荧光定量PCR(RT-qPCR)检测天然免疫基因和内源性反转录病毒的表达。另外,将J亚群禽白血病病毒(J subgroup Avian leukosis virus,ALV-J)(MOI=5)接种于细胞板中,病毒感染细胞24 h后进行二甲双胍处理, 48 h后收集HD11细胞和上清分别进行RT-qPCR检测和ELISA(enzyme linked immunosorbent assay)检测。结果表明,二甲双胍显著上调HD11细胞天然免疫相关基因TLR3(P<0.01)、IFIH1(P<0.01)、IRF7(P<0.01)、STAT1(P<0.05)、IFN-α(P<0.01)、IFN-β(P<0.01)表达水平,并激活了鸡内源性反转录病毒的表达,抑制ALV-J复制水平。综上,二甲双胍可激活鸡巨噬细胞的天然免疫反应,从而提高鸡抗禽白血病病毒的能力。本研究在体外实验中验证二甲双胍具有抑制ALV增殖的作用,对家禽业的疾病防控有一定的应用价值。

关键词：二甲双胍禽白血病毒天然免疫巨噬细胞

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