本研究旨在检测CREPT(cell-cycle related and expression-elevated protein in tumor)基因的组织表达特异性,克隆其编码区并构建重组载体转染DF-1(D fibroblast-1,DF-1)细胞并制备多克隆抗体,为初步研究鸡(Gallus gallus)CREPT基因参...
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本研究旨在检测CREPT(cell-cycle related and expression-elevated protein in tumor)基因的组织表达特异性,克隆其编码区并构建重组载体转染DF-1(D fibroblast-1,DF-1)细胞并制备多克隆抗体,为初步研究鸡(Gallus gallus)CREPT基因参与调控细胞周期的生物学功能提供理论依据。以鸡生殖嵴cDNA为模板扩增CREPT基因CDS区,并对该基因进行了蛋白质结构预测和组织表达谱分析。将该基因与pcDNA3.1和pEGFP-N1载体相连获得重组表达载体pcDNA3.1-CREPT和pEGFP-CREPT之后,转染鸡DF-1细胞,并采用基因免疫法制备CREPT基因多克隆抗体并检测效价,利用qRT-PCR检测过表达CREPT基因后DF-1细胞内相关基因的表达情况。生物信息学分析发现,鸡CREPT编码区序列总长978bp,编码325个氨基酸,该氨基酸序列中存在一个RPR结构域(regulation of nuclear pre-m RNA domain)和卷曲结构域;以原鸡(***)CDS序列为模板成功克隆的如皋黄鸡(***)CREPT基因长978 bp,测序结果准确,与原鸡CDS序列一致,同源性100%;组织表达谱分析显示,CREPT在睾丸、卵巢和大脑中m RNA表达量较高(P<0.01),而在肠组织(P<0.01)、骨骼肌(P<0.05)和脾脏(P<0.05)中的m RNA表达量较低;成功构建重组表达载体pcDNA3.1-CREPT和pEGFP-CREPT;转染融合表达载体pEGFP-CREPT后显示,CREPT表达于DF-1细胞质中;使用基因免疫法制备多克隆抗体血清,免疫荧光检测(immunogen fluorescent assay,IFA)检测显示,制备的多克隆抗体最佳效价为1∶10,Western blot证实,pcDNA3.1-CREPT真核表达载体成功表达且抗血清效果良好,qPCR检测结果表明,pcDNA3.1-CREPT载体能够在DF-1上过表达CREPT基因,并引起细胞周期调控相关基因p15RS(P15 related gene on G1/S progression)、转录因子4(transcription factor 4,TCF4)、细胞周期蛋白D1(cyclinD1)和β-链蛋白(b-catein)的表达变化。本研究成功克隆了鸡CREPT基因,并制备了具有特异性的多克隆抗体,该基因在DF-1细胞质中表达,CREPT基因的表达能下调p15RS基因的表达(P<0.01),上调TCF4(P<0.05)、cyclinD1(P<0.01)和b-catein(P<0.01)的表达,该研究结果为进一步研究鸡CREPT基因的生物学功能提供了理论依据。
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