检索结果-内蒙古大学图书馆

农业生物技术学报 2016年第1期24卷 151-156页

作者：薛松磊史云强陈才沈丹李庆平宋成义崔恒宓高波扬州大学表观遗传学与表观基因组学研究所扬州大学动物科学与技术学院

为了比较和探索SB(sleeping beauty)、PB(piggy Bac)和Tol2 3种转座子介导下的细胞质显微注射法在小鼠(Mus musculus)和斑马鱼(Danio rerio)上的转基因效率,本研究将包含3种转座子的重组载体p T3-PST-CAG-GFP分别与3种转座酶表达载体以1... 详细信息

为了比较和探索SB(sleeping beauty)、PB(piggy Bac)和Tol2 3种转座子介导下的细胞质显微注射法在小鼠(Mus musculus)和斑马鱼(Danio rerio)上的转基因效率,本研究将包含3种转座子的重组载体p T3-PST-CAG-GFP分别与3种转座酶表达载体以1∶1质量比混合,显微注射至小鼠和斑马鱼受精卵细胞质,经体外培养后在胚胎发育不同时期用荧光显微镜检测报告基因绿色荧光蛋白(green fluorescent protein,GFP)阳性率,结果显示,在培养至4 Ed(96 h)(Ed:embryo day,胚胎发育的天数)的小鼠胚胎中,PB转座子介导的GFP转基因阳性率最高,达52%(N=281),显著高于SB的47%(N=328)和Tol2的36%(N=273)(P<0.05);而受精后36和60 h(hour past fertilization,hpf)斑马鱼胚胎中,荧光显微镜检测表明,Tol2的GFP阳性率分别为36%(N=677)和37%(N=685),显著高于SB(28%N=691和27%N=708)和PB(30%N=687和32%N=675)(P<0.05);转座子介导的细胞质显微注射可获得较高的转基因效率,且转座子活性具有物种差异性,在哺乳动物胚胎中PB转座子的基因转移效率最高,而在鱼类胚胎中Tol2转座子的基因转移效率最高。本研究为提高动物转基因效率研究提供重要参考资料。

关键词：小鼠斑马鱼转座子细胞质显微注射

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利用CRISPR/Cas9系统高效敲除斑马鱼lncRNA基因启动子区

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农业生物技术学报 2016年第5期24卷 649-656页

作者：田净净刘洋洋杨哲刘菲菲杨祎擎韩笑耿拓宇高波宋成义崔恒宓扬州大学表观遗传学与表观基因组学研究所扬州大学动物科学与技术学院

斑马鱼(Danio rerio)长非编码RNA(long non-coding RNA,lnc RNA)基因Nondret002679与人(Homo sapiens)肿瘤相关基因间长非编码RNA682基因LNC-PHOX2B-2具有同源序列。本研究以斑马鱼为模型,利用成簇规律间隔短回文重复序列/成簇规律间隔... 详细信息

斑马鱼(Danio rerio)长非编码RNA(long non-coding RNA,lnc RNA)基因Nondret002679与人(Homo sapiens)肿瘤相关基因间长非编码RNA682基因LNC-PHOX2B-2具有同源序列。本研究以斑马鱼为模型,利用成簇规律间隔短回文重复序列/成簇规律间隔短回文重复序列关联蛋白9(clustered regularly interspaced short palindromic repeats/CRISPR-associated protein 9,CRISPR/Cas9)系统,敲除预测的Nondret002679基因启动子区以沉默Nondret002679基因的表达,研究lnc RNA基因Nondret002679在斑马鱼中的调控功能。首先利用启动子区上下游序列设计靶向不同位点的向导RNA(guide RNA)g R1、g R2、g R3、g R4、g R5和g R6。人工合成g RNA转录模板,体外转录为g RNA,与Cas9 m RNA一起显微注射到斑马鱼卵中。PCR鉴定28尾2月龄斑马鱼发现,11尾发生敲除,敲除率为39%。繁殖启动子区敲除的杂合鱼,获得33尾F1代,经鉴定有6尾F1斑马鱼启动子区缺失,其中3尾缺失是在两条同源染色体上。该初步研究表明,CRISPR/Cas9系统可高效敲除lnc RNA基因的启动子区,并且这种敲除可以遗传至下一代,为研究lnc RNA功能提供了一个有效的基因编辑工具。

关键词： CRISPR/Cas9 向导RNA(g RNA) 长非编码RNA(lnc RNA) 显微注射 Nondret002679 斑马鱼

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miR-155体外特异性靶向鸡内源性反转录病毒ALVE1 env转录物的研究

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畜牧与兽医 2016年第5期48卷 7-11页

作者：朱文奇胡序明陈世豪刘洋洋孙振耿拓宇宋成义高波崔恒宓扬州大学表观遗传学及表观基因组学研究所江苏扬州225009 扬州大学动物科学技术学院江苏扬州225009

通过生物信息学方法,发现了鸡内源性反转录病毒禽白血病E1(ALVE1)的env转录物存在gga-miR-155作用位点(AGCATTA),并在体外验证其靶位点的活性。将鸡胚成纤维细胞(CEF)基因组中扩增的ALVE1 env转录物构建至荧光素酶报告载体pmir GLO,获... 详细信息

通过生物信息学方法,发现了鸡内源性反转录病毒禽白血病E1(ALVE1)的env转录物存在gga-miR-155作用位点(AGCATTA),并在体外验证其靶位点的活性。将鸡胚成纤维细胞(CEF)基因组中扩增的ALVE1 env转录物构建至荧光素酶报告载体pmir GLO,获得重组质粒pmirGLO-ALVE1-ENV-WT(野生型),并利用重叠PCR将其miR-155作用位点AGCATTA突变为ATTCAAA,然后构建重组质粒pmir GLO-ALVE1-ENV-MU(突变型),同时将gga-miR-155前体序列构建至pc DNA3.1载体,获得重组质粒pc DNA3.1-gga-miR-155,将这些质粒共转染至DF-1细胞中,48 h后收集细胞并检测荧光素酶活性。结果发现:野生组能显著下调pmir GLO-ALVE1-ENV-WT荧光素酶活性,而对照组无显著改变;对照组和突变组均未能改变pmir GLO-ALVE1-ENV-MU荧光素酶活性。本研究证实gga-miR-155可直接靶向ALVE1 env转录物,为鸡内源性反转录病毒的调控机制提供了新的启示。

关键词： miR-155 靶位点鸡内源性反转录病毒 ALVE1 env

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内源性反转录病毒衍生的长非编码RNA的功能

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生命科学 2016年第6期28卷 695-702页

作者：胡序明崔恒宓扬州大学动物科学与技术学院表观遗传学及表观基因组学研究所

长非编码RNA(long non-coding RNA,lncRNA)是一类转录本长度超过200 nt、不编码蛋白质的RNA分子,以RNA的形式参与多层次调控,包括表观遗传学调控、转录调控以及转录后调控等。大量研究结果表明,许多长非编码RNA分子衍生于数百万年前&qu... 详细信息

长非编码RNA(long non-coding RNA,lncRNA)是一类转录本长度超过200 nt、不编码蛋白质的RNA分子,以RNA的形式参与多层次调控,包括表观遗传学调控、转录调控以及转录后调控等。大量研究结果表明,许多长非编码RNA分子衍生于数百万年前"入侵"人类基因组的内源性反转录病毒(endogenous retrovirus,ERV)序列。内源性反转录病毒是基因组重要成分,约占基因组的5%~8%,多以"前病毒"形式存在,功能很大程度上未知。就内源性反转录病毒衍生的lncRNA在天然免疫、抗病毒和肿瘤等方面的最新研究进展进行综述。

关键词：长非编码RNA 内源性反转录病毒天然免疫表观遗传

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外泌体源性miRNA与结直肠癌诊断的研究进展

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中华普外科手术学杂志（电子版） 2016年第6期10卷 535-537页

作者：徐玉彬崔恒宓薛峰胥广才张培建扬州大学第二临床医学院普通外科研究室 225000 扬州大学表观遗传学及表观基因组学研究所 225009

结直肠癌是人类发病率较高的肿瘤疾病之一。由于其早期症状不明显,所以早期诊断较为困难,目前还没有一个特异性高、敏感性强的检测指标可作为它的肿瘤标记物。临床中的诊断主要还依赖于影像学和内镜的检查。肿瘤细胞释放到循环中的外泌... 详细信息

结直肠癌是人类发病率较高的肿瘤疾病之一。由于其早期症状不明显,所以早期诊断较为困难,目前还没有一个特异性高、敏感性强的检测指标可作为它的肿瘤标记物。临床中的诊断主要还依赖于影像学和内镜的检查。肿瘤细胞释放到循环中的外泌体含有相当丰度的miRNA(microRNA),且不同肿瘤细胞分泌的外泌体所携带的miRNA是不同的。因此分析患者循环中外泌体源性的miRNA,可成为对结直肠癌进行早期诊断的潜在方法。

关键词：结直肠肿瘤微RNA 诊断

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斑马鱼活性ZB转座子的挖掘及其应用研究

斑马鱼活性ZB转座子的挖掘及其应用研究

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第三届全国斑马鱼PI大会暨中国动物学会斑马鱼分会成立大会

作者：沈丹王赛赛陈才钟继汉陈伟高波王宵燕崔恒宓宋成义扬州大学动物科学与技术学院扬州大学表观遗传学与表观基因组学研究所扬州 225009

DNA转座子是一种在生物界广泛分布,且能够在宿主基因组移动的DNA 元件,是一种重要的遗传操作工具.目前,PB,SB,Tol2 等DNA 转座子在转基因,基因捕获,基因治疗等领域应用广泛,但目前国内具有自主知识产权的转座子的研究相对缺乏.本研究通... 详细信息

DNA转座子是一种在生物界广泛分布,且能够在宿主基因组移动的DNA 元件,是一种重要的遗传操作工具.目前,PB,SB,Tol2 等DNA 转座子在转基因,基因捕获,基因治疗等领域应用广泛,但目前国内具有自主知识产权的转座子的研究相对缺乏.本研究通过生物信息学分析,在斑马鱼基因组中发现5 个结构完整的Tc1/Mariner 家族DNA转座子(图A).经遗传分化比较(图B),表明其中1 个转座子是年轻转座子,可能具有较高的活性,命名为ZB.完整ZB 转座子全长1.4kb,两端各有一个对称的203bp 的末端反向重复序列,中间含有1026bp 的转座酶基因编码序列.将含PGK-NEO 表达盒的转座子质粒和转座酶表达质粒(pCMV-ZB)以不同质量比共转染Hela 细胞,进行转座活性验证,并与PB、SB 和Tol2 转座子进行比较.试验结果表明ZB 转座子在1∶1质量比时含抗性的细胞数量最多,即转座效率最高;且ZB 的转座效率略高于PB(P＞0.05),但显著高于SB 和Tol2(P＜0.05)(图C 和图D).将含FAG-GFP 表达盒的转座子质粒和转座酶mRNA 共注射斑马鱼一细胞期胚胎,通过荧光检测比较4 种转座子的转座效率,试验结果表明,在注射后24hpf 和5dpf 的GFP 阳性率ZB 转座子均高于其它3 种转座子(图E),且显著高于SB转座子(P＜0.05).将含CAG-GFP 表达盒的转座子质粒和转座酶共注射制备转基因小鼠,其效率约为33.33％.阳性首建鼠与野生型杂交后产生F1 代,在F1 代中检测到GFP 阳性鼠(图F),表明ZB 转座子能够有效介导外源基因在鼠生殖系细胞中传播.将含增强子捕获盒的转座子(pZB-En-trap)质粒和转座酶mRNA 共注射斑马鱼一细胞期胚胎,获得阳性斑马鱼F0 与野生型杂交,在F1 代检测到大量的GFP 阳性胚胎(图G),呈现多种组织或者细胞特异的表达模式(图H),提示ZB 介导的增强子捕获载体能够有效捕获增强子,其F0代到F1 代的生殖系传播效率为55.56％(NF0=108),表明ZB 转座子能够有效介导捕获增强子.本研究表明,新发现的ZB 转座子是高活性转座子,该转座子能够在哺乳动物细胞、小鼠和斑马鱼胚胎上高效介导外源基因转移,并能够有效介导增强子捕获,具有较好的应用前景.

关键词：转座子转基因转座活性斑马鱼小鼠增强子捕获

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DNA甲基化分析中重亚硫酸盐处理DNA转化效率的评估方法

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遗传 2015年第9期37卷 939-944页

作者：刘洋洋崔恒宓南京大学医学院江苏分子医学重点实验室南京210093 扬州大学表观遗传学及表观基因组学研究所扬州225009

为建立一种评估重亚硫酸盐处理DNA样本后胞嘧啶转化效率的有效方法,以两组不同的Taq Man q PCR检测梯度稀释的重亚硫酸盐处理和未处理的DNA标准品,建立转化与未转化的DNA Ct值以及对应的DNA拷贝数的标准曲线。使用相同的探针定量检测重... 详细信息

为建立一种评估重亚硫酸盐处理DNA样本后胞嘧啶转化效率的有效方法,以两组不同的Taq Man q PCR检测梯度稀释的重亚硫酸盐处理和未处理的DNA标准品,建立转化与未转化的DNA Ct值以及对应的DNA拷贝数的标准曲线。使用相同的探针定量检测重亚硫酸盐处理后的DNA样本评估转化效率。结果显示该方法应用两组探针,根据相应的标准曲线,精确评估样本经重亚硫酸盐处理的转化效率。使用已知转化和未转化拷贝数的混合DNA作为模板,证实了该方法的可靠性。同时也对不同重亚硫酸盐试剂盒处理DNA的转化效率进行了评估,结果显示,该方法能够有效地评估DNA样品重亚硫酸盐的转化效率,为DNA甲基化准确分析提供了可靠快捷的方法。

关键词： DNA甲基化重亚硫酸盐 TaqMan qPCR 转化率

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禽内源性反转录病毒ALVE表观遗传学分析方法的建立及应用

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中国动物传染病学报 2015年第5期23卷 15-20页

作者：朱文奇胡序明陈世豪刘洋洋孙振耿拓宇宋成义高波王宵燕秦爱建崔恒宓扬州大学表观遗传学及表观基因组学研究所扬州225009 扬州大学教育部禽类预防医学重点实验室扬州225009 江苏省动物重要疫病与人兽共患病防控协同创新中心扬州225009

根据NCBI公布的禽内源性反转录病毒ALVE1序列设计引物,以SPF鸡胚制备的成纤维细胞为生物材料,建立了ALVE基因序列分析、甲基化水平和转录表达检测方法。以鸡胚成纤维细胞(chicken embryo fibroblast cell,CEF)和巨噬细胞系(HD11)两种细... 详细信息

根据NCBI公布的禽内源性反转录病毒ALVE1序列设计引物,以SPF鸡胚制备的成纤维细胞为生物材料,建立了ALVE基因序列分析、甲基化水平和转录表达检测方法。以鸡胚成纤维细胞(chicken embryo fibroblast cell,CEF)和巨噬细胞系(HD11)两种细胞的基因组为模板,通过常规PCR扩增获得了1912 bp的扩增产物,测序后与内源性ALVE1序列比对,核苷酸同源性高达98%以上,说明扩增产物为内源性病毒序列。同时,利用焦磷酸测序分析LTR片段甲基化水平,结果显示,LTR在非免疫细胞CEF中的甲基化水平显著高于巨噬细胞系HD11。利用常规RT-PCR和荧光定量PCR在两种细胞均检测到禽内源性反转录病毒LTR基因、gag基因、pol基因和env基因的转录表达。本研究为今后分析禽内源性反转录病毒ALVE功能提供了方法,同时也为深入研究禽内源性反转录病毒ALVE表观遗传学调控机制奠定了基础。

关键词：禽内源性反转录病毒 DNA甲基化表观遗传学

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CRISPR/Cas9系统介导的早期斑马鱼IncRNA的沉默

CRISPR/Cas9系统介导的早期斑马鱼IncRNA的沉默

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2015中国遗传学会大会

作者：田净净杨哲刘菲菲杨祎擎刘洋洋韩笑吕贝宋成义高波崔恒宓扬州大学表观遗传学及表观基因组学研究所扬州大学动物科学与技术学院

长链非编码RNA(Long non-coding RNA,lncRNA)是长度大于200个核苷酸的非编码RNA。研究表明,lncRNA在剂量补偿效应(Dosage compensationeffect)、表观遗传调控、细胞周期调控和细胞分化调控等众多生命活动中具有重要作用。NONIRET002679... 详细信息

长链非编码RNA(Long non-coding RNA,lncRNA)是长度大于200个核苷酸的非编码RNA。研究表明,lncRNA在剂量补偿效应(Dosage compensationeffect)、表观遗传调控、细胞周期调控和细胞分化调控等众多生命活动中具有重要作用。NONIRET002679是斑马鱼lncRNA,利用生物信息学分析的方法得知,其与人的lncRNATCONS 00008475的保守区域序列具有同源性,而TCONS 00008475在人的肺癌组织中异常性高表达。提取斑马鱼囊胚期(3hpf)、原肠期(6hpf)、体节分化期(15hpf)、咽囊期(24hpf)、孵化期(48hpf)5时期的RNA做RT-PCR,NONDRET002679在5个时期都有表达。利用NCBI数据库分析NONDRET002679基因结构,在基因转录起始位点上游选取2kb区域,预测此区域为NONDRET002679启动子区。在这段区域的上下游各设计3个gRNAs靶位点,记为I-1,1-3,I-4,111-3,m-5和1I1-6,利用CRISPR/Cas9系统敲除这段区域,以沉默NONDRET002679的表达。体外转录Cas9 mRNA和6个gRNAs,将Cas9 mRNA和6个gRNAs混合,Cas9 mRNA浓度为300nig/IμL,6个gRNAs浓度分别为12.5ng/μL,注射单细胞斑马鱼胚胎,注射剂量约1.76nl。在预测启动子区,上下游设计引物,收集注射组胚胎和对照组胚胎,提取基因组做PCR,PCR片段测序,与NCBI数据库比对,结果显示注射组斑马鱼的预测启动子区域被成功敲除。下一步计划得到预测启动子区域成功敲除的斑马鱼,观察下一代形态变化,进而研究NONDRET002679的调控功能,以及其与人lncRNATCONS 00008475调控功能的关联性,揭示它们与肿瘤发生发展的关系。

关键词： lncRNA 调控功能斑马鱼 CRISPR/Cas9系统肿瘤

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斑马鱼活性转座子(ZB)的发现及其活性验证研究

斑马鱼活性转座子(ZB)的发现及其活性验证研究

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2015中国遗传学会大会

作者：沈丹薛松磊钱跃王赛赛陈才史云强高波王宵燕崔恒宓宋成义扬州大学表观遗传学和表观基因组学研究所扬州大学动物科学与技术学院

由于活性转座子在基因组内具有可以移动的特性,因此在转基因和基因治疗等领域具有很好的应用前景,目前PB、SB、Tol2等转座子已经作为基因治疗和转基因的重要介导载体进行广泛应用,并取得显著进展。本研究通过生物信息学分析,在斑马鱼基... 详细信息

由于活性转座子在基因组内具有可以移动的特性,因此在转基因和基因治疗等领域具有很好的应用前景,目前PB、SB、Tol2等转座子已经作为基因治疗和转基因的重要介导载体进行广泛应用,并取得显著进展。本研究通过生物信息学分析,在斑马鱼基因组中发现存在5个完整的Te1/Mariner家族DNA转座子。遗传分化比较表明,其中1个转座子活性最强,是年轻转座子,命名为ZB。完整ZB转座子全长1.4kb,两端各有一个对称的203bp的末端反向重复序列,中间含有1026bp的转座酶基因编码序列。将ZB转座子的203bp的末端反向重复序列和1026bp的转座酶编码序列克隆并构建成转座子框架载体pZB-Msc和转座酶辅助质粒。转座酶辅助质粒包括两种形式,一种是pCMV-ZB真核表达质粒,包括病毒启动子序列(CMV)和ZB转座酶cDNA序列和SV40多聚腺苷酸(PolyA),能自主表达转座酶;另一种是pZB-mRNA体外转录辅助质粒,包括Sp6、T7启动子、ZB转座酶cDNA序列和T7转录终止序列(terminator),可以进行体外转录形成5'加帽ZB转座酶的mRNA。将含有新霉素性基因表达盒、含有鸡beta-act-in启动子和GFP基因的绿色荧光蛋白表达盒、含有鲤鱼beta-act-in启动子和GFP基因的绿色荧光蛋白表达盒分别克隆至转座子框架载体pZB-Msc,形成转座子供体质粒pZB-PGK-NEO、pZB-CAG-GFP和pZB-FAG-GFP,然后分别在哺乳动物细胞、小鼠胚胎和斑马鱼胚胎上验证其转座活性。将转座子供体质粒pZB-PGK-NEO和转座酶辅助质粒pCMV-ZB,以1:1质量比混合,经多聚阳离子PEI包裹,共转染小鼠胚胎成纤维细胞(MEF),转染48h后用终浓度为500μg·mL-1的G418进行耐药性筛选,至正常细胞全部死亡。吉姆萨染色观察并计数,试验结果表明实验组表达新霉素抗性基因的细胞数量显著高于对照组(P<0.05)。将转座子供体质粒pZB-CAG-GFP和转座酶pCMV-ZB/ZB-.mRNA混合注射为实验组,单转座子质粒注射为对照组,注射后4-5d至胚胎发育至囊胚期观察,试验结果显示3组胚胎均有荧光,同等培养条件下,加转座酶质粒组、转座酶mRNA组和未加转座酶组的胚胎阳性率分别为31.76%(n=3)、33.43%(n=3)和4.34%(n=3),加转座酶组的胚胎阳性率均显著高于未加转座酶组(P<0.05),加转座酶组的胚胎阳性率之间差异不显著(P>0.05)。同样将转座子供体质粒pZB-FAG-GFP和ZB转座酶mRNA以不同浓度(10、30、50、100ng/μL)混合注射为实验组,单质粒注射为对照组,分别显微注射斑马鱼一细胞期胚胎,于注射后24hpf和5dpf观察GFP表达情况,结果显示添加转座酶各组的阳性率显著高于对照组(P<0.05),转座酶浓度为50ng/μL时,注射后24hpf和5dpf的阳性率最高。本研究表明,新发现的ZB转座子是活性转座子,该转座子能够在哺乳动物细胞、小鼠胚胎和斑马鱼胚胎上高效介导外源基因转移,在转基因动物制备和基因治疗中具有较好的应用前景。

关键词：转座子转基因转座活性斑马鱼小鼠基因治疗

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