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2015中国遗传学会大会

作者：薛松磊沈丹陈才史云强钟继汉宋成义崔恒宓高波扬州大学表观遗传学与表观基因组学研究所扬州大学动物科学与技术学院

为了比较和探索SB,PB和ro12三种转座子介导下,斑马鱼上的转基因效率和基因捕获效率研究,以及基因捕获个体的F1代的基因捕获效率;本研究将包含三种转座子的转基因载体pT3-PST-FAG-GFP分别与三种转座酶表达载体以五种质量比(2:1,2:3,2:5,2... 详细信息

为了比较和探索SB,PB和ro12三种转座子介导下,斑马鱼上的转基因效率和基因捕获效率研究,以及基因捕获个体的F1代的基因捕获效率;本研究将包含三种转座子的转基因载体pT3-PST-FAG-GFP分别与三种转座酶表达载体以五种质量比(2:1,2:3,2:5,2:8,2:10)混合,细胞质显微注射至斑马鱼受精卵,在胚胎发育早期(24hpf)和幼鱼期(120hpf),用体视荧光显微镜检测报告基因绿色荧光蛋白(Green Fluorecent Protein,GFP)阳性表达率,获得效率最高的转座子和转座酶配比;在此基础上将构建有启动子捕获和PolyA捕获的载体pT3-PST-RG-Trap分别与三种转座酶表达载体以最优比质量比混合,以相同的方法检测FO代基因捕获效率;结果显示:在转基因实验中荧光显微镜检测表明,SB转座子的转座效率与注射浓度呈正相关,PB和Tol2转座子有过量抑制效应,同时胚胎活率都随着注射浓度上升而下降,综合两方面因素可以获得最优注射浓度,在24hpf斑马鱼胚胎中,Tol2(30ng/ul)的GFP阳性率为68%,高于PB(50ng/ul)66%和SB(50ng/ul)的64%,三者差异不显著(P>0.05),在120hpf,Tol2(30ng/ul)与PB(50ng/ul)都为68%,略高于SB(50ng/ul)65%(P>0.05),在基因捕获实验中荧光显微镜检测表明,在24hpf和120hpf时,PB最高(77%和81%),显著高于SB(63%和61%)和Tol2(56%和56%),三者差异显著(P<0.05);研究表明,转座子介导转基因可以获得较高的转基因效率(>64%)和基因捕获效率效率(>56%),受协同和抑制效应的影响,不同的转座子最优注射浓度不同,但最优浓度下的转基因效率三者差异不显著,同时可以得到基因捕获三种转座子效率PB最优,其次为SB和Tol2,本研究为提高动物转基因效率和基因捕获效率研究提供重要参考,为功能基因的获取、分析以及生理功能研究提供了有效的一种有效的途径。

关键词： SB PB To12 转座子 GFP 斑马鱼启动子捕获 PolyA捕获细胞质显微注射。

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CRISPR/Cas9系统介导的早期斑马鱼IncRNA的沉默

CRISPR/Cas9系统介导的早期斑马鱼IncRNA的沉默

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2015中国遗传学会大会

作者：田净净杨哲刘菲菲杨祎擎刘洋洋韩笑吕贝宋成义高波崔恒宓扬州大学表观遗传学及表观基因组学研究所扬州大学动物科学与技术学院

长链非编码RNA(Long non-coding RNA,lncRNA)是长度大于200个核苷酸的非编码RNA。研究表明,lncRNA在剂量补偿效应(Dosage compensationeffect)、表观遗传调控、细胞周期调控和细胞分化调控等众多生命活动中具有重要作用。NONIRET002679... 详细信息

长链非编码RNA(Long non-coding RNA,lncRNA)是长度大于200个核苷酸的非编码RNA。研究表明,lncRNA在剂量补偿效应(Dosage compensationeffect)、表观遗传调控、细胞周期调控和细胞分化调控等众多生命活动中具有重要作用。NONIRET002679是斑马鱼lncRNA,利用生物信息学分析的方法得知,其与人的lncRNATCONS 00008475的保守区域序列具有同源性,而TCONS 00008475在人的肺癌组织中异常性高表达。提取斑马鱼囊胚期(3hpf)、原肠期(6hpf)、体节分化期(15hpf)、咽囊期(24hpf)、孵化期(48hpf)5时期的RNA做RT-PCR,NONDRET002679在5个时期都有表达。利用NCBI数据库分析NONDRET002679基因结构,在基因转录起始位点上游选取2kb区域,预测此区域为NONDRET002679启动子区。在这段区域的上下游各设计3个gRNAs靶位点,记为I-1,1-3,I-4,111-3,m-5和1I1-6,利用CRISPR/Cas9系统敲除这段区域,以沉默NONDRET002679的表达。体外转录Cas9 mRNA和6个gRNAs,将Cas9 mRNA和6个gRNAs混合,Cas9 mRNA浓度为300nig/IμL,6个gRNAs浓度分别为12.5ng/μL,注射单细胞斑马鱼胚胎,注射剂量约1.76nl。在预测启动子区,上下游设计引物,收集注射组胚胎和对照组胚胎,提取基因组做PCR,PCR片段测序,与NCBI数据库比对,结果显示注射组斑马鱼的预测启动子区域被成功敲除。下一步计划得到预测启动子区域成功敲除的斑马鱼,观察下一代形态变化,进而研究NONDRET002679的调控功能,以及其与人lncRNATCONS 00008475调控功能的关联性,揭示它们与肿瘤发生发展的关系。

关键词： lncRNA 调控功能斑马鱼 CRISPR/Cas9系统肿瘤

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长链非编码RNAH195-甲基胞嘧啶修饰的精确定位定量分析

长链非编码RNAH195-甲基胞嘧啶修饰的精确定位定量分析

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2015中国遗传学会大会

作者：孙振崔恒宓扬州大学表观遗传学和表观基因组学研究所扬州大学动物科学与技术学院

甲基化是表观遗传学的重要研究领域之一。在DNA中,甲基化主要表现形式为5-甲基胞嘧啶(m5C),并分布于CpG位点上。大量研究表明,DNA中m5C修饰在基因表达调控、基因印记、转座子沉默、X染色体失活以及癌症发生等重要生物学过程起到关键的... 详细信息

甲基化是表观遗传学的重要研究领域之一。在DNA中,甲基化主要表现形式为5-甲基胞嘧啶(m5C),并分布于CpG位点上。大量研究表明,DNA中m5C修饰在基因表达调控、基因印记、转座子沉默、X染色体失活以及癌症发生等重要生物学过程起到关键的作用。近年来,研究发现RNA m5C也是一种重要的表观遗传学修饰。有多种实验室方法,包括Bisulfite-sequencing、MeRIP、Aza-IP和miCLIP在转录组水平对这一甲基化修饰进行了定位分析,发现m5C在mRNA和ncRNA中一种普遍的修饰。然而,当前的研究方法主要局限在RNA m5C修饰的定性分析,即只定位不定量,这在研究RNA m5C修饰的功能时会有一定的局限性。Bisulfite-pyrosequencing是当前在DNA中应用较为成熟的m5C精确定位定量分析技术,我们将这一方法进行了改进,使之适用于RNA m5C修饰的检测。在两种人细胞HepG2和293T中,我们对一种功能性lncRNAH19进行了m5C修饰分析。结果发现C1709位点在两种细胞中表现出差异性修饰,在HepG2中基本没有甲基化,而在293T中有72%表现为甲基化,暗示不同环境下lncRNA H19 m5C修饰水平的差异可能使其具有不同的功能。另外,结果证实DNA中用于m5C修饰位点的分析方法也适用于RNA中m5C修饰的分析,为进一步研究RNAm5C的功能提供了技术参考。

关键词： RNA甲基化 5-甲基胞嘧啶 H19 Bisulfite-pyrosequencing

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诱导表达Cas9小鼠胚胎干细胞的建立及其应用

诱导表达Cas9小鼠胚胎干细胞的建立及其应用

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2015中国遗传学会大会

作者：韩笑刘洋洋袁君婷崔恒宓扬州大学表观遗传学和表观基因组学研究所扬州大学动物科学与技术学院

随着功能基因组学研究的深入发展,基因编辑技术逐渐成为基因功能研究的重要手段。早期基于同源重组的基因编辑技术效率极低。近些年来,随着CRISPR/Cas9技术的出现,基因编辑迈进了新的时代。利用gRNA进行定位,引导Cas9蛋白精确定位进行剪... 详细信息

随着功能基因组学研究的深入发展,基因编辑技术逐渐成为基因功能研究的重要手段。早期基于同源重组的基因编辑技术效率极低。近些年来,随着CRISPR/Cas9技术的出现,基因编辑迈进了新的时代。利用gRNA进行定位,引导Cas9蛋白精确定位进行剪切DNA,产生双链缺口并启动DNA的自我修复机制。在修复的同时有一定的机率插入或者删除碱基,达到编辑基因的目的。胚胎干细胞的基因编辑包括基因敲除和基因插入。如果能让胚胎干细胞有条件表达Cas9,这将使胚胎干细胞应用于CRISPR/Cas9系统的基因编辑更加方便。本研究通过CRISPR/Cas9系统介导的同源重组,建立稳定表达Cas9蛋白的小鼠胚胎干细胞系,以提高应用CRISPR/Cas9技术在胚胎干细胞中进行基因编辑的效率,并实现高效多个位点的同时编辑。为了降低Cas9剪切DNA的脱靶率,使用Cas9 nickase(Cas9n)在DNA双链上分别产生缺口,精确的剪切DNA。在随后DNA损伤修复中,构建的Puro-Cas9n donor和M2rtTA donor载体通过同源重组将Cas9n基因整合到小鼠胚胎干细胞的ROSA26基因位点。该位点(又称为Rβgeo26位点)位于小鼠基因组第6号染色体,基因敲入对细胞及小鼠的健康无副作用,并能保证转入基因的正常稳定表达。通过四环素诱导Cas9n的表达,启动剪切功能,形成DSB并启动DNA修复机制,将Cas9n和M2rtTA基因同源重组进ROSA26位点,并通过Southern blot分析同源重组率,通过qRT-PCR分析Cas9n蛋白确定是否表达(不加四环素作为对照),以获取Cas9n和M2rtTA基因同时插入的单克隆细胞株。选择多个感兴趣的目的基因的gRNA进行多个基因的同时编辑,72h后提取老鼠胚胎干细胞的基因组DNA,用T7核酸内切酶处理,计算不同基因的编辑效率。

关键词：同源重组 CRISPR/Cas9 多位点基因编辑 ROSA26

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禽内源性反转录病毒ALVE1LTR转录水平分析

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中国动物传染病学报 2015年第5期23卷 27-31页

作者：胡序明朱文奇陈世豪刘洋洋孙振耿拓宇宋成义高波秦爱建崔恒宓扬州大学表观遗传学及表观基因组学研究所扬州225009 扬州大学动物科学和技术学院扬州225009 扬州大学教育部禽类预防医学重点实验室扬州225009 江苏省动物重要疫病与人兽共患病防控协同创新中心扬州225009

本研究以禽内源性反转录病毒ALVE1为研究对象,分析了ALVE1长末端重复序列(long terminal repeat,LTR)自身转录的变化规律。荧光定量PCR结果显示LTR在2日龄SPF鸡(发育早期)器官组织中转录水平高,而在35日龄SPF鸡(发育晚期)器官组织中转... 详细信息

本研究以禽内源性反转录病毒ALVE1为研究对象,分析了ALVE1长末端重复序列(long terminal repeat,LTR)自身转录的变化规律。荧光定量PCR结果显示LTR在2日龄SPF鸡(发育早期)器官组织中转录水平高,而在35日龄SPF鸡(发育晚期)器官组织中转录水平低。焦磷酸测序和荧光定量PCR关联分析发现,ALVE1 LTR在鸡巨噬细胞系HD11和鸡T淋巴细胞系MSB1细胞中的转录水平可能受DNA甲基化调控,去甲基化处理HD11或MSB1 24 h后,LTR转录水平显著增加。通过序列分析发现ALVE1 LTR高度保守且存在先天性免疫应答激活转录因子如NF-AT、c-JUN等。本研究揭示了ALVE1 LTR自身转录的变化规律,为进一步分析ALVE1 LTR功能奠定了基础。

关键词：禽内源性反转录病毒长末端重复序列 DNA甲基化表观遗传学

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microRNA-483在人体细胞中生物学功能的研究

microRNA-483在人体细胞中生物学功能的研究

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2015中国遗传学会大会

作者：袁君婷刘洋洋韩笑崔恒宓扬州大学表观遗传学和表观基因组学研究所扬州大学生物科学与技术学院

microRNA（miRNA）是长约20-25个核苷酸并具有调控功能的非编码RNA。研究表明miRNA参与生命活动中多种调控途径包括表观遗传学调控、细胞周期调控和细胞分化调控等。miRNA-483是一种在多种真核生物中存在的micorRNA。相关研究表明,miRNA... 详细信息

microRNA（miRNA）是长约20-25个核苷酸并具有调控功能的非编码RNA。研究表明miRNA参与生命活动中多种调控途径包括表观遗传学调控、细胞周期调控和细胞分化调控等。miRNA-483是一种在多种真核生物中存在的micorRNA。相关研究表明,miRNA-483有促癌作用,其中一个靶基因为抑癌基因。本研究旨在使用CRISPR/Cas9系统对HEK293细胞和肠癌细胞HCT116中的miRNA-483敲除和过表达,研究其生物学功能。首先设计特异性识别miRNA-483的两个核苷酸序列,分别连到含有Cas9和CRISPR基座的载体骨架中,命名为miRNA-knockout-1和miRNA-knockout-2。载体中分别携带EGFP荧光蛋白基因及Puro抗性基因。为确保有效的同源重组,选取了miRNA-483两边800bp作为左右同源臂。敲除的同源重组载体命名为miRNA-knockout-donor。为构建miRNA过表达载体,选取人基因组中AAVS1基因作为靶向序列,用同样的方法构建miRNA-483过表达的同源重组载体miRNA-overexpression-donor和CRISPR/Cas系统的载体miRNA-overexpression-1和miRNA-overexpression-2。与敲除载体不同的是,miRNA-overexpression-donor中含有miRNA-483的序列。分别将这些载体转染到HEK293细胞和肠癌细胞HCT116中。使用荧光或者抗生素进行筛选,然后提取各组细胞的DNA和RNA,用PCR测序检测基因组中是否敲除和插入miRNA-483序列,用实时荧光定量证实miRNA-483的表达情况。同时观察miR-483敲除和过表达对细胞形态及生长速度的影响。

关键词： miRNA-483 CRISPR/Cas 同源重组

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miR-483-3p对结直肠癌DLC1基因表达的影响

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胃肠病学 2014年第7期19卷 394-398页

作者：蒋菁蕊刘媛吴少亘曹望森崔恒宓于成功南京大学医学院附属鼓楼医院消化科 210008 南京大学医学院扬州大学表观遗传学及表观基因组学研究所

背景:抑癌基因表达抑制在肿瘤发生、发展过程中起重要作用。一些microRNAs可通过调节抑癌基因的表达影响肿瘤发生。目的:探讨miR-483-3p对结直肠癌肝癌缺失基因1(DLC1)表达的靶向调节作用。方法:纳入2012年10月~2013年4月南京鼓楼医院... 详细信息

背景:抑癌基因表达抑制在肿瘤发生、发展过程中起重要作用。一些microRNAs可通过调节抑癌基因的表达影响肿瘤发生。目的:探讨miR-483-3p对结直肠癌肝癌缺失基因1(DLC1)表达的靶向调节作用。方法:纳入2012年10月~2013年4月南京鼓楼医院收治的结直肠癌患者16例,采用蛋白质印迹法检测癌组织及其相应癌旁非癌组织的DLC1表达,qRT-PCR检测miR-483-3p表达。构建含DLC1 3’非翻译区(3’UTR)的双荧光素酶报告基因质粒,在人结肠癌细胞株HCT116中验证miR-483-3p对DLC1表达的调节作用。以miR-483-3p mimic转染HEK293T细胞,采用蛋白质印迹法检测DLC1表达;以miR-483-3p mimic转染HCT116细胞,采用CCK-8实验检测细胞增殖。结果:结直肠癌组织的DLC1表达水平显著低于癌旁非癌组织,miR-483-3p表达水平显著高于癌旁非癌组织(P<0.05)。miR-483-3p mimic可靶向结合DLC1的3’UTR而抑制其表达。转染miR-483-3p mimic的HCT116细胞增殖能力显著增强(P<0.05)。结论:DLC1是miR-483-3p的靶基因,miR-483-3p可在转录后水平抑制DLC1表达,参与促进结直肠癌发生。

关键词： miRNA-483-3p 肝癌缺失基因1 结直肠肿瘤表观遗传学细胞增殖

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miR-483与结直肠癌关系的研究

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胃肠病学 2014年第3期19卷 151-155页

作者：刘媛蒋菁蕊吴少亘曹望森于成功崔恒宓南京大学医学院附属鼓楼医院消化科 210008 南京大学医学院江苏省分子医学重点实验室扬州大学表观遗传学及表观基因组学研究所

背景:胰岛素样生长因子2(IGF2)基因在多种恶性肿瘤中呈高表达,在肿瘤发生中起重要作用。miR-483位于IGF2基因第7号内含子中,与宿主基因共表达,但其具体功能尚未明确。目的:检测miR-483-3p、miR-483-5p在结直肠癌中的表达情况,探讨其作... 详细信息

背景:胰岛素样生长因子2(IGF2)基因在多种恶性肿瘤中呈高表达,在肿瘤发生中起重要作用。miR-483位于IGF2基因第7号内含子中,与宿主基因共表达,但其具体功能尚未明确。目的:检测miR-483-3p、miR-483-5p在结直肠癌中的表达情况,探讨其作为结直肠癌分子标记物的可能性。方法:收集75对结直肠癌组织和相应癌旁非癌组织样本,以real-time PCR检测miR-483-3p、miR-483-5p表达并分析两者间以及两者与肿瘤临床病理特征的关系,以ROC曲线分析两者对结直肠癌的诊断性能。结果:结直肠癌组织中的miR-483-3p、miR-483-5p相对表达量均显著高于相应癌旁非癌组织(P<0.000 1),且两者在癌组织中的表达量呈显著正相关(rs=0.554 5,P<0.000 1)。miR-483-3p和miR-483-5p诊断结直肠癌的最佳截点分别为9.22和11.61,相应诊断敏感性、特异性分别为78.67%、62.67%和50.67%、85.33%;如两者联合检测(并联试验),诊断敏感性可提高至89.48%。两者表达与结直肠癌患者的性别、年龄以及肿瘤大小、部位、分化程度和TNM分期均无相关性。结论:miR-483-3p、miR-483-5p在结直肠癌中呈高表达,可能与肿瘤发生有关。两者有望成为结直肠癌诊断潜在的分子标记物。

关键词：结直肠肿瘤 miR-483 诊断生物学标记

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不同转座子在哺乳动物细胞和胚胎中转座活性研究

不同转座子在哺乳动物细胞和胚胎中转座活性研究

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第十七次全国动物遗传育种学术讨论会

作者：薛松磊李奎沈丹谢雨绣周家庆高波崔文涛牟玉莲宋成义崔恒宓中国农业科学院北京畜牧兽医研究所/农业部畜禽遗传资源与利用重点开放实验室北京100094 扬州大学表观遗传学与表观基因组学研究所/江苏省动物遗传繁育与分子设计重点实验室江苏扬州225009 中国农业科学院北京畜牧兽医研究所/农业部畜禽遗传资源与利用重点开放实验室北京100094 扬州大学表观遗传学与表观基因组学研究所/江苏省动物遗传繁育与分子设计重点实验室江苏扬州225009

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