检索结果-内蒙古大学图书馆

2015中国遗传学会大会

作者：孙振崔恒宓扬州大学表观遗传学和表观基因组学研究所扬州大学动物科学与技术学院

甲基化是表观遗传学的重要研究领域之一。在DNA中,甲基化主要表现形式为5-甲基胞嘧啶(m5C),并分布于CpG位点上。大量研究表明,DNA中m5C修饰在基因表达调控、基因印记、转座子沉默、X染色体失活以及癌症发生等重要生物学过程起到关键的... 详细信息

甲基化是表观遗传学的重要研究领域之一。在DNA中,甲基化主要表现形式为5-甲基胞嘧啶(m5C),并分布于CpG位点上。大量研究表明,DNA中m5C修饰在基因表达调控、基因印记、转座子沉默、X染色体失活以及癌症发生等重要生物学过程起到关键的作用。近年来,研究发现RNA m5C也是一种重要的表观遗传学修饰。有多种实验室方法,包括Bisulfite-sequencing、MeRIP、Aza-IP和miCLIP在转录组水平对这一甲基化修饰进行了定位分析,发现m5C在mRNA和ncRNA中一种普遍的修饰。然而,当前的研究方法主要局限在RNA m5C修饰的定性分析,即只定位不定量,这在研究RNA m5C修饰的功能时会有一定的局限性。Bisulfite-pyrosequencing是当前在DNA中应用较为成熟的m5C精确定位定量分析技术,我们将这一方法进行了改进,使之适用于RNA m5C修饰的检测。在两种人细胞HepG2和293T中,我们对一种功能性lncRNAH19进行了m5C修饰分析。结果发现C1709位点在两种细胞中表现出差异性修饰,在HepG2中基本没有甲基化,而在293T中有72%表现为甲基化,暗示不同环境下lncRNA H19 m5C修饰水平的差异可能使其具有不同的功能。另外,结果证实DNA中用于m5C修饰位点的分析方法也适用于RNA中m5C修饰的分析,为进一步研究RNAm5C的功能提供了技术参考。

关键词： RNA甲基化 5-甲基胞嘧啶 H19 Bisulfite-pyrosequencing

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诱导表达Cas9小鼠胚胎干细胞的建立及其应用

诱导表达Cas9小鼠胚胎干细胞的建立及其应用

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2015中国遗传学会大会

作者：韩笑刘洋洋袁君婷崔恒宓扬州大学表观遗传学和表观基因组学研究所扬州大学动物科学与技术学院

随着功能基因组学研究的深入发展,基因编辑技术逐渐成为基因功能研究的重要手段。早期基于同源重组的基因编辑技术效率极低。近些年来,随着CRISPR/Cas9技术的出现,基因编辑迈进了新的时代。利用gRNA进行定位,引导Cas9蛋白精确定位进行剪... 详细信息

随着功能基因组学研究的深入发展,基因编辑技术逐渐成为基因功能研究的重要手段。早期基于同源重组的基因编辑技术效率极低。近些年来,随着CRISPR/Cas9技术的出现,基因编辑迈进了新的时代。利用gRNA进行定位,引导Cas9蛋白精确定位进行剪切DNA,产生双链缺口并启动DNA的自我修复机制。在修复的同时有一定的机率插入或者删除碱基,达到编辑基因的目的。胚胎干细胞的基因编辑包括基因敲除和基因插入。如果能让胚胎干细胞有条件表达Cas9,这将使胚胎干细胞应用于CRISPR/Cas9系统的基因编辑更加方便。本研究通过CRISPR/Cas9系统介导的同源重组,建立稳定表达Cas9蛋白的小鼠胚胎干细胞系,以提高应用CRISPR/Cas9技术在胚胎干细胞中进行基因编辑的效率,并实现高效多个位点的同时编辑。为了降低Cas9剪切DNA的脱靶率,使用Cas9 nickase(Cas9n)在DNA双链上分别产生缺口,精确的剪切DNA。在随后DNA损伤修复中,构建的Puro-Cas9n donor和M2rtTA donor载体通过同源重组将Cas9n基因整合到小鼠胚胎干细胞的ROSA26基因位点。该位点(又称为Rβgeo26位点)位于小鼠基因组第6号染色体,基因敲入对细胞及小鼠的健康无副作用,并能保证转入基因的正常稳定表达。通过四环素诱导Cas9n的表达,启动剪切功能,形成DSB并启动DNA修复机制,将Cas9n和M2rtTA基因同源重组进ROSA26位点,并通过Southern blot分析同源重组率,通过qRT-PCR分析Cas9n蛋白确定是否表达(不加四环素作为对照),以获取Cas9n和M2rtTA基因同时插入的单克隆细胞株。选择多个感兴趣的目的基因的gRNA进行多个基因的同时编辑,72h后提取老鼠胚胎干细胞的基因组DNA,用T7核酸内切酶处理,计算不同基因的编辑效率。

关键词：同源重组 CRISPR/Cas9 多位点基因编辑 ROSA26

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禽内源性反转录病毒ALVE1LTR转录水平分析

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中国动物传染病学报 2015年第5期23卷 27-31页

作者：胡序明朱文奇陈世豪刘洋洋孙振耿拓宇宋成义高波秦爱建崔恒宓扬州大学表观遗传学及表观基因组学研究所扬州225009 扬州大学动物科学和技术学院扬州225009 扬州大学教育部禽类预防医学重点实验室扬州225009 江苏省动物重要疫病与人兽共患病防控协同创新中心扬州225009

本研究以禽内源性反转录病毒ALVE1为研究对象,分析了ALVE1长末端重复序列(long terminal repeat,LTR)自身转录的变化规律。荧光定量PCR结果显示LTR在2日龄SPF鸡(发育早期)器官组织中转录水平高,而在35日龄SPF鸡(发育晚期)器官组织中转... 详细信息

本研究以禽内源性反转录病毒ALVE1为研究对象,分析了ALVE1长末端重复序列(long terminal repeat,LTR)自身转录的变化规律。荧光定量PCR结果显示LTR在2日龄SPF鸡(发育早期)器官组织中转录水平高,而在35日龄SPF鸡(发育晚期)器官组织中转录水平低。焦磷酸测序和荧光定量PCR关联分析发现,ALVE1 LTR在鸡巨噬细胞系HD11和鸡T淋巴细胞系MSB1细胞中的转录水平可能受DNA甲基化调控,去甲基化处理HD11或MSB1 24 h后,LTR转录水平显著增加。通过序列分析发现ALVE1 LTR高度保守且存在先天性免疫应答激活转录因子如NF-AT、c-JUN等。本研究揭示了ALVE1 LTR自身转录的变化规律,为进一步分析ALVE1 LTR功能奠定了基础。

关键词：禽内源性反转录病毒长末端重复序列 DNA甲基化表观遗传学

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microRNA-483在人体细胞中生物学功能的研究

microRNA-483在人体细胞中生物学功能的研究

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2015中国遗传学会大会

作者：袁君婷刘洋洋韩笑崔恒宓扬州大学表观遗传学和表观基因组学研究所扬州大学生物科学与技术学院

microRNA（miRNA）是长约20-25个核苷酸并具有调控功能的非编码RNA。研究表明miRNA参与生命活动中多种调控途径包括表观遗传学调控、细胞周期调控和细胞分化调控等。miRNA-483是一种在多种真核生物中存在的micorRNA。相关研究表明,miRNA... 详细信息

microRNA（miRNA）是长约20-25个核苷酸并具有调控功能的非编码RNA。研究表明miRNA参与生命活动中多种调控途径包括表观遗传学调控、细胞周期调控和细胞分化调控等。miRNA-483是一种在多种真核生物中存在的micorRNA。相关研究表明,miRNA-483有促癌作用,其中一个靶基因为抑癌基因。本研究旨在使用CRISPR/Cas9系统对HEK293细胞和肠癌细胞HCT116中的miRNA-483敲除和过表达,研究其生物学功能。首先设计特异性识别miRNA-483的两个核苷酸序列,分别连到含有Cas9和CRISPR基座的载体骨架中,命名为miRNA-knockout-1和miRNA-knockout-2。载体中分别携带EGFP荧光蛋白基因及Puro抗性基因。为确保有效的同源重组,选取了miRNA-483两边800bp作为左右同源臂。敲除的同源重组载体命名为miRNA-knockout-donor。为构建miRNA过表达载体,选取人基因组中AAVS1基因作为靶向序列,用同样的方法构建miRNA-483过表达的同源重组载体miRNA-overexpression-donor和CRISPR/Cas系统的载体miRNA-overexpression-1和miRNA-overexpression-2。与敲除载体不同的是,miRNA-overexpression-donor中含有miRNA-483的序列。分别将这些载体转染到HEK293细胞和肠癌细胞HCT116中。使用荧光或者抗生素进行筛选,然后提取各组细胞的DNA和RNA,用PCR测序检测基因组中是否敲除和插入miRNA-483序列,用实时荧光定量证实miRNA-483的表达情况。同时观察miR-483敲除和过表达对细胞形态及生长速度的影响。

关键词： miRNA-483 CRISPR/Cas 同源重组

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