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过表达环状RNA泛素连接酶E3(circHERC4/hsa_circ_0007113)抑制细胞衰老的研究

安徽医科大学学报 2022年第7期57卷 1100-1105页

作者：李华玲杨迪韦俊杰陈章悦陈菊萍扬州大学医学院生化教研室扬州225001 扬州大学附属第一人民医院皮肤科扬州225001

目的研究泛素连接酶E3的环状RNA(circHERC4/hsa_circ_0007113)与人胚肺成纤维细胞(IMR-90)的衰老的关系。方法从circBase数据库上获得环状RNA circHERC4的全基因序列,将其克隆到环状RNA表达载体pLC5-ciR中,体外构建重组体pLC5-ciR(+)hsa_circ_0007113,经PCR、酶切、测序等对重组质粒进行鉴定。利用脂质体2000转染试剂将重组质粒转染到HEK293T和IMR90细胞中,并利用RT-PCR检测正常细胞组、空载体组及重组载体组中环状RNA circHERC4的表达情况;SA-β-gal染色检测各组细胞衰老情况;CCK-8法检测各组细胞增殖情况。结果测序正确,成功构建了环状RNA circHERC4的过表达载体,circHERC4可在HEK293T细胞中高效表达。与对照组相比,重组载体组的SA-β-gal染色阳性率降低(P<0.05),细胞增殖率升高(P<0.05)。过表达circHERC4后能提高IMR90细胞的增殖,抑制细胞的衰老。结论circHERC4具有潜在的抗衰老作用,为深入研究circHERC4的功能奠定了基础。

关键词：环状RNA 衰老泛素连接酶4环状RNA(circHERC4 hsa_circ_0007113) 人胚肺成纤维细胞(IMR-90)

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兔抗小鼠含IQ基序及泛素结构域蛋白(IQUB)多克隆抗体的制备和应用

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细胞与分子免疫学杂志 2023年第9期39卷 846-851页

作者：袁露徐文华葛婷婷周慧萍杨玲杨凡牛长敏郑英扬州大学医学院组织学与胚胎学教研室江苏扬州225001 江苏省非编码RNA基础与临床转化重点实验室江苏扬州225001

目的制备兔抗小鼠含IQ基序及泛素结构域蛋白(IQUB)多克隆抗体并检测IQUB在小鼠睾丸中的表达情况。方法将IQUB蛋白编码序列全长插入pET-30a(+)载体,构建pET-30a-IQUB原核表达质粒。将原核表达质粒转化入大肠杆菌BL21中,异丙基-β-D-硫... 详细信息

目的制备兔抗小鼠含IQ基序及泛素结构域蛋白(IQUB)多克隆抗体并检测IQUB在小鼠睾丸中的表达情况。方法将IQUB蛋白编码序列全长插入pET-30a(+)载体,构建pET-30a-IQUB原核表达质粒。将原核表达质粒转化入大肠杆菌BL21中,异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导蛋白表达。利用组氨酸融合蛋白纯化柱纯化蛋白,使用梯度浓度的尿素复性原核蛋白。蛋白复性后免疫新西兰大白兔制备多克隆抗体。免疫完成后ELISA测定多克隆抗体效价,应用Western blot及免疫荧光染色分析多克隆抗体的有效性与特异性。结果成功构建了pET-30a-IQUB重组质粒,并通过IPTG诱导成功表达了原核蛋白。ELISA检测多克隆抗体效价达到1∶1 000 000,制备的多克隆抗体能识别成年野生型小鼠睾丸组织中的内源性IQUB蛋白,IQUB在成年小鼠睾丸的各级生精细胞表达,在成熟精子中定位于顶体及鞭毛。结论成功制备出高特异性的兔抗小鼠IQUB多克隆抗体,可用于Western blot及免疫荧光组织化学染色。

关键词：含IQ基序及泛素结构域蛋白(IQUB) 多克隆抗体精子发生

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兔抗小鼠Tubby样蛋白2(TULP2)多克隆抗体的制备与应用

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细胞与分子免疫学杂志 2022年第5期38卷 452-459页

作者：徐文华翁子睿葛婷婷陆雯婷孟诗奇牛长敏郑英扬州大学医学院妇产与生殖医学研究所组织学与胚胎学教研室江苏省非编码RNA基础与临床转化重点实验室江苏扬州225001

目的制备兔抗小鼠Tubby(Tub)样蛋白2(TULP2)多克隆抗体并检测TULP2蛋白在小鼠睾丸中的表达情况。方法分别将TULP2蛋白编码序列全长和TULP2蛋白含Tub结构域的羧基端(TULP2-C)插入pET-30a(+)质粒中,构建pET-30a(+)-TULP2和pET-30a(+)-TULP2-C原核表达重组质粒。将两种质粒分别转化入大肠杆菌*** BL21中,用异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导原核蛋白表达。利用组氨酸(His)融合蛋白纯化柱纯化TULP2和TULP2-C原核蛋白,用梯度浓度的尿素复性。分别以复性后的TULP2和TULP2-C原核蛋白为抗原免疫成年雄性新西兰大白兔,获得两种类型的TULP2多克隆抗体。应用ELISA测定多克隆抗体的效价,Western blot法及免疫荧光技术确定自制多克隆抗体的有效性及特异性。结果成功构建了pET-30a(+)-TULP2以及pET-30a(+)-TULP2-C重组质粒,并且通过IPTG诱导,表达出TULP2和TULP2-C原核重组蛋白。ELISA检测两种抗体滴度均达到1∶1000000。Western blot法、免疫荧光染色结果显示,利用TULP2-C原核蛋白为免疫原制备的抗体特异性较差。而利用TULP2全长蛋白为免疫原制备的多克隆抗体可以特异识别成年野生型小鼠睾丸中内源性的TULP2蛋白,而且可用于免疫荧光组织化学染色,结果显示TULP2在成年野生型小鼠的圆形精子细胞及其后变形期的精子细胞中表达。结论应用TULP2全长蛋白为抗原可成功制备兔抗小鼠TULP2多克隆抗体,可同时用于Western blot法及免疫荧光组织化学染色。

关键词： Tubby样蛋白2(TULP2) 多克隆抗体精子发生

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哺乳动物纤毛/鞭毛内运输在精子形成中的作用及机制研究进展

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遗传 2021年第11期43卷 1038-1049页

作者：葛婷婷袁露徐文华郑英扬州大学医学院组织学与胚胎学教研室江苏省非编码RNA基础与临床转化重点实验室扬州225009

纤毛/鞭毛是真核生物细胞表面伸出的进化保守的细胞器,独特的位置和特性使它们在细胞运动和信号传递等生命过程发挥重要作用。哺乳动物纤毛/鞭毛的组装和维持都依赖纤毛/鞭毛内运输(intraflagellar transport,IFT)。IFT是由IFT复合体A... 详细信息

纤毛/鞭毛是真核生物细胞表面伸出的进化保守的细胞器,独特的位置和特性使它们在细胞运动和信号传递等生命过程发挥重要作用。哺乳动物纤毛/鞭毛的组装和维持都依赖纤毛/鞭毛内运输(intraflagellar transport,IFT)。IFT是由IFT复合体A和复合体B在驱动蛋白或马达蛋白驱动下的双向运输系统。该过程可将货物蛋白在胞体的合成位点与纤毛/鞭毛尖端的装配位点之间进行运输。鞭毛是哺乳动物精子产生动力的特异性细胞器,其完整性对精子正常功能至关重要。近年来研究表明,IFT在哺乳动物精子鞭毛形成和雄性生殖能力方面必不可少。本文对参与IFT的蛋白在精子鞭毛形成中的作用和机制进行了综述,以探讨其在男性不育症中的发病机制,为不育症的诊断和治疗提供理论基础。

关键词：纤毛/鞭毛内运输精子形成雄性不育

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生物被膜形成关键基因csgD对鼠伤寒沙门菌黏附侵袭上皮细胞能力的影响

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畜牧与兽医 2022年第11期54卷 65-71页

作者：张若楠徐诺陆游冯政陈素娟秦涛阴银燕彭大新扬州大学兽医学院江苏省动物重要疫病与人兽共患病防控协同创新中心江苏扬州225009 扬州大学医学院基础医学与医学技术系病原生物学与免疫学教研室江苏扬州225009

为了探究生物被膜形成关键基因csgD与鼠伤寒沙门菌黏附侵袭上皮细胞能力的关系,本研究利用Red同源重组系统构建鼠伤寒沙门菌S025株csgD基因缺失株(S025ΔcsgD),利用原核表达载体构建回复株(S025ΔcsgDR);运用结晶紫染色定量、共聚焦显... 详细信息

为了探究生物被膜形成关键基因csgD与鼠伤寒沙门菌黏附侵袭上皮细胞能力的关系,本研究利用Red同源重组系统构建鼠伤寒沙门菌S025株csgD基因缺失株(S025ΔcsgD),利用原核表达载体构建回复株(S025ΔcsgDR);运用结晶紫染色定量、共聚焦显微镜和扫描电镜观察、平板表型鉴定等方法检测鼠伤寒沙门菌生物被膜形成能力,并比较野生株、缺失株和回复株黏附侵袭Caco-2细胞和HeLa细胞的差异。结晶紫染色定量、共聚焦显微镜和扫描电镜观察结果显示,与野生株S025和回复株S025ΔcsgDR相比,S025ΔcsgD生物被膜形成能力显著降低;生物被膜成分分析发现,野生株呈红色干燥粗糙型菌落,而S025ΔcsgD呈白色光滑型菌落,表明其卷曲菌毛和纤维素成分减少,回复株的菌落与野生株相似。黏附与侵袭试验结果显示,与野生株与回复株相比,S025ΔcsgD的黏附率和侵袭率显著降低。结果表明,生物被膜形成关键基因csgD在鼠伤寒沙门菌黏附和侵袭宿主上皮细胞方面发挥关键作用,这为进一步阐明生物被膜状态下的鼠伤寒沙门菌的致病机理奠定了理论基础。

关键词：鼠伤寒沙门菌生物被膜 csgD 黏附侵袭

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弥罗松酚对帕金森病小鼠脑内炎症和氧化应激的调控作用

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神经解剖学杂志 2021年第6期37卷 657-664页

作者：王小洪吴成豪周明瑶曹桂云葛悦江天琳扬州大学医学院江苏省非编码RNA基础与临床转化重点实验室扬州大学医学院人体解剖教研室扬州225001

目的:探讨弥罗松酚(Fer)对1-甲基-4-苯基-1,2,3,6-四氢吡啶(MPTP)诱导的帕金森病(PD)小鼠脑内黑质-纹状体系统损伤的调控作用.方法:将雄性C57/BL6小鼠随机分为4组:对照组、PD组、PD+Fer组和Fer单独处理组.通过腹腔注射MPTP制作帕金森病... 详细信息

目的:探讨弥罗松酚(Fer)对1-甲基-4-苯基-1,2,3,6-四氢吡啶(MPTP)诱导的帕金森病(PD)小鼠脑内黑质-纹状体系统损伤的调控作用.方法:将雄性C57/BL6小鼠随机分为4组:对照组、PD组、PD+Fer组和Fer单独处理组.通过腹腔注射MPTP制作帕金森病小鼠模型,Fer治疗组和Fer单独处理组小鼠给予腹腔注射弥罗松酚.通过旷场实验和转棒实验检测各组小鼠的行为学改变;用商品化试剂盒检测小鼠中脑黑质区氧化应激指标包括活性氧簇(ROS)、丙二醛(MDA)、谷胱甘肽(GSH)及过氧化氢酶(CAT)的水平或活性;免疫组织化学染色法检测黑质区酪氨酸羟化酶(TH)阳性神经元和纹状体区神经胶质纤维酸性蛋白(GFAP)阳性的星形胶质细胞的形态和数量;以Western Blot方法检测纹状体区GFAP、诱导型一氧化氮合酶(iNOS)、肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、白细胞介素-1β(IL-1β)的表达;ELISA法检测纹状体区多巴胺(DA)及其代谢产物3,4-二羟基苯乙酸(DOPAC)的水平.结果:PD+Fer组小鼠在旷场实验中运动的距离和时间及在转棒实验的停留时间较PD组小鼠显著增加;纹状体区DA及其代谢产物DOPAC的水平、脑组织中GSH水平及CAT活性较PD组小鼠显著升高,而ROS及MDA的含量显著下降;纹状体区GFAP、iNOS、TNF-α、IL-1β蛋白的表达较PD组小鼠显著降低;黑质区TH阳性神经元的数量显著升高;纹状体区GFAP阳性细胞的数量较PD组小鼠显著减少.结论:Fer可有效缓解帕金森病小鼠脑内黑质-纹状体通路的损伤,其机制可能是通过抑制脑内的氧化应激损伤和炎性反应而发挥神经保护的作用.

关键词：弥罗松酚帕金森病氧化应激神经炎症 C57/BL6小鼠

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精子头尾耦合装置异常在无头精子综合症发病机制中的作用

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中国男科学杂志 2023年第4期37卷 122-127页

作者：许林巍葛婷婷郑英扬州大学医学院组织学与胚胎学教研室江苏扬州225009 江苏省非编码RNA基础与临床转化重点实验室江苏扬州225009

精子发生是一个复杂且有序的发育过程,包括精原细胞有丝分裂增殖、精母细胞减数分裂以及精子形成三个阶段。在精子形成过程中,头尾耦合装置(headtail coupling apparatus,HTCA)的形成对精子头尾连接至关重要[1]。HTCA定位于精子颈部,包... 详细信息

精子发生是一个复杂且有序的发育过程,包括精原细胞有丝分裂增殖、精母细胞减数分裂以及精子形成三个阶段。在精子形成过程中,头尾耦合装置(headtail coupling apparatus,HTCA)的形成对精子头尾连接至关重要[1]。HTCA定位于精子颈部,包含近端中心粒(proximal centrioles,Pc)。

关键词：精子发生无头精子综合征头尾耦合装置

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精子变形过程中组蛋白-鱼精蛋白替换调控机制

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遗传 2021年第12期43卷 1121-1131页

作者：袁露葛婷婷牛长敏徐文华郑英扬州大学医学院组织学与胚胎学教研室扬州225009 江苏省非编码RNA基础与临床转化重点实验室扬州225009

精子形成是精子发生的最后阶段,圆形精子细胞经历了一系列的形态变化和染色质凝聚,形成了具有物种特异性的成熟精子。组蛋白–鱼精蛋白替换是精子形成过程中的重要事件。在组蛋白–鱼精蛋白替换过程中,组蛋白首先被睾丸特异性的组蛋白... 详细信息

精子形成是精子发生的最后阶段,圆形精子细胞经历了一系列的形态变化和染色质凝聚,形成了具有物种特异性的成熟精子。组蛋白–鱼精蛋白替换是精子形成过程中的重要事件。在组蛋白–鱼精蛋白替换过程中,组蛋白首先被睾丸特异性的组蛋白变体所替代,随后过渡蛋白整合到细胞核中,最后过渡蛋白被鱼精蛋白取代。组蛋白–鱼精蛋白替换缺陷可能导致无精子症、少精子症或畸精症,从而导致男性不育。本文系统总结了组蛋白–鱼精蛋白替换过程中的调控机制研究进展,以期为男性不育症的诊断和治疗提供理论基础。

关键词：精子发生组蛋白–鱼精蛋白替换翻译后修饰

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miR-144/451在神经系统疾病中的研究概述

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神经解剖学杂志 2021年第3期37卷 357-361页

作者：吴成豪丁冬怡孙志颖卢瑶瑶郁多男王小洪扬州大学医学院江苏省非编码RNA基础与临床转化重点实验室扬州225001 扬州大学医学院人体解剖学教研室扬州225001

microRNA-144/451(miR-144/451)是一种是位于人类17号染色体和小鼠11号染色体上高度保守的双顺反子microRNA,其转录受GATA结合蛋白1(GATA1)等多种核蛋白控制。miR-144/451在阿尔茨海默病(AD)、帕金森病(PD)和抑郁症(MDD)等神经系统疾病... 详细信息

microRNA-144/451(miR-144/451)是一种是位于人类17号染色体和小鼠11号染色体上高度保守的双顺反子microRNA,其转录受GATA结合蛋白1(GATA1)等多种核蛋白控制。miR-144/451在阿尔茨海默病(AD)、帕金森病(PD)和抑郁症(MDD)等神经系统疾病的治疗方面发挥重要的调控作用。本文就miR-144/451在神经系统疾病中发挥的作用及其转录调控机制做一综述。

关键词： miR-144 miR-451 转录调控神经系统

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锦菊素对银屑病模型小鼠的药效学作用及其机制探究

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中国药理学通报 2022年第12期38卷 1801-1808页

作者：张悦陆奕杨婧雯王钰凯张梦莹周芳王广基许正新扬州大学医学院药理学教研室江苏扬州225000 中国药科大学江苏省药物代谢动力学重点实验室中国医学科学院“中药复杂组分PK-PD结合研究”创新单元江苏南京210009 江苏省非编码RNA基础与临床转化重点实验室江苏扬州225000

目的探讨锦菊素对咪喹莫特诱导的银屑病模型小鼠的药效作用及其机制。方法建立咪喹莫特乳膏涂抹小鼠背部皮肤诱导的银屑病模型,以皮损面积及严重程度指数、病理学和炎症因子水平及相关分子生物学数据的变化作为效应学指标,观察不同浓度... 详细信息

目的探讨锦菊素对咪喹莫特诱导的银屑病模型小鼠的药效作用及其机制。方法建立咪喹莫特乳膏涂抹小鼠背部皮肤诱导的银屑病模型,以皮损面积及严重程度指数、病理学和炎症因子水平及相关分子生物学数据的变化作为效应学指标,观察不同浓度的锦菊素给药后以上参数的变化并分析其可能的作用机制。结果与模型组相比,锦菊素可明显改善咪喹莫特诱导的小鼠皮肤红斑、鳞屑、增厚等症状,PASI评分明显降低;组织病理学相关指标显示,锦菊素干预组能够剂量依赖性地减轻小鼠表皮增厚情况,降低表皮细胞中Ki67的表达水平。炎症因子及分子生物学结果表明,锦菊素干预组小鼠皮肤组织中S100a8、S100a9、IL-17A、IL-6、IL-1β表达降低,血清中IL-2、IL-4、TNF-α、IFN-γ及IL-17A表达降低。淋巴结中Th17细胞比例降低,Treg细胞比例增加。此外,锦菊素还能够下调咪喹莫特诱导的P65蛋白磷酸化水平升高,显著抑制P65入核,提示锦菊素能够抑制咪喹莫特诱导的P65蛋白活化。结论锦菊素能够改善咪喹莫特诱导的银屑病模型小鼠的症状和体征,该项作用可能与抑制角质细胞中P65蛋白磷酸化相关。

关键词：锦菊素银屑病咪喹莫特 Th17细胞 Treg细胞炎症

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