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江苏省遗传学会2017年学术研讨会——“技术创新与遗传学发展”

作者：袁曼曼张涛张向前李婷婷凌娇娇吴鹏飞王金玉施会强扬州大学动物科学与技术学院江苏省动物遗传繁育与分子设计重点实验室江苏京海集团

试验旨在研究参与激素调节并调控卵巢功能的可能基因,挑选候选基因G蛋白偶联受体1(Gprotein-coupledreceptor1),深入研究其是否参与激素调节。根据转录组测序获得的京海黄鸡GPR1基因的CDS序列设计一对引物,利用实时荧光定量RTPCR方法,检... 详细信息

试验旨在研究参与激素调节并调控卵巢功能的可能基因,挑选候选基因G蛋白偶联受体1(Gprotein-coupledreceptor1),深入研究其是否参与激素调节。根据转录组测序获得的京海黄鸡GPR1基因的CDS序列设计一对引物,利用实时荧光定量RTPCR方法,检测GPR1基因在高低产京海黄鸡卵巢组织中的表达情况,并与生物信息学进行关联,使用多种生物软件和在线工具对目的序列进行生物信息学分析,分析GPR1基因与其他物种的同源性、蛋白质的理化性质、蛋白质序列的跨膜区、亚细胞定位、亲水性、潜在的磷酸化位点、保守结构域及该基因所编码蛋白质的二级、三级结构。结果显示,京海黄鸡与GenBank中原鸡、人、牛、野猪、黑猩猩、家兔、马、绵羊、藏羚羊、大鼠、小鼠、斑马鱼的同源性分别为100.0%、69.0%、69.1%、69.3%、68.9%、69.6%、69.2%、68.8%、68.9%、67.5%、69.0%和50.3%;氨基酸分析发现GPR1蛋白为疏水性蛋白,分子质量为40.41ku,理论等电点为6.91,为7次跨膜蛋白;亚细胞定位显示,该蛋白属于非分泌蛋白;预测该蛋白含有25个潜在的磷酸化位点,1糖基化位点;二级结构以无规则卷曲为主,三级结构为7次跨膜螺旋结构;组织表达分析显示,GPR1基因在低产组的表达情况极显著高于高产组(P<0.01)。本试验结果将有利于GPR1基因功能的进一步分析,为进一步研究该基因对京海黄鸡产蛋性状的调控机理提供理论依据。

关键词：京海黄鸡 G蛋白偶联受体1 生物信息学分析蛋白组织表达

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WNT信号通路在鸡雄性生殖细胞分化过程中的调控作用研究

WNT信号通路在鸡雄性生殖细胞分化过程中的调控作用研究

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中国畜牧兽医学会家禽学分会第十八次全国家禽学术讨论会

作者：何娜娜王飞汪怡临张晨王颖洁李东左其生张亚妮李碧春扬州大学动物科学与技术学院江苏省动物繁育与分子设计重点实验室江苏扬州225009

本文旨在从基因水平上探究WNT信号通路在鸡雄性生殖细胞分化过程中的作用机制,为完善ESCs体外向雄性生殖细胞诱导分化体系提供依据.本研究通过构建靶向WNT信号通路上的关键基因Wnt5a的慢病毒干扰载体和过表达载体用于体内和体外实验.取... 详细信息

本文旨在从基因水平上探究WNT信号通路在鸡雄性生殖细胞分化过程中的作用机制,为完善ESCs体外向雄性生殖细胞诱导分化体系提供依据.本研究通过构建靶向WNT信号通路上的关键基因Wnt5a的慢病毒干扰载体和过表达载体用于体内和体外实验.取新鲜受精鸡胚,尖端注射Wnt5a-shRNA慢病毒,石蜡封口,正常孵化;同时取培养至2代的ESCs,在RA诱导的基础上侵染Wnt5a-shRNA慢病毒载体.同时通过细胞组织形态学观察、RT-qPCR、间接免疫荧光、流式细胞术、石蜡切片等方法进行检测,以研究WNT信号通路对鸡雄性生殖细胞分化的调控作用.在体内外实验中通过干扰Wnt5a信号分子的表达,从而显著下调WNT信号通路中地下游基因(AXin2、PKC和β-catenin),最终抑制鸡胚胎干细胞(ESCs)向雄性生殖细胞分化.WNT信号通路通过Wnt5a与下游分子共同调控信号传递,最终能够正向调控鸡ESCs向雄性生殖细胞分化过程.

关键词：鸡雄性生殖细胞细胞分化 WNT信号通路调控机制

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HSD3B2通过甾类激素合成通路调控鸡ESCs 向雄性生殖细胞分化

HSD3B2通过甾类激素合成通路调控鸡ESCs 向雄性生殖细胞分化

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江苏省畜牧兽医学会2017年学术年会

作者：张晨王曼何娜娜汪怡临赵瑞丰余昕健金晶左其生张亚妮李碧春扬州大学动物科学与技术学院江苏省动物繁育与分子设计重点实验室江苏扬州 225009

精原干细胞可以替代胚胎干细胞进行基因治疗和遗传操作而不涉及伦理道德,目前被广泛的应用和研究,但是对精原干细胞形成过程中具体的调控方式却少有研究. 目的：本研究旨在探索甾类激素合成通路在鸡雄性生殖细胞分化过程中的作用,为... 详细信息

精原干细胞可以替代胚胎干细胞进行基因治疗和遗传操作而不涉及伦理道德,目前被广泛的应用和研究,但是对精原干细胞形成过程中具体的调控方式却少有研究. 目的：本研究旨在探索甾类激素合成通路在鸡雄性生殖细胞分化过程中的作用,为构建鸡雄性生殖细胞分化调控网络提供理论依据. 方法：体外RA诱导生殖细胞分化模型中分别对HSD3B2进行干扰和过表达处理,荧光倒置显微镜观察不同处理组在诱导过程中细胞形态变化;并通过荧光定量PCR,间接免疫荧光,流式细胞分选方法检测雄性生殖细胞在不同分组中标记基因的表达和形成情况.同时在鸡胚正常孵化过程中通过胚盘注射方法对HSD3B2进行干扰和过表达处理研究甾类激素合成通路在鸡雄性生殖细胞分化过程中的作用. 结果：体外诱导模型中,干扰HSD3B2能够显著降低下游基因CYP1A1、UGT1A1和HSD17B7表达(P＜0.01),抑制甾类激素合成通路,过表达则出现相反结果;激活甾类激素合成通路能够促进SSC-like细胞生成,Cvh、Stra8、intergrinα6等生殖标记基因表达量显著上调(P＜0.01),intergrinα6+细胞率(7.39％±0.224)显著多于对照组(4.20％±0.235),反之,则抑制SSC-like形成;鸡胚盘注射实验中,激活甾类激素合成通路,与对照组相比显著提高Cvh、Stra8、intergrinα6等生殖标记基因表达量(P＜0.01),孵化18.5d后,intergrinα6+细胞率(46.6±0.360)显著的高于对照组(44％±0.343);反之,则出现相反的结果. 结论：本研究实验结果表明HSD3B2基因调节甾类激素合成通路信号转导,正向调节鸡雄性生殖细胞分化.

关键词：鸡胚胎干细胞雄性生殖细胞细胞分化甾类激素

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HSD3B2通过甾类激素合成通路调控ESCs向雄性生殖细胞分化

HSD3B2通过甾类激素合成通路调控ESCs向雄性生殖细胞分化

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中国畜牧兽医学会家禽学分会第十八次全国家禽学术讨论会

作者：张晨王曼何娜娜汪怡临赵瑞丰余昕健金晶左其生张亚妮李碧春扬州大学动物科学与技术学院江苏省动物繁育与分子设计重点实验室江苏扬州225009

本研究旨在探索睾酮所在的甾类激素合成通路在鸡雄性生殖细胞分化过程中的作用机制,为构建鸡雄性生殖细胞分化调控网络提供理论依据.本实验利用睾酮对鸡胚胎干细胞(ESCs)进行诱导实验;再通过对睾酮所在甾类激素合成信号通路中关键基因HS... 详细信息

本研究旨在探索睾酮所在的甾类激素合成通路在鸡雄性生殖细胞分化过程中的作用机制,为构建鸡雄性生殖细胞分化调控网络提供理论依据.本实验利用睾酮对鸡胚胎干细胞(ESCs)进行诱导实验;再通过对睾酮所在甾类激素合成信号通路中关键基因HSD3B2进行干扰或过表达,阻断或增强信号传导后进行体内外的qRT-PCR、流式细胞分析、间接免疫荧光检测生殖标记基因的表达.结果表明,睾酮作为甾类激素合成信号通路的产物能诱导ESCs的分化;甾类激素合成通路分析结果表明干扰HSD3B2后,下游基因CYP1A1、UGT1A1和HSD17B7表达减少,甾类激素合成通路信号传导受阻;过表达HSD3B2,信号传导增强.qRT-PCR、免疫荧光以及流式细胞分析表明干扰甾类激素合成信号通路抑制ESCs的分化;增强信号转导促进ESCs的分化.HSD3B2能够通过甾类激素合成信号通路调节鸡ESCs向雄性生殖细胞的分化.

关键词：鸡胚胎干细胞雄性生殖细胞细胞分化甾类激素合成通路

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HSD3B2通过甾类激素合成通路调控鸡雄性生殖细胞形成

HSD3B2通过甾类激素合成通路调控鸡雄性生殖细胞形成

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中国畜牧兽医学会家禽学分会第十八次全国家禽学术讨论会

作者：张晨王曼何娜娜汪怡临赵瑞丰余昕健金晶左其生张亚妮李碧春扬州大学动物科学与技术学院/江苏省动物繁育与分子设计重点实验室江苏扬州225009

1引言精原干细胞可以替代胚胎干细胞进行基因治疗和遗传操作而不涉及伦理道德，目前被广泛的应用和研究，但是对精原干细胞形成过程中具体的调控方式却少有研究。本研究旨在探索甾类激素合成通路在鸡雄性生殖细胞分化过程中的作用，为... 详细信息

1引言精原干细胞可以替代胚胎干细胞进行基因治疗和遗传操作而不涉及伦理道德，目前被广泛的应用和研究，但是对精原干细胞形成过程中具体的调控方式却少有研究。本研究旨在探索甾类激素合成通路在鸡雄性生殖细胞分化过程中的作用，为构建鸡雄性生殖细胞分化调控网络提供理论依据。

关键词：鸡雄性生殖细胞甾类激素通路 HSD3B2 分化

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JNK 信号通路在鸡雄性生殖细胞分化过程中的调控作用

JNK 信号通路在鸡雄性生殖细胞分化过程中的调控作用

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江苏省畜牧兽医学会2017年学术年会

作者：王颖洁张文慧金晶何娜娜左其生李碧春张亚妮扬州大学动物科学技术学院江苏省动物遗传繁育与分子设计重点实验室江苏扬州 225009

目的：本研究旨在通过体内外实验探讨了JNK信号通路在鸡胚胎干细胞(Embryonic stem cells,ESCs)向雄性生殖细胞分化过程中的作用. 方法：利用前期转录取测序筛选出JNK信号通路中的关键信号分子MAPK8,构建其干扰及过表达载体,并检测... 详细信息

目的：本研究旨在通过体内外实验探讨了JNK信号通路在鸡胚胎干细胞(Embryonic stem cells,ESCs)向雄性生殖细胞分化过程中的作用. 方法：利用前期转录取测序筛选出JNK信号通路中的关键信号分子MAPK8,构建其干扰及过表达载体,并检测其活性;取培养至2代的雄性ESCs,在RA诱导的基础上干扰或过表达MAPK8,分别收集体外诱导4d及10d的细胞样品,通过QRT-PCR、间接免疫荧光、流式分析等方法对生殖细胞特异表达的基因及蛋白表达水平进行检测;取刚受精的新鲜鸡胚,血管注射MAPK8干扰载体和过表达载体,正常孵化,分别收集鸡胚体内发育4.5d的生殖嵴样本和18d睾丸样本,并通过QRT-PCR、Western Blot等方法对生殖细胞特异表达的基因及蛋白表达水平进行检测。结果：体外诱导实验发现:干扰组的ESC在诱导4d后产生的类PGCs样细胞数量及10d后产生的精原样生殖细胞数量均显著的低于RA诱导组;qRT-PCR结果显示RA诱导过程中生殖标记基因integrinα6,integrinβ1持续上调表达,而sh-MAPK8组的生殖标记基因表达水平未发生显著变化;间接免疫荧光结果和流式细胞分选也表明:过表达组第4d的CVH阳性细胞及第10d产生的integrinα6阳性细胞数目显著高于对照组和干扰组.在体内试验中干扰组载体能够在鸡胚中稳定表达,且能够显著下调MAPK8基因的表达,且影响睾丸发育,而第4d PAS结果亦显示干扰组的PGCs数量显著低于正常孵化组;荧光定量实验结果也表明:在体内情况下抑制MAPK8基因的表达,能够显著的抑制CVH,Ckit,integrinα6,integrinβ1基因的表达。结论：JNK信号通路参与调控鸡ESCs向雄性生殖细胞分化的过程,本文为初步构建鸡雄性生殖细胞分化的调控网络,揭示生殖细胞形成机制提供实验基础.

关键词：鸡雄性生殖细胞细胞分化应激活化蛋白激酶

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鸡性别分化候选基因功能的研究

鸡性别分化候选基因功能的研究

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中国畜牧兽医学会家禽学分会第十八次全国家禽学术讨论会

作者：靳锴左其生张亚妮李碧春江苏省动物遗传繁育与分子设计重点实验室扬州大学动物科学技术学院江苏扬州225009

1引言性别分化一直以来都是遗传学、发育生物学和畜牧学等多领域的研究热点，尤其是动物的性别与某些经济性状有着直接或间接的关系，了解和掌握性别分化机制具有重要的经济意义。目前鸟类关于性别分化方面的研究鲜有报道，禽类的性别... 详细信息

1引言性别分化一直以来都是遗传学、发育生物学和畜牧学等多领域的研究热点，尤其是动物的性别与某些经济性状有着直接或间接的关系，了解和掌握性别分化机制具有重要的经济意义。目前鸟类关于性别分化方面的研究鲜有报道，禽类的性别分化机制仍不清楚。与此同时，单性化养殖在提高家禽的生产效率和养殖产量方面具有重要的应用前景，其成功开展需要成熟的性别控制技术作为基础，但是对家禽的性别分化机制的了解仍然处于初步阶段，因此开发有效的性别控制技术实现大规模养殖仍然存在很大难度。

关键词：鸡生殖细胞性别分化基因表达高通量测序

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京海黄鸡G蛋白偶联受体1基因生物信息学及组织表达分析

京海黄鸡G蛋白偶联受体1基因生物信息学及组织表达分析

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江苏省遗传学会2017年学术研讨会

作者：袁曼曼张涛张向前李婷婷凌娇娇吴鹏飞王金玉施会强扬州大学动物科学与技术学院扬州225009 江苏省动物遗传繁育与分子设计重点实验室扬州225009 江苏京海集团南通226103

试验旨在研究参与激素调节并调控卵巢功能的可能基因,挑选候选基因G 蛋白偶联受体1(G protein-coupled receptor 1),深入研究其是否参与激素调节.根据转录组测序获得的京海黄鸡GPR1 基因的CDS 序列设计一对引物,利用实时荧光定量RTPCR... 详细信息

试验旨在研究参与激素调节并调控卵巢功能的可能基因,挑选候选基因G 蛋白偶联受体1(G protein-coupled receptor 1),深入研究其是否参与激素调节.根据转录组测序获得的京海黄鸡GPR1 基因的CDS 序列设计一对引物,利用实时荧光定量RTPCR 方法,检测GPR1 基因在高低产京海黄鸡卵巢组织中的表达情况,并与生物信息学进行关联,使用多种生物软件和在线工具对目的序列进行生物信息学分析,分析 GPR1 基因与其他物种的同源性、蛋白质的理化性质、蛋白质序列的跨膜区、亚细胞定位、亲水性、潜在的磷酸化位点、保守结构域及该基因所编码蛋白质的二级、三级结构.结果显示,京海黄鸡与GenBank 中原鸡、人、牛、野猪、黑猩猩、家兔、马、绵羊、藏羚羊、大鼠、小鼠、斑马鱼的同源性分别为100.0％、69.0％、69.1％、69.3％、68.9％、69.6％、69.2％、68.8％、68.9％、67.5％、69.0％和50.3％;氨基酸分析发现 GPR1 蛋白为疏水性蛋白,分子质量为40.41 ku,理论等电点为6.91,为7 次跨膜蛋白;亚细胞定位显示,该蛋白属于非分泌蛋白;预测该蛋白含有25 个潜在的磷酸化位点,1 糖基化位点;二级结构以无规则卷曲为主,三级结构为7 次跨膜螺旋结构;组织表达分析显示,GPR1 基因在低产组的表达情况极显著高于高产组(P<0.01).本试验结果将有利于GPR1 基因功能的进一步分析,为进一步研究该基因对京海黄鸡产蛋性状的调控机理提供理论依据.

关键词：京海黄鸡 G蛋白偶联受体1 生物信息学分析蛋白组织表达

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蛋白质代谢通路对鸡雄性生殖细胞分化的调控

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中国农业科学 2016年第24期49卷 4814-4823页

作者：李东汤贝贝王颖洁纪艳芹王飞路镇宇王曼张亚妮李碧春扬州大学动物科学与技术学院/江苏省动物繁育与分子设计重点实验室

【目的】探究蛋白质代谢在鸡雄性生殖细胞分化过程中的作用机制,为完善鸡胚胎干细胞(embryonic stem cell,ESC)体外向雄性生殖细胞诱导分化体系研究提供依据。【方法】采用流式分选的方法获取高纯度的ESC、原始生殖细胞(primordial germ... 详细信息

【目的】探究蛋白质代谢在鸡雄性生殖细胞分化过程中的作用机制,为完善鸡胚胎干细胞(embryonic stem cell,ESC)体外向雄性生殖细胞诱导分化体系研究提供依据。【方法】采用流式分选的方法获取高纯度的ESC、原始生殖细胞(primordial germ cells,PGCs)和精原干细胞(spermatogonia stem cell,SSCs),分别提取细胞的总RNA,采用RNA-Seq方法对3种细胞的转录本进行深度测序,然后进行WEGO(web gene ontology)和KEGG(kyoto encyclopedia of genes and genomes)通路富集分析,筛选出鸡雄性生殖细胞分化过程中参与蛋白质代谢的关键通路及其关键基因,RT-q PCR(Real time Quantitative PCR)检测部分关键差异基因的表达变化,并与RNA-Seq(RNA sequencing)结果进行比较分析,同时分别从体内和体外水平对关键基因NOS2进行抑制,观察各分组不同天数的细胞形态变化及检测NOS2和C-kit、Cvh、Stra8、Dazl、integrinα6和integrinβ1等生殖标记基因表达变化情况。【结果】在雄性生殖细胞分化的整个阶段,有697个差异基因参与生物代谢,显著富集于精氨酸-脯氨酸代谢通路、酪氨酸代谢通路以及色氨酸代谢通路,在这3条通路上筛选出NOS2、FAH和IDO等关键性基因,这些基因的在ESCs向SSCs分化过程中表达变化趋势与其在RNA-Seq中的结果一致。体内抑制NOS2基因后,NOS2及C-kit、Cvh、Stra8、Dazl、integrinα6和integrinβ1等生殖标记基因在空白组和对照组之间无显著性的差异,而在抑制剂组中,NOS2及C-kit、Cvh、Stra8、Dazl、integrinα6和integrinβ1等生殖标记基因的m RNA表达量均出现了降低;而体外抑制NOS2基因后,对照组中的ESCs在2、4、6、8和10d内细胞不断增殖,但是未出现类胚体;RA诱导组中,2d出现小的类胚体,4d类胚体增大,且数量增多,6d类胚体边缘开始出现破裂,8d类胚体解体,10d出现类精原样细胞;抑制剂组中,ESCs在2、4、6、8和10d内无类胚体出现,且相较于对照组细胞增殖缓慢;RA+抑制剂组中,2和4d内无类胚体出现,细胞增殖缓慢,6d出现小的类胚体,8d类胚体数量少量增多,且体积稍显增大,10d类胚体开始裂解。并且经过抑制剂的抑制后,NOS2及C-kit、Cvh、Stra8、Dazl、integrinα6和integrinβ1等生殖标记基因的表达量在RA诱导组、抑制剂组和RA+抑制剂组中相对于对照组均呈显著性或极显著性的下调趋势。【结论】基于RNA-Seq技术及生物信息学方法筛选出ESCs向雄性生殖细胞分化过程中精氨酸-脯氨酸代谢通路及关键基因NOS2的基础上,通过对NOS2基因在鸡体内和体外的抑制,发现NOS2在被抑制后,ESCs向雄性生殖细胞分化的过程受到抑制。说明了精氨酸-脯氨酸代谢通路及关键基因NOS2对ESCs向雄性生殖细胞分化过程中起到重要的调节作用。

关键词： RNA-Seq 鸡胚胎干细胞原始生殖细胞精原干细胞雄性生殖细胞一氧化氮合成酶2 抑制剂分化

来源：评论

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miRNA-34基因家族进化分析及其在鹅生殖周期内的表达变化

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畜牧兽医学报 2016年第2期47卷 260-267页

作者：刘然张惠子云皓琪陈阳黄正洋张扬徐琪陈国宏扬州大学动物科学与技术学院扬州225009 江苏省动物遗传繁育与分子设计重点实验室扬州225009

旨在探明miRNA-34基因家族(miRNA-34s)系统进化历程及其在鹅生殖周期内的表达变化规律。通过文献和miRBase数据库检索脊椎动物的miRNA-34s序列,利用Ensembl数据库信息,确定miRNA-34s在基因组中的位置,采用MEGA 6.0构建miRNA-34s的系统... 详细信息

旨在探明miRNA-34基因家族(miRNA-34s)系统进化历程及其在鹅生殖周期内的表达变化规律。通过文献和miRBase数据库检索脊椎动物的miRNA-34s序列,利用Ensembl数据库信息,确定miRNA-34s在基因组中的位置,采用MEGA 6.0构建miRNA-34s的系统进化树;并利用RT-qPCR检测鹅卵巢组织miRNA-34s在生殖周期内的表达变化。结果在脊椎动物中共搜索70余条miRNA-34s序列,miRNA-34s3个成员(miRNA-34a、miRNA-34b和miRNA-34c)在脊椎动物中分布广泛,高度保守,均位于基因间隔区(Intergenic region,IGR),且miRNA-34b和miRNA-34c两个基因位于同一染色体上,在进化过程中紧密相连,可能是由于串联重复所致。RTqPCR检测结果显示,miRNA-34s3个成员在鹅的开产前期、排卵期、排卵后期和就巢期卵巢组织中表现出相同趋势的表达,即在排卵期、排卵后期表达水平高于或显著高于开产前期和就巢期。miRNA-34家族在进化中高度保守,且在调控鹅生殖周期中发挥一定的作用。

关键词：鹅 miRNA-34 进化定量表达

来源：评论

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