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柔嫩艾美耳球虫感染对京海黄鸡不同组织中Zyxin、CD4和TNFRSF1A基因mRNA表达的影响

畜牧兽医学报 2014年第8期45卷 1369-1374页

作者：孙明明林雨鑫戴国俊张菁菁张跟喜谢恺舟王金玉顾玉萍王永娟扬州大学动物科学与技术学院扬州225009 江苏省动物遗传繁育与分子设计重点实验室扬州225009 江苏京海禽业集团有限公司海门226103

为了探讨Zyxin、CD4、TNFRSF1A 3个球虫抗性相关基因在雏鸡感染柔嫩艾美耳球虫后表达量的变化,本研究以京海黄鸡为试验动物,对感染柔嫩艾美耳球虫雏鸡的10个组织进行了荧光定量分析,结果发现,Zyxin、CD4、TNFRSF1A基因在感染柔嫩艾美耳... 详细信息

为了探讨Zyxin、CD4、TNFRSF1A 3个球虫抗性相关基因在雏鸡感染柔嫩艾美耳球虫后表达量的变化,本研究以京海黄鸡为试验动物,对感染柔嫩艾美耳球虫雏鸡的10个组织进行了荧光定量分析,结果发现,Zyxin、CD4、TNFRSF1A基因在感染柔嫩艾美耳球虫后的雏鸡多数组织中表达量变化较大。感染组Zyxin基因在腺胃、小肠等组织表达量较高,除肺、肝、肾和心肌组织外,Zyxin基因表达量均极显著高于对照组(P<0.01);感染组雏鸡CD4基因在脾、肺、胸腺等免疫器官中的表达量极显著高于对照组(P<0.01);感染后TNFRSF1A基因在小肠和盲肠中表达量最高,且感染组小肠、盲肠、脾、腺胃和胸腺中的表达量与对照组差异也极显著(P<0.01)。但法氏囊中3个基因的表达量均较低,且仅Zyxin基因差异显著,提示法氏囊在球虫感染过程中可能并未起到重要作用。鸡柔嫩艾美耳球虫主要寄生在盲肠组织中,Zyxin和TNFRSF1A基因在感染后的盲肠组织中表达量的极显著升高(P<0.01),说明这2个基因与鸡球虫的感染关系密切,可能在雏鸡感染过程中起重要作用。

关键词：感染柔嫩艾美耳球虫基因表达京海黄鸡

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pEGFP-hTERT转染鸡胚胎干细胞建系的研究

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畜牧兽医学报 2014年第8期45卷 1253-1259页

作者：黄晓梅张蕾左其生施青青李东汤贝贝张亚妮宋九州李碧春扬州大学动物科学与技术学院江苏省动物繁育与分子设计重点实验室扬州225009 Animal and Avian Science Dept. University of Maryland College Park md20742

本研究旨在通过构建重组质粒pEGFP-hTERT转染鸡胚胎干细胞(Chicken embryonic stem cells,cESCs),优化鸡胚胎干细胞培养体系,以期构建鸡胚胎干细胞株或细胞系。在获得hTERT基因后,构建重组质粒pEGFPhTERT,并利用FuGENE^(?)HD转染鸡成纤... 详细信息

本研究旨在通过构建重组质粒pEGFP-hTERT转染鸡胚胎干细胞(Chicken embryonic stem cells,cESCs),优化鸡胚胎干细胞培养体系,以期构建鸡胚胎干细胞株或细胞系。在获得hTERT基因后,构建重组质粒pEGFPhTERT,并利用FuGENE^(?)HD转染鸡成纤维细胞(DF-1),转染24 h后,荧光显微镜检测;再以80%BRL-CM(大鼠肝细胞条件培养基)与20%的ES基础培养液混合的条件培养基培养分离的cES:s,添加10μmol·L^(-1)维生素C,AKP染色以及相关表面抗原SSEA-1、SOX2和OCT4检测鉴定后,以G418筛选pEGFP-hTERT转染的cES:s,传代培养后荧光定量PCR检测相关干性基因的表达水平。结果表明:维生素C可以促进cESCs增殖,pEGFP—hTERT转染的DF-1细胞中可以检测到绿色荧光表达,pEGFP—hTERT转染的cESCs可持续传至10代以上,且仍保持未分化状态,干细胞表面特异性抗原检测呈阳性,且相关干性基因的表达水平差异不显著(P>0.05)。综上表明:pEGFP-hTERT转染的cESCs在80%BRL-CM结合外源因子的作用下,能够持续稳定传至10代且仍保持未分化状态,可应用于鸡胚胎干细胞的永生化和细胞系建立。

关键词： pEGFP-hTERT hTERT基因 BRL-CM 鸡胚胎干细胞

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高效液相色谱荧光检测法同时检测鸡血浆中阿莫西林和氨苄西林残留

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中国兽医学报 2014年第9期34卷 1501-1506页

作者：孙礼瑞赵敏谢恺舟郭辉生李爱华谢星王剑锋倪海球张跟喜戴国俊王金玉扬州大学动物科学与技术学院江苏扬州225009 江苏省动物遗传繁育与分子设计重点实验室江苏扬州225009 南京农业大学动物医学院江苏南京210095

建立高效液相色谱荧光法同时检测鸡血浆中阿莫西林和氨苄西林的残留量。鸡血浆经乙腈提取,饱和二氯甲烷萃取,酸性条件下水杨醛沸水浴衍生化后,以0.01mol/L的磷酸二氢钾溶液（A）和乙腈溶液（B）为流动相,梯度洗脱,流速为1.0mL/min,荧光... 详细信息

建立高效液相色谱荧光法同时检测鸡血浆中阿莫西林和氨苄西林的残留量。鸡血浆经乙腈提取,饱和二氯甲烷萃取,酸性条件下水杨醛沸水浴衍生化后,以0.01mol/L的磷酸二氢钾溶液（A）和乙腈溶液（B）为流动相,梯度洗脱,流速为1.0mL/min,荧光检测激发波长为354nm,发射波长为445nm。阿莫西林和氨苄西林线性范围均为5.0~5 000.0μg/L,线性关系良好（r=0.999 9,0.999 6）。当阿莫西林和氨苄西林添加水平均为5.0~125.0mg/L时,鸡血浆样品平均回收率均高于74.72%,相对标准偏差（RSD）均低于8.65%,日内相对标准偏差分别低于4.99%和10.60%,日间相对标准偏差分别低于7.98%和11.29%。测定鸡血浆样品中AMO的检测限（LODs）为2.0μg/L（S/N=3）、定量限（LOQs）为5.0μg/L（S/N=10）,AMP的检测限为1.0μg/L（S/N=3）、定量限为2.5μg/L（S/N=10）。该方法操作简便、快速,且结果精确、灵敏、可靠,可适用于鸡血浆中阿莫西林、氨苄西林同时提取和检测。

关键词：高效液相色谱阿莫西林氨苄西林荧光检测法

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京海黄鸡甲状腺激素应答蛋白Spot14α基因外显子1多态性与屠体和腹脂性状的相关性分析

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中国畜牧兽医 2014年第7期41卷 169-174页

作者：薛倩王金玉张跟喜王亚男唐莹魏岳施会强扬州大学动物科学与技术学院江苏扬州225009 江苏省动物遗传繁育与分子设计重点实验室江苏扬州225009 江苏京海集团江苏南通226103

本研究旨在寻找甲状腺激素应答蛋白Spot14α(thyroid hormone responsive Spot14α,THRSPα)基因的多态位点,并分析其对京海黄鸡屠体和腹脂性状产生的影响。针对THRSPα基因外显子区,利用PCR-SSCP结合测序技术对379只140日龄京海黄鸡进... 详细信息

本研究旨在寻找甲状腺激素应答蛋白Spot14α(thyroid hormone responsive Spot14α,THRSPα)基因的多态位点,并分析其对京海黄鸡屠体和腹脂性状产生的影响。针对THRSPα基因外显子区,利用PCR-SSCP结合测序技术对379只140日龄京海黄鸡进行SNP检测,结果发现,该基因第1外显子区存在9bp插入缺失多态位点,形成3种基因型:AA、AB和BB,2种等位基因:A、B,基因频率分别为0.4485、0.5515。相关分析结果表明,该位点对京海黄鸡140日龄活重、屠体性状(包括屠体重、头重、脚重、翅重、胸肌重、腿肌重、全净膛重、半净膛重)和腹脂性状均没有显著影响(P>0.05)。因此推断该多态位点在京海黄鸡分子辅助标记育种中不能作为屠体和腹脂性状筛选的候选分子辅助标记。

关键词：甲状腺激素应答蛋白Spot14a基因外显子多态性京海黄鸡屠体和腹脂性状

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京海黄鸡促性腺激素释放激素受体基因密码子特性分析

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中国畜牧兽医 2014年第12期41卷 7-15页

作者：张涛王文浩张跟喜王金玉樊庆灿韩昆鹏唐莹王永娟扬州大学动物科学与技术学院江苏扬州225009 江苏省动物遗传繁育与分子设计重点实验室江苏扬州225009 江苏京海集团江苏南通226103

为了了解鸡促性腺激素释放激素受体(gonadotropin releasing hormone receptor,GnRHR)基因的密码子特性,以便于为GnRHR基因的表达选择合适的外源表达系统,本研究使用在线工具CUSP、CHIPS及CodonW软件对鸡GnRHR基因的密码子特性进行分析... 详细信息

为了了解鸡促性腺激素释放激素受体(gonadotropin releasing hormone receptor,GnRHR)基因的密码子特性,以便于为GnRHR基因的表达选择合适的外源表达系统,本研究使用在线工具CUSP、CHIPS及CodonW软件对鸡GnRHR基因的密码子特性进行分析,并与鸡、模式动物基因组和其他动物GnRHR基因密码子特性进行比较。结果显示,京海黄鸡GnRHR基因的ENc值较小,具有较强的密码子偏好性,且偏好以G/C结尾的密码子,GnRHR基因CDS序列中,GC含量大于AT含量;CodonW软件计算结果表明,京海黄鸡GnRHR基因密码子中,密码子GCC、ATC、CTC、CTG、CGC、CGG、AGC、TCC和GTG(RSCU>2)偏好性较强,且均以G/C结尾。对31条鸡基因分析表明鸡偏好密码子中有12种G/C结尾的密码子。与大肠杆菌、酵母菌和小鼠基因组密码子使用频率比较显示,京海黄鸡GnRHR基因密码子偏好性与3种生物相差很大,不适合进行外源表达。与其他动物GnRHR基因密码子偏好性比较显示,禽类GnRHR基因偏好含有或以G/C结尾的密码子,而其他物种的GnRHR基因无强烈的偏好性。聚类分析结果表明,亲缘关系近的物种之间倾向于拥有相同的密码子偏好性。

关键词：京海黄鸡促性腺激素释放激素受体基因密码子偏好性

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京海黄鸡肌细胞生成素基因的克隆和生物信息学分析

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中国畜牧兽医 2014年第8期41卷 1-8页

作者：张涛张跟喜王金玉樊庆灿王文浩魏岳陈学森唐莹王永娟扬州大学动物科学与技术学院江苏扬州225009 江苏省动物遗传繁育与分子设计重点实验室江苏扬州225009 江苏京海集团江苏南通226103

本试验根据GenBank中公布的原鸡肌细胞生成素(myogenin,MyoG)基因序列设计1对引物,采用RT-PCR方法,从京海黄鸡肌肉组织中克隆MyoG基因的编码区序列,并使用多种生物软件和在线工具对目的序列进行生物信息学分析,分析MyoG基因与其他物种... 详细信息

本试验根据GenBank中公布的原鸡肌细胞生成素(myogenin,MyoG)基因序列设计1对引物,采用RT-PCR方法,从京海黄鸡肌肉组织中克隆MyoG基因的编码区序列,并使用多种生物软件和在线工具对目的序列进行生物信息学分析,分析MyoG基因与其他物种的同源性、蛋白质的理化性质、蛋白质序列的跨膜区、亚细胞定位、亲水性、潜在的磷酸化位点、保守结构域及该基因编码蛋白的二级结构和三级结构。最终获得了包括编码区在内的长754bp的MyoG基因序列,生物信息学分析显示,京海黄鸡MyoG基因的保守性较低,与GenBank中原鸡、火鸡、鹌鹑、马、人、野猪、牛、山羊、大鼠、绵羊的同源性分别为99.7%、94.4%、92.0%、70.0%、70.0%、73.3%、69.0%、67.9%、67.8%、73.5%;氨基酸分析发现,MyoG蛋白为水溶性蛋白,分子质量为25854u,理论等电点为5.46,不属于跨膜蛋白;亚细胞定位显示,大部分蛋白位于细胞质内,不属于分泌蛋白;预测含有6个潜在的磷酸化位点,1段碱性序列,1段HLH序列,1段低复杂度序列;二级结构以无规则卷曲为主,三级结构显示MyoG蛋白的结构域呈螺旋状。

关键词：京海黄鸡肌细胞生成素克隆生物信息学分析

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兔IL-10基因外显子4突变对蛋白结构和功能的影响

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中国兽医杂志 2014年第8期50卷 10-12,49页

作者：万小颖冒留留沈杰秦立志施丽娟王文洲潘雨来吴信生扬州大学动物科学与技术学院江苏扬州225009 江苏省动物遗传繁育与分子设计重点实验室江苏扬州225009 江苏省金陵种兔场江苏南京210041

本研究针对兔IL-10基因外显子4中的碱基突变,运用生物信息学比较分析野生型和突变型蛋白的理化性质和结构。结果表明,外显子4中碱基T的插入并未改变IL-10蛋白的理化性质、二硫键、跨膜结构、信号肽、糖基化位点以及二级结构,但是导致磷... 详细信息

本研究针对兔IL-10基因外显子4中的碱基突变,运用生物信息学比较分析野生型和突变型蛋白的理化性质和结构。结果表明,外显子4中碱基T的插入并未改变IL-10蛋白的理化性质、二硫键、跨膜结构、信号肽、糖基化位点以及二级结构,但是导致磷酸化位点减少、三级结构改变,从而影响IL-10蛋白的功能并可能对机体疾病的抗病性产生影响。

关键词： IL-10基因外显子4 碱基突变蛋白结构功能

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肌细胞生成素基因多态性对京海黄鸡繁殖性状的遗传效应研究

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中国畜牧兽医 2014年第4期41卷 170-174页

作者：唐莹王金玉张跟喜葛莹薛倩王亚男王永娟扬州大学动物科学与技术学院江苏扬州225009 江苏省动物遗传繁育与分子设计重点实验室江苏扬州225009 江苏京海集团江苏南通226103

本研究旨在探讨肌细胞生成素(myogenin,MyoG)基因多态性与鸡繁殖性状间的相关性。以378只京海黄鸡为研究对象,采用PCR-SSCP技术研究MyoG基因外显子的多态性。运用最小二乘法分析这些突变位点形成的基因型与京海黄鸡繁殖性状间的相关性... 详细信息

本研究旨在探讨肌细胞生成素(myogenin,MyoG)基因多态性与鸡繁殖性状间的相关性。以378只京海黄鸡为研究对象,采用PCR-SSCP技术研究MyoG基因外显子的多态性。运用最小二乘法分析这些突变位点形成的基因型与京海黄鸡繁殖性状间的相关性。结果表明,MyoG基因外显子1上存在1个G102A突变,外显子3上存在1个T36C突变,分别形成基因型AA、AB、BB和CC、CD、DD。关联分析结果显示,基因型AA、AB和BB在京海黄鸡繁殖性状上无显著差异(P>0.05);基因型CC和DD在京海黄鸡开产体重上存在显著差异(P<0.05),在其余性状上各基因型差异均不显著(P>0.05)。因此,推测MyoG基因对京海黄鸡的繁殖性状无显著影响,为探索鸡育种过程中的标记辅助选择提供参考资料。

关键词：肌细胞生成素基因多态性京海黄鸡繁殖性状相关性

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京海黄鸡促性腺激素释放激素1基因克隆与原核表达研究

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中国畜牧兽医 2014年第5期41卷 94-98页

作者：张涛王金玉张跟喜王文浩魏岳陈学森唐莹王永娟扬州大学动物科学与技术学院江苏扬州225009 江苏省动物遗传繁育与分子设计重点实验室江苏扬州225009 江苏京海集团江苏南通226103

本试验根据GenBank公布的原鸡（Gallusgallus）促性腺激素释放激素1（gonadotropinreleasinghormone1，GnRH1）基因mRNA序列设计1对引物，采用RT—PCR方法，从京海黄鸡下丘脑组织克隆GnRHl基因编码区序列，对其进行生物信息学分析，并... 详细信息

本试验根据GenBank公布的原鸡（Gallusgallus）促性腺激素释放激素1（gonadotropinreleasinghormone1，GnRH1）基因mRNA序列设计1对引物，采用RT—PCR方法，从京海黄鸡下丘脑组织克隆GnRHl基因编码区序列，对其进行生物信息学分析，并构建原核表达载体pET32a—GnRH1，在大肠杆菌BL21感受态细胞中表达。最终获得了包括编码区、大部分启动子区和部分3’区域在内的长度为352bp京海黄鸡GnRH1基因序列，该核酸序列与火鸡、鸽子、人、牛、野猪、山羊、绵羊、藏羚羊、马和大鼠的GnRH1基因序列同源性分别为93％、81％、54％、58％、61％、76％、76％、59％、76％和66％。酶切测序鉴定结果显示，成功构建了原核表达载体pET32aGnRH1；SDS-PAGE检测结果显示，构建的重组质粒在大肠杆菌BL21感受态细胞中成功表达，分子质量为25～28ku，且上清表达量高于沉淀；Westernblotting检测结果显示，在大肠杆菌BL21感受态细胞中表达的蛋白为目的蛋白，且主要为可溶性表达。结果表明，成功克隆了京海黄鸡GnRH1基因，构建了GnRH1原核表达体系，并成功表达目的蛋白，为后续相关研究打下了基础。

关键词：京海黄鸡促性腺激素释放激素1 克隆原核表达

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卵泡刺激素诱导鸡胚胎干细胞向雄性生殖细胞分化的研究

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中国家禽 2014年第13期36卷 10-15页

作者：蒋一秀许厚强左其生张蕾李东施青青张亚妮李碧春贵州大学动物科学学院高原山地动物遗传育种与繁殖省部共建教育部重点实验室贵州贵阳550025 扬州大学动物科学与技术学院江苏省动物繁育与分子设计重点实验室江苏扬州225009

文章探讨了卵泡刺激素(FSH)诱导鸡胚胎干细胞(ESCs)向雄性生殖细胞分化的作用效果。首先对FSH的适宜诱导浓度进行筛选,再将传至2代的ESCs,在RA和支持细胞诱导的基础上添加适宜浓度的FSH进行诱导,通过形态学观察、实时荧光定量PCR及免疫... 详细信息

文章探讨了卵泡刺激素(FSH)诱导鸡胚胎干细胞(ESCs)向雄性生殖细胞分化的作用效果。首先对FSH的适宜诱导浓度进行筛选,再将传至2代的ESCs,在RA和支持细胞诱导的基础上添加适宜浓度的FSH进行诱导,通过形态学观察、实时荧光定量PCR及免疫细胞化学对诱导结果进行检测。筛选出适宜的FSH浓度为25 ng/mL。单独使用FSH诱导,未出现类SSCs样细胞;FSH与支持细胞诱导至第6天出现类胚体,至第12天,出现少量精原样细胞;FSH联合支持细胞和维甲酸(RA)进行诱导,至第2天出现类胚体,第12天出现类SSC样细胞。实时荧光定量PCR结果显示,FSH+支持细胞组、FSH+支持细胞+RA组中,Stra8、integrinβ1、Dazl表达量都持续上调,ESCs标记基因Nanog、Sox2表达量均呈持续下调趋势。添加FSH的诱导组中Stra8的表达量相对于各对照组上调显著。FSH单独诱导不能引起ESCs向雄性生殖细胞分化,但具有促进支持细胞和RA诱导ESCs向雄性生殖细胞分化的作用效果,该结果为进一步研究雄性生殖细胞的形成和调控机制提供理论基础。

关键词：鸡胚胎干细胞雄性生殖细胞分化卵泡刺激素

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