目的筛选肝细胞癌中N6-甲基腺苷(m6A)相关免疫基因构建预后模型,并探讨其关键基因DDX1在肝癌细胞中的作用。方法本研究选取癌症基因组图谱(TCGA)数据库中368例肝癌样本数据作为训练数据集,基因表达综合数据库(GEO)GSE 14520数据集中242例肝癌样本数据作为验证数据集,并基于表达相关性进行m6A相关的免疫基因筛选。通过LASSO Cox回归模型筛选与预后相关的m6A免疫基因,并构建风险评分(RS)模型。根据RS中位数值,分别将训练集和验证集中所有样本分为高与低风险组,Kaplan-Meier法评估高低风险组的生存预后差异。使用实时荧光定量PCR(RT-qPCR)检测肝癌细胞系(HuH-7、SK-HEP-1、PLC/PRF/5和SNU-449)以及人正常肝细胞系THLE-2中筛选的关键基因表达水平;挑选表达变化较显著的基因,运用功能加强和缺失实验对其功能进行细胞验证。one-way ANOVA法比较多组间统计学差异,其中两两比较采用Tukey法。结果基于共表达分析共获得130个m6A相关免疫基因,最终筛选了5个基因(DDX1、HDAC1、HDAC2、NRAS和PLK1)用于RS模型构建。构建的模型显示,与低风险组比较,高风险组的生存率较低,在TCGA(P<0.001)和GSE 14520数据集(P=0.003)中,差异有统计学意义。与其他基因相比,DDX1在肝癌细胞中高表达。CCK-8实验结果显示,过表达DDX1可促进PLC/PRF/5和SNU-449细胞增殖,差异有统计学意义,P<0.05。Transwell结果显示,与阴性对照组相比,DDX1过表达可促进PLC/PRF/5和SNU-449细胞的迁移(105.00±12.53 vs 173.67±12.22;100.00±10.15 vs 147.33±12.10)和侵袭(83.00±10.81 vs 131.00±13.23;85.33±10.01 vs 135.00±12.49)。DDX1过表达可升高细胞丙二醛(1.01±0.10 vs 1.73±0.13)和活性氧(17.54±1.30 vs 25.97±2.24)水平,但降低超氧化物歧化酶(1.03±0.12 vs 0.52±0.12)的水平。DDX1敲除得到了相反的结果。结论本研究基于5个m6A相关免疫基因构建的预后模型可以有效预测肝癌患者的预后以及对免疫治疗的反应。其中DDX1可促进肝癌进展。
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