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中国动物传染病学报 2023年

作者：王陈君郭旺吴慧显崔恒宓柴文娴胡序明扬州大学动物科学与技术学院/表观遗传学及表观基因组学研究所常州市动物疫病预防控制中心

巨噬细胞是机体天然免疫的重要组成部分，最新研究发现内源性反转录病毒产生的转录物（如非编码RNA）在巨噬细胞抵抗病毒感染的过程中发挥着重要作用。前期研究发现鸡内源性反转录病毒ALVE衍生的env转录物受到ALV-J感染调控，但ALVE en... 详细信息

巨噬细胞是机体天然免疫的重要组成部分，最新研究发现内源性反转录病毒产生的转录物（如非编码RNA）在巨噬细胞抵抗病毒感染的过程中发挥着重要作用。前期研究发现鸡内源性反转录病毒ALVE衍生的env转录物受到ALV-J感染调控，但ALVE env转录物在鸡巨噬细胞中是否具有抗ALV-J功能及其作用机制目前尚不清楚。本文首先通过定量PCR、western blot、ELISA和TCID50实验检测ALVE env转录物过表达对ALV-J感染复制影响，结果发现ALVE env转录物显著抑制ALV-J在鸡巨噬细胞HD11中的感染复制水平。为了进一步明确ALVE env转录物的抗ALV-J能力，通过干扰实验发现降低ALVE env转录物表达会显著促进ALV-J在HD11细胞中的感染复制水平。机制上，ALVE env转录物通过调控抗病毒免疫基因表达来干扰ALV-J感染复制。过表达ALVE env转录物显著上调dsRNA识别受体基因（MARCO、TLR3和IFIH1）和I型干扰素基因（IFN-α和IFN-β）在HD11细胞中表达；相反，干扰 ALVE env转录物会抑制这些抗病毒免疫基因的表达。本研究揭示了鸡内源性反转录病毒衍生的env转录物在巨噬细胞中的抗病毒作用机制，为解析鸡内源性反转录病毒在家禽抗病毒免疫中的生物学功能以及家禽抗病育种研究提供理论基础和参考依据。

关键词：内源性反转录病毒 env转录物禽白血病病毒鸡巨噬细胞

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G0S2抑制ALV-J在鸡巨噬细胞中增殖

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扬州大学学报（农业与生命科学版） 2023年第5期44卷 65-70页

作者：吴慧显郭旺朱姝桐王陈君骆欢崔恒宓柴文娴胡序明扬州大学动物科学与技术学院/表观遗传学及表观基因组学研究所江苏扬州225009 常州市动物疫病预防控制中心江苏常州213002

G0/G1期开关基因2(G0/G1 switch 2,G0S2)在脂肪稳态、细胞增殖和肿瘤发生等生物学过程中扮演着重要角色,而有关G0S2基因在家禽抗病毒免疫中的研究相对甚少。为探讨G0S2基因在鸡巨噬细胞中的抗病毒作用及其机制,构建G0S2真核表达载体并... 详细信息

G0/G1期开关基因2(G0/G1 switch 2,G0S2)在脂肪稳态、细胞增殖和肿瘤发生等生物学过程中扮演着重要角色,而有关G0S2基因在家禽抗病毒免疫中的研究相对甚少。为探讨G0S2基因在鸡巨噬细胞中的抗病毒作用及其机制,构建G0S2真核表达载体并转染鸡巨噬细胞系HD11细胞,通过荧光定量PCR和Western blot检测G0S2过表达对J亚群禽白血病病毒(ALV-J)复制水平、天然免疫基因TLR3和糖酵解关键调控基因MYC表达的影响。结果表明:G0S2过表达可显著抑制ALV-J在HD11细胞中增殖。G0S2显著上调HD11细胞内双链RNA(dsRNA)识别受体基因TLR3表达,并抑制糖酵解调控基因MYC表达,说明激活TLR3表达和抑制MYC表达可能是G0S2基因抑制ALV-J在巨噬细胞中增殖的重要机制。综上,该研究揭示了鸡G0S2在巨噬细胞中的抗病毒功能及其作用机制,为今后研究G0S2的功能及其宿主遗传抗性提供了参考依据。

关键词：鸡 G0S2 禽白血病病毒巨噬细胞

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长非编码RNA lnc-ALVE1-AS1抑制ALV-J在鸡巨噬细胞中增殖

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中国动物传染病学报 2024年第1期32卷 18-25页

作者：柴文娴骆欢金松王姣罗坚强洪雅琴耿拓宇崔恒宓胡序明常州市动物疫病预防控制中心常州213002 扬州大学动物科学与技术学院/表观遗传学及表观基因组学研究所扬州225009 扬州大学教育部农业与农产品安全国际合作联合实验室扬州225009

研究表明,源自内源性反转录病毒的长非编码RNA可能是巨噬细胞抗病毒免疫反应的重要组成部分。鸡内源性反转录病毒衍生的长非编码RNA lnc-ALVE1-AS1与宿主遗传抗性有关,能够激活非免疫细胞抗病毒天然免疫反应。为进一步探讨lnc-ALVE1-AS... 详细信息

研究表明,源自内源性反转录病毒的长非编码RNA可能是巨噬细胞抗病毒免疫反应的重要组成部分。鸡内源性反转录病毒衍生的长非编码RNA lnc-ALVE1-AS1与宿主遗传抗性有关,能够激活非免疫细胞抗病毒天然免疫反应。为进一步探讨lnc-ALVE1-AS1在鸡巨噬细胞中的抗病毒作用及其机制,本研究通过荧光定量PCR发现lnc-ALVE1-AS1在ALV-J感染鸡巨噬细胞系HD11后24 h显著下调。进一步通过lnc-ALVE1-AS1过表达实验证实,lnc-ALVE1-AS1可以显著抑制ALV-J在HD11细胞中增殖。机制上,lnc-ALVE1-AS1显著上调HD11细胞dsRNA识别受体(TLR3)、Ⅰ型干扰素(IFN-α和IFN-β)和其他抗病毒天然免疫基因(IRF7、MX1、OASL和IFITM3)表达。然而,干扰TLR3或者抑制TLR3信号后lnc-ALVE1-AS1诱导Ⅰ型干扰素(IFN-α和IFN-β)的能力显著减弱。共聚焦定位分析显示在HD11细胞中lnc-ALVE1-AS1可以与TLR3蛋白直接结合。这说明激活TLR3信号可能是lnc-ALVE1-AS1抑制ALV-J在巨噬细胞中增殖的一个重要机制。本研究揭示了lnc-ALVE1-AS1在巨噬细胞中抗病毒功能及其作用机制,为抗病育种研究提供了新的遗传基础。

关键词：内源性反转录病毒 lnc-ALVE1-AS1 禽白血病病毒鸡巨噬细胞

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长非编码RNA lnc-ALVE1-AS1与禽白血病病毒抗性和易感品系鸡相关性分析

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中国动物传染病学报 2023年第4期31卷 26-32页

作者：柴文娴骆欢陈绪靖陈世豪耿拓宇崔恒宓胡序明常州市动物疫病预防控制中心常州213002 扬州大学动物科学与技术学院表观遗传学及表观基因组学研究所扬州225009 扬州大学教育部农业与农产品安全国际合作联合实验室扬州225009

内源性反转录病毒是长非编码RNA的重要来源,在抗病毒先天性免疫中发挥重要作用。鸡内源性反转录病毒衍生的长非编码RNA lnc-ALVE1-AS1能够激活细胞免疫功能并抑制禽白血病病毒增殖。为进一步探讨lnc-ALVE1-AS1在ALV抗性和易感品系鸡中... 详细信息

内源性反转录病毒是长非编码RNA的重要来源,在抗病毒先天性免疫中发挥重要作用。鸡内源性反转录病毒衍生的长非编码RNA lnc-ALVE1-AS1能够激活细胞免疫功能并抑制禽白血病病毒增殖。为进一步探讨lnc-ALVE1-AS1在ALV抗性和易感品系鸡中的表达规律及其与禽白血病病毒抗性的相关性,本研究通过荧光定量PCR发现,lnc-ALVE1-AS1在ALV抗性(G1)品系鸡免疫器官(胸腺、脾脏和法氏囊)和CEF细胞中的表达水平显著高于ALV易感(G3)品系鸡。病毒感染实验表明lnc-ALVE1-AS1在ALVJ感染CEF(G1和G3来源)细胞24h和96h后均显著下调;但是,lnc-ALVE1-AS1在G3来源CEF细胞中的表达水平下降更为明显,且ALVJ病毒复制水平显著高于G1鸡来源的CEF细胞。进一步通过lnc-ALVE1-AS1过表达实验证实,lnc-ALVE1-AS1不仅可以显著上调G3来源CEF细胞dsRNA识别受体(TLR3和IFIH1)和抗病毒天然免疫基因(IFI27-L2、IFIT5、IFITM3、IFN-β、ISG12-2和RASD2)表达,还显著抑制ALVJ复制。本研究揭示了lnc-ALVE1-AS1在禽白血病病毒抗性和易感品系鸡细胞和免疫组织器官中的表达规律和抗病毒功能,为抗病育种研究提供了新的遗传基础。

关键词：内源性反转录病毒 lnc-ALVE1-AS1 禽白血病病毒鸡胚成纤维细胞

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鸡c-myc原癌基因反义RNA的鉴定及其抗ALV-J能力的分析

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中国预防兽医学报 2022年第1期44卷 59-65页

作者：骆欢张瑾麒朱姝桐柴文娴陈绪靖陈世豪耿拓宇崔恒宓胡序明扬州大学动物科学与技术学院/表观遗传学及表观基因组学研究所江苏扬州225009 扬州大学教育部农业与农产品安全国际合作联合实验室江苏扬州225009 常州市动物疫病预防控制中心江苏常州213002

原癌基因c-myc被鉴定为J亚群禽白血病病毒(ALV-J)诱导髓样细胞瘤的常见整合位点,其异常激活可能是ALV-J最重要的分子致病机制。为了鉴定c-myc反义RNA对c-myc基因表达的影响及其在ALV-J增殖中的作用,本研究通过cDNA末端快速扩增(RACE)技... 详细信息

原癌基因c-myc被鉴定为J亚群禽白血病病毒(ALV-J)诱导髓样细胞瘤的常见整合位点,其异常激活可能是ALV-J最重要的分子致病机制。为了鉴定c-myc反义RNA对c-myc基因表达的影响及其在ALV-J增殖中的作用,本研究通过cDNA末端快速扩增(RACE)技术、PCR扩增5’-race和3’-race后对其编码属性的分析鉴定结果显示,鸡c-myc原癌基因反义RNA全长621 bp,且不编码蛋白;该反义RNA序列定位于鸡2号染色体,且源自c-myc外显子3反向序列,因此将其命名为ch-MYC-AS1。将ch-MYC-AS1连接载体pcDNA3.1,构建真核表达质粒pcDNA3.1-ch-MYC-AS1,将其转染至鸡巨噬细胞细胞系HD11,培养48 h后利用荧光定量PCR和western blot检测ch-MYC-AS1过表达对c-myc表达的影响,结果显示,过表达ch-MYC-AS1可以显著抑制c-myc原癌基因在HD11中的表达。以MOI 5的ALV-J(JS09GY3株)感染HD11细胞4 h后,将pcDNA3.1-ch-MYC-AS1质粒转染该细胞,48 h后采用IDEXX禽白血病抗原检测试剂盒检测细胞上清中ALV-J p27蛋白的表达水平,结果显示过表达ch-MYC-S1显著减少细胞上清中ALV-J p27蛋白的表达;进一步通过荧光定量PCR、western blot检测过表达ch-MYC-AS1对ALV-J复制的影响,结果显示,ALV-J env基因mRNA转录水平和蛋白表达水平在ch-MYC-AS1转染后48 h的HD11细胞中均显著下调(P<0.01);利用间接免疫荧光技术检测DF-1细胞上清中ALV-J的病毒效价,结果显示:与对照组相比,HD11细胞上清中ALV-J的病毒效价在ch-MYC-AS1转染后48 h明显降低。上述结果表明过表达ch-MYC-AS1可以显著抑制ALV-J在HD11细胞中的增殖。本研究首次揭示了原癌基因c-myc反义RNA的抗病毒功能,为进一步探究c-myc基因在ALV-J致病机理中的作用提供了参考依据。

关键词： c-myc原癌基因反义RNA 禽白血病病毒巨噬细胞

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工程化haPD-1外泌体的制备及功能初步鉴定

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扬州大学学报(农业与生命科学版) 2024年第6期45卷 65-73页

作者：齐田羽陈磊孙振崔恒宓扬州大学动物科学与技术学院/表观遗传学及表观基因组学研究所江苏扬州225009 江苏易诺维生物医学研究院南京211100

为阻断免疫细胞上PD-1与肿瘤细胞上PD-L1结合,阻止免疫逃逸,以利免疫细胞识别并杀伤肿瘤细胞,目前已开发多种单抗药物,但均不可避免地出现副作用或治疗效率不高等问题。为解决这些问题,用慢病毒载体将高亲和PD-1片段(haPD-1)与跨膜蛋白L... 详细信息

为阻断免疫细胞上PD-1与肿瘤细胞上PD-L1结合,阻止免疫逃逸,以利免疫细胞识别并杀伤肿瘤细胞,目前已开发多种单抗药物,但均不可避免地出现副作用或治疗效率不高等问题。为解决这些问题,用慢病毒载体将高亲和PD-1片段(haPD-1)与跨膜蛋白LAMP2B信号肽序列融合,转入HEK293T细胞,使其在膜上分泌表达haPD-1的外泌体,这些外泌体可竞争性地结合肿瘤细胞表面PD-L1,同时拥有自身免疫原性低、可长时间稳定存在的优点。结果表明:haPD-1基因被成功转染至HEK293T细胞;通过细胞上清分离的外泌体经检测符合外泌体特征,并与PD-L1具有良好的亲和力,在体外可被PD-L1阳性HepG2细胞摄取,并可提高NK细胞对PD-L1阳性HepG2肝癌细胞的杀伤力。综上,表达haPD-1的工程化外泌体可能具有类似于PD-L1单抗的功能,可与肿瘤细胞表面的PD-L1结合,阻止肿瘤细胞的免疫逃逸,可应用于肿瘤的免疫治疗。

关键词：外泌体 PD-1 PD-L1 haPD-1 免疫逃逸抗肿瘤

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过表达NAMPT脐带间充质干细胞外泌体的抗衰老作用

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扬州大学学报（农业与生命科学版） 2021年第4期42卷 1-6页

作者：周琦琦孙振刘洋洋李华玲崔恒宓扬州大学动物科学与技术学院/表观遗传学及表观基因组学研究所江苏扬州225009 江苏易诺维生物医学研究院南京211102 扬州大学医学院江苏扬州225009

NAMPT是NAD+补救合成途径的限速酶,具有抗衰老作用。外泌体是一种包含蛋白质、miRNA、mRNA、lncRNA等内容物的天然内源性载体。利用慢病毒方法构建NAMPT过表达的人脐带间充质干细胞系,获得过表达NAMPT脐带间充质干细胞外泌体,随后通过... 详细信息

NAMPT是NAD+补救合成途径的限速酶,具有抗衰老作用。外泌体是一种包含蛋白质、miRNA、mRNA、lncRNA等内容物的天然内源性载体。利用慢病毒方法构建NAMPT过表达的人脐带间充质干细胞系,获得过表达NAMPT脐带间充质干细胞外泌体,随后通过与人皮肤成纤维细胞共培养和饲喂秀丽隐杆线虫,研究过表达NAMPT脐带间充质干细胞外泌体对其抗衰老的影响。结果表明:基因修饰后脐带间充质干细胞及其外泌体内NAMPT蛋白含量显著升高,并能促进人皮肤成纤维细胞增殖和延缓人皮肤成纤维细胞衰老;同时能延长秀丽隐杆线虫寿命和增加秀丽隐杆线虫抗氧化能力。这一研究提示过表达NAMPT基因的间充质干细胞外泌体具有一定的抗衰老作用。

关键词：人脐带间充质干细胞外泌体 NAMPT 人皮肤成纤维细胞秀丽隐杆线虫

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鸡巨噬细胞CCL4抗禽白血病病毒作用及其机制初探

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中国兽医学报 2021年第4期41卷 670-675页

作者：陈绪靖赵宗仪吉紫荆豆春峰吴挺陈世豪耿拓宇胡序明崔恒宓扬州大学动物科学与技术学院/表观遗传学及表观基因组学研究所江苏扬州225009 扬州大学教育部农业与农产品安全国际合作联合实验室江苏扬州225009

为了探究CCL4基因抗J亚群禽白血病病毒(ALV-J)的作用机制,观察了CCL4基因在ALV-J感染鸡巨噬细胞(HD11)不同时间(6,12,24,36,48h)后的表达规律,分别构建CCL4、ALV-J env、ALV-J GP85和ALV-J GP37真核表达载体并转染HD11细胞,通过RT-qPCR检测CCL4过表达对ALV-J复制水平及CCL4受体CCR5和其下游天然免疫相关基因及其他抗病毒基因的表达水平的影响,同时分析ALV-J env对CCL4基因表达的影响。结果显示:ALV-J感染HD11细胞后主要抑制CCL4表达(P<0.01);ALV-J env蛋白对CCL4有显著抑制作用(P<0.01);而过表达CCL4显著抑制了ALV-J病毒复制(P<0.01);CCL4可能通过激活抗病毒基因S100A9及其上、下游通路抑制ALV-J病毒增殖。本研究揭示了CCL4在病毒感染后巨噬细胞中的动态表达规律及其抗ALV-J作用,为今后研究CCL4的功能及其宿主遗传抗性奠定基础。

关键词： CCL4 巨噬细胞天然免疫 ALV-J

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ALV-J下调鸡MARCO转录水平拮抗宿主抗病毒天然免疫应答的研究

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扬州大学学报（农业与生命科学版） 2021年第2期42卷 46-51页

作者：陈绪靖吉紫荆赵宗仪豆春峰柴文娴陈世豪耿拓宇胡序明崔恒宓扬州大学动物科学与技术学院/表观遗传学及表观基因组学研究所/教育部农业与农产品安全国际合作联合实验室江苏扬州225009 常州市动物疫病预防控制中心江苏常州213002

为研究鸡巨噬细胞受体(MARCO)基因与J亚群禽白血病病毒(ALV-J)感染两者间的关联,先过表达ALV-J env基因不同结构域后通过RT-qPCR检测MARCO基因mRNA的转录水平,再构建MARCO真核表达载体并转染HD11细胞,通过RT-qPCR和Western blot检测MARC... 详细信息

为研究鸡巨噬细胞受体(MARCO)基因与J亚群禽白血病病毒(ALV-J)感染两者间的关联,先过表达ALV-J env基因不同结构域后通过RT-qPCR检测MARCO基因mRNA的转录水平,再构建MARCO真核表达载体并转染HD11细胞,通过RT-qPCR和Western blot检测MARCO过表达对ALV-J复制水平的影响,最后通过RT-qPCR检测MARCO过表达对巨噬细胞天然免疫相关基因TLR3和IFIH1转录水平的影响。结果表明:ALV-J env蛋白对MARCO基因mRNA转录水平有极显著抑制作用;过表达MARCO极显著抑制ALV-J病毒的复制;过表达MARCO后,TLR3和IFIH1基因mRNA转录水平均极显著上调。这一研究揭示了MARCO基因在ALV-J感染巨噬细胞后的动态转录水平规律及其抑制ALV-J增殖的功能,其可能通过诱导天然免疫基因TLR3、IFIH1高转录水平的途径来实现抗病毒作用,为今后研究MARCO的功能及治疗禽白血病提供了新的思路。

关键词： MARCO基因巨噬细胞天然免疫基因克隆 J亚群禽白血病病毒

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利用CRISPR/Cas9技术构建永生化脐带间充质干细胞系及MYC-AS1转基因研究

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扬州大学学报（农业与生命科学版） 2021年第3期42卷 1-9页

作者：李洪强刘洋洋孙振崔恒宓扬州大学生物科学与技术学院/表观遗传学及表观基因组学研究所江苏扬州225009 扬州大学教育部农业与农产品国际合作联合实验室江苏扬州225009 江苏易诺维生物医学研究院南京211102

人脐带间充质干细胞(hMSCs)是一种具有多向分化潜能的多能干细胞,在组织修复和某些疾病治疗的临床应用上发挥着重要作用。利用CRISPR/Cas9技术在腺相关病毒AAVS1位点插入具有磷酸甘油酸激酶PGK启动子和SV40-polyA的SV40 LT基因,使hMSCs... 详细信息

人脐带间充质干细胞(hMSCs)是一种具有多向分化潜能的多能干细胞,在组织修复和某些疾病治疗的临床应用上发挥着重要作用。利用CRISPR/Cas9技术在腺相关病毒AAVS1位点插入具有磷酸甘油酸激酶PGK启动子和SV40-polyA的SV40 LT基因,使hMSCs达到永生化。并利用慢病毒构建具有抑癌作用的反义长链非编码RNA MYC-AS1转基因的hMSCs,从该细胞系的培养液中分离提取表达MYC-AS1的外泌体。通过处理肝癌HepG2细胞,研究外泌体对HepG2表型的影响。结果表明:与野生型MSCs相比,永生化细胞MSCs-SV40增殖显著加快,但其定向分化特性并未改变,可在体外稳定传代超过40代,且未发现成瘤性。MYC-AS1转基因hMSCs的外泌体能表达MYC-AS1,且显著抑制HepG2肿瘤细胞的增殖和迁移。这一研究通过CRISPR/Cas9技术敲入SV40 LT基因成功构建了hMSCs,其MYC-AS1转基因细胞的外泌体对HepG2肿瘤细胞具有明显的抑制作用,这对hMSCs及其外泌体的基础研究和临床应用研究具有重要意义。

关键词：脐带间充质干细胞 CRISPR/Cas9技术永生化外泌体 MYC-AS1

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