检索结果-内蒙古大学图书馆

生物技术通报 2010年第11期26卷 146-152页

作者：韦德芳高健曾春华彭明利任红重庆医科大学附属第二医院消化科重庆400010 重庆医科大学病毒性肝炎研究所感染性疾病分子生物学教育部重点实验室重庆400010

构建靶向乙肝病毒(HBV)X基因的真核表达载体pSOS-X-siRNA和pSOS-siRNA,转染肝癌细胞系HepG2和HepG2.2.15,筛选和验证高效siRNA。设计4个靶向X基因siRNA,将siRNA和HBx基因插入载体pSOS得重组质粒pSOS-X-siRNA;pSOS-X-siRNA经PacI酶切去除目的片段HBx后得pSOS-siRNA。将质粒pSOS-X-siRNA和pSOS-siRNA分别转HepG2和HepG2.2.15肝癌细胞株。荧光显微镜下观察HepG2细胞绿色荧光(GFP)减弱程度预估干扰效率。ELISA检测HepG2.2.15细胞上清HBsAg、HBeAg表达,Western blotting检测胞内蛋白HBsAg、HBcAg表达,Real time PCR检测胞内HBsmRNA、HBx mRNA的转录。转染4d后,siRNA4使HepG2细胞的GFP信号表达程度最低,为阴性对照的9%,预测其干扰效果最强。siRNA4使HepG2.2.15细胞转染后4d上清的HBsAg蛋白表达为对照的(13.92±1.14)%(P<0.05)、HBeAg为(21.69±4.92)%(P<0.05),胞内的HBsAg、HBcAg蛋白表达量灰度比值为0.175±0.025、0.0825±0.028,均为各处理组中最低(P<0.01),HBs mRNA和HBx mRNA分别降为对照的0.237±0.028(P<0.01)、0.110±0.022(P<0.01),差异有统计学意义,证实siRNA4为高效干扰位点。利用pSOS成功筛选并验证构建靶向HBV X基因的siRNA靶点。

关键词： pSOS 乙肝病毒 X基因 RNA干扰

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几种肿瘤特异性启动子在人肝癌细胞系中的活性比较

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重庆医学 2010年第18期39卷 2393-2396页

作者：况舸唐霓陶鹏吴莹张君黄爱龙重庆医科大学药学院药理教研室 400016 重庆医科大学教育部感染性疾病分子生物学重点实验室病毒性肝炎研究所400016 重庆医科大学附属第二医院感染科 400010

目的克隆甲胎蛋白（AFP）、survivin（SUR）、人端粒酶逆转录酶（hTERT）基因启动子,检测并评价其在不同肝癌细胞系和正常组织细胞中的转录活性,为肝癌靶向性基因治疗提供依据。方法采用PCR法扩增获得AFP、SUR、hTERT基因的启动子片段,... 详细信息

目的克隆甲胎蛋白（AFP）、survivin（SUR）、人端粒酶逆转录酶（hTERT）基因启动子,检测并评价其在不同肝癌细胞系和正常组织细胞中的转录活性,为肝癌靶向性基因治疗提供依据。方法采用PCR法扩增获得AFP、SUR、hTERT基因的启动子片段,将之克隆到表达虫荧光素酶基因的报告质粒上,检测AFP、SUR、hTERT基因启动子在肝癌细胞系和正常组织中的转录活性,评价其转录活性水平和肿瘤特异性。结果成功克隆了AFP、SUR、hTERT启动子,证实AFP、SUR、hTERT启动子在肝癌细胞中具有肿瘤特异性转录活性,SUR启动子活性最高,其活性水平为AFP启动子的52~98倍;hTERT启动子次之,其活性水平为AFP启动子的14~30倍;AFP启动子活性最低。结论 hTERT和SUR启动子在肝癌细胞系中具有较强的启动活性和显著的肿瘤特异性,可望开发成为新型的肝癌靶向性基因治疗工具。

关键词：启动子人端粒酶逆转录酶 survivin 基因疗法肝癌靶向

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超级白细胞介素-6重组慢病毒的构建及其对肝细胞的促增殖作用

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中华肝脏病杂志 2009年第8期17卷 615-619页

作者：孙文静秦波黄涛黄爱龙重庆医科大学附属第一医院感染科 400016 重庆医科大学病毒性肝炎研究所、感染性疾病分子生物学教育部重点实验室

目的观察超级白细胞介素-6重组慢病毒对人正常肝细胞L—02的促增殖作用。方法利用慢病毒表达质粒及其包装系统构建超级白细胞介素-6重组慢病毒（FIV—Hyper—IL-6）、IL-6重组慢病毒（FIV-IL-6）和空慢病毒载体（FIV），用嘌呤霉素筛选... 详细信息

目的观察超级白细胞介素-6重组慢病毒对人正常肝细胞L—02的促增殖作用。方法利用慢病毒表达质粒及其包装系统构建超级白细胞介素-6重组慢病毒（FIV—Hyper—IL-6）、IL-6重组慢病毒（FIV-IL-6）和空慢病毒载体（FIV），用嘌呤霉素筛选的方法测定其病毒滴度。将人肝细胞L02分为4组：FIV-Hyper—IL-6组、FIV-IL-6组、FIV组及未感染组，各组分别感染其相应的重组慢病毒，采用四甲基偶氮唑盐法检测其对L-02细胞生长状态的影响；并用RT—PCR法检测重组慢病毒感染L02细胞后产生的急性时相蛋白结合珠蛋白mRNA表达量的变化。应用方差分析进行统计学分析。结果构建出的各重组慢病毒能成功感染靶细胞，嘌呤霉素筛选法测得的各重组慢病毒的病毒滴度均为10^3pfu／ml。病毒颗粒感染L02细胞后48h，细胞的促增殖作用（4值）FIV—Hyper—IL-6组为0．6267±0．0256，FIV—IL-6组、FIV组及未感染组分别为0．5563±0．0112、0．5040±0．0078、0．4790±0．0201，F=41．09，P值均〈0．01，且随着时间的延长，对细胞的促增殖作用有所增加，并于感染后72h达到最高，为0．8000±0．0166。FIV—Hyper—IL-6组细胞结合珠蛋白mRNA吸光度值为0．7030±0．0106，FIV—IL-6组、FIV组及未感染组分别为0．3355±0．0093、0．1143±0．0153、0．1145±0．0076，q=57．5007，P值均〈0．01。结论构建的Hyper-IL-6重组慢病毒能够显著刺激L-02细胞表达结合珠蛋白，对L-02细胞有较强的促增殖作用。

关键词：肝细胞白细胞介素-6 慢病毒属触珠蛋白类

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人肝再生增强因子对体外单个核细胞PKCα-NF-κB及IL-2的影响

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第三军医大学学报 2009年第21期31卷 2065-2068页

作者：王新国刘杞孙航重庆医科大学第二附属医院感染科病毒性肝炎研究所教育部感染性疾病分子生物学重点实验室重庆400010

目的观察人肝再生增强因子(human augmenter of liver regeneration,hALR)对人外周血单个核细胞(periph-eral blood mononuclear cell,PBMC)PKCα-NF-κB及IL-2的影响,探讨hALR免疫抑制机制。方法用梯度离心法分离正常人PBMC,分成正常对照组、刀豆蛋白A(ConA)刺激组(ConA组)和hALR干预组(ConA+hALR组)。ConA组用5μg/mlConA刺激细胞增殖和分泌细胞因子IL-2;ConA+hALR组用30μg/mlhALR对ConA刺激进行干预。于细胞培养0、8、16、32、40h时,用MTT法测定细胞增殖程度,Westonblot检测细胞内信号通路PKCα-NF-κB表达含量,Fluo-3AM装载检测胞内钙离子浓度,用双抗夹心酶联法检测上清细胞因子IL-2含量。结果ConA组细胞增殖逐渐加强,16h时与正常对照组比较具有统计学意义(P<0.05);PKCα、NF-κB表达上调及上清IL-2含量增加趋势一致,在16h达到高峰(P<0.05)。ConA+hALR组细胞没有增殖,PKCα-NF-κB表达及上清IL-2含量最高峰后移至32h。每个时间点各组细胞内Ca2+浓度没有差别。结论hALR可能通过抑制PKCα-NF-κB通路阻碍IL-2的产生速度进而抑制免疫。

关键词：人肝再生增强因子外周血单个核细胞 PKCα-NF-κB IL-2

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抗2型登革病毒M蛋白单克隆抗体的制备和生物学特性的鉴定

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免疫学杂志 2009年第3期25卷 349-352,356页

作者：张娟但妍张君蔡雪飞陈婧郑建黄爱龙重庆医科大学附属第二医院病毒性肝炎研究所感染性疾病分子生物学教育部重点实验室重庆医科大学附属第二医院检验科

目的克隆表达2型登革病毒M蛋白,用纯化的重组蛋白免疫Balb/c小鼠,通过杂交瘤技术制备可用于胶体金快速检测试条的抗2型登革病毒M蛋白的单克隆抗体(mAb),并鉴定其特性。方法利用登革热2型病毒全长基因重组质粒,经PCR方法扩增出prm/m基因... 详细信息

目的克隆表达2型登革病毒M蛋白,用纯化的重组蛋白免疫Balb/c小鼠,通过杂交瘤技术制备可用于胶体金快速检测试条的抗2型登革病毒M蛋白的单克隆抗体(mAb),并鉴定其特性。方法利用登革热2型病毒全长基因重组质粒,经PCR方法扩增出prm/m基因片段,在pET-32a(+)表达系统中表达,表达产物用Ni柱亲和层析纯化后,用于免疫Balb/c小鼠,采用杂交瘤技术制备抗M蛋白的mAb,采用间接ELISA方法和Western blot进行mAb特异性鉴定;同时采用间接ELISA方法鉴定mAb相对亲和力。结果获得2株可分泌特异性mAb的杂交瘤细胞Ⅲ1A6和Ⅲ3D2;相对亲和力均在105以上。Western blot显示2株mAb能特异识别重组M蛋白。结论成功地制备出抗登革病毒2型病毒M蛋白的2株mAb,为建立快速特异检测登革病毒的实验方法提供了有力的工具。

关键词：登革病毒 M蛋白单克隆抗体生物学特性

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B和C基因型乙型肝炎病毒对阿德福韦酯治疗的病毒学应答比较

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中华肝脏病杂志 2008年第6期16卷 412-415页

作者：曾爱中邓惠彭凤英辛小娟杨春李青岭郭进军张祯祯赫美君袁喆黄文祥黄爱龙重庆医科大学病毒性肝炎研究所教育部感染性疾病分子生物学重点实验室重庆400010 重庆医科大学附属第一医院感染科重庆医科大学附属第二医院淌化科

目的阐明不同基因型HBV对阿德福韦酯治疗反应是否存在差异。方法首先利用型特异引物PCR法结合型特异核苷酸分析法检测HBV基因型，然后根据基因型对阿德福韦酯Ⅲ期临床资料进行分析及统计学处理（计量资料用t检验，计数资料用卡方检验）... 详细信息

目的阐明不同基因型HBV对阿德福韦酯治疗反应是否存在差异。方法首先利用型特异引物PCR法结合型特异核苷酸分析法检测HBV基因型，然后根据基因型对阿德福韦酯Ⅲ期临床资料进行分析及统计学处理（计量资料用t检验，计数资料用卡方检验）。结果177例临床标本检出B基因型HBV感染者102例，C基因型感染者65例，B＋C混合型感染者6例，B＋D混合型感染者4例。治疗第12、24周时，B基因型组和C基因型组血清HBVDNA下降均值分别为2.2log10拷贝／ml、2.1log10拷贝／ml和2.7log10拷贝／ml、2．4log10拷贝／ml，两组差异均无统计学意义（P〉0．05），第48周时两组HBVDNA分别下降3.6log10拷贝／ml和3．1log10拷贝／ml，差异有统计学意义（P〈0．05）。治疗结束时（48周）B基因型组和C基因型组分别有43例（42．2％）和22例（33．8％）出现血清HBVDNA转阴，差异有统计学意义（P〈0．05）；两组患者HBeAg阴转率和抗-HBe血清转换率分别为30．4％、29．2％和21．6％、20．0％，差异无统计学意义（P〉0．05）。两组患者血清ALT复常率在治疗第12、24、36周和48周时分别为35．3％、33．9％，51．0％、53．9％，63．4％、61．5％和83．3％、81．5％，各时间段两组ALT复常率差异均无统计学意义（P〉0．05）。结论阿德福韦酯治疗慢性乙型肝炎48周时，部分病毒学指标（如血清HBVDNA下降均值和HBVDNA阴转率）B基因型优于C基因型HBV感染者。但由于阿德福韦酯起效较慢，抑制病毒作用相对较弱，有必要延长治疗时间进一步证实这一现象。

关键词：肝炎乙型慢性肝炎病毒基因型阿德福韦酯

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肝再生增强因子对大鼠腹腔移植的肝细胞的影响

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中华器官移植杂志 2008年第7期29卷 398-401页

作者：张艳王志毅曾翔石小枫孙航刘杞重庆医科大学附属第二医院感染科 400010 自贡市第四人民医院外科重庆医科大学附属第二医院教育部感染性疾病分子生物学重点实验室病毒性肝炎研究所

目的探讨肝再生增强因子（ALR）对急性肝功能衰竭大鼠腹腔移植的肝细胞的影响。方法采用D-氨基半乳糖诱导SD大鼠急性肝功能衰竭（AHF），然后将其随机分为空白对照组（仅接受生理盐水腹腔注射）、移植对照组（腹腔移植SD大鼠的肝细胞2&#... 详细信息

目的探讨肝再生增强因子（ALR）对急性肝功能衰竭大鼠腹腔移植的肝细胞的影响。方法采用D-氨基半乳糖诱导SD大鼠急性肝功能衰竭（AHF），然后将其随机分为空白对照组（仅接受生理盐水腹腔注射）、移植对照组（腹腔移植SD大鼠的肝细胞2×10^7个）、环孢素A组（CsA组，接受肝细胞移植后腹腔注射CsA6d）、ALR组（接受肝细胞移植后腹腔注射ALR6d）和ALR对照组（仅腹腔注射ALR6d）。实验期为14d，观察受者的存活情况及移植肝细胞存活情况，检测腹腔内细胞CD4、CD8及CD68的表达情况，测定血清及腹腔冲洗液中白细胞介素1β（IL-1β）和肿瘤坏死因子α（TNFα）的水平。结果空白对照组、移植对照组、CsA组、AL，R组及ALR对照组的受者2周存活率分别为0、46．7％、20％、66．7％和14．3％，ALR组显著高于空白对照组（P=0．001）。移植后1～2d，ALR组血清TNF-α和IL-1β明显低于空白对照组和移植对照组（P〈0．01）；移植对照组腹腔冲洗液中TNF-α和IL-1β水平明显高于其它各组（P〈0．05，P〈0．01）。至移植后14d，各组存活大鼠的血清TNF-α和IL-1β水平接近正常水平。移植后1～2d，ALR组移植物内CD68表达水平为（0．5±0．3）％，明显低于移植对照组和CsA组（P〈0．01）；ALR组腹腔内细胞CD68、CD4及CD8表达水平分别为（1．3±1．2）％、（0．1±0．3）％和（0．2±0．1）％，均明显低于移植对照组（P〈0．01，P〈0．01，P〈0．05）。移植后1～3d，接受肝细胞移植的大鼠腹腔内可见聚集成团的肝细胞结节，ALR组存活的肝细胞数明显多于移植对照组和CsA组，且炎症细胞浸润较少，至移植后14d，仅ALR组可见少量形态正常的肝细胞。结论腹腔内肝细胞移植联合ALR腹腔注射能提高AHF大鼠的存活率；ALR能短期改善移植肝细胞的存活状况。

关键词：肝细胞生长因子肝细胞细胞移植移植物存活

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型特异引物PCR法分析238株乙肝病毒基因型

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重庆医科大学学报 2008年第1期33卷 53-56页

作者：曾爱中黄爱龙郭进军黄文祥李青岭张祯祯郝美君重庆医科大学病毒性肝炎研究所教育部感染性疾病分子生物学重点实验室重庆400016 重庆医科大学附属第一医院感染科重庆400016

目的:研究乙肝病毒(HBV)感染者HBV基因型分布状况,并建立一套HBV病毒株分型的简便可靠的分析法。方法:设计型特异引物,采用基因型特异引物聚合酶链反应(PCR)法分型。结果:238株HBV中218株得到分型。其中B型149例(男115例、女34例);C型63... 详细信息

目的:研究乙肝病毒(HBV)感染者HBV基因型分布状况,并建立一套HBV病毒株分型的简便可靠的分析法。方法:设计型特异引物,采用基因型特异引物聚合酶链反应(PCR)法分型。结果:238株HBV中218株得到分型。其中B型149例(男115例、女34例);C型63例(男47例、女16例);B+C混合型6例(男4例、女2例)。B型、C型和B+C混合型检出率分别为68.3%(男69.3%、女65.3%)、28.9%(男28.3%、女30.8%)和2.8%(男2.4%、女3.8%)。未检出A、D、E、F、G、H基因型。结论:HBV感染者以B基因型为主。基因型B检出率显著高于其它基因型,其差异具有统计学意义(P<0.01)。HBV各基因型分布与性别无关(P>0.01)。

关键词：乙型肝炎病毒基因型型特异核苷酸聚合酶链反应

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抗HBsAg单克隆抗体的制备与生物学特性的鉴定

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重庆医科大学学报 2008年第3期33卷 267-269页

作者：王雪梅赖梅梅张晓丽张祯祯陈婧张君黄爱龙重庆医科大学附属第二医院病毒性肝炎研究所感染性疾病分子生物学教育部重点实验室重庆400016 第三军医大学附属西南医院肿瘤科重庆400038

目的：制备分泌抗HBVS蛋白的单克隆抗体的杂交瘤细胞株，并鉴定其特性，为建立快速诊断HBV感染的方法奠定基础。方法：以重组乙肝疫苗免疫BALB／c小鼠，通过细胞融合建立了能稳定分泌抗HBsAg单抗的杂交瘤细胞株，利用间接ELISA技术和Wes... 详细信息

目的：制备分泌抗HBVS蛋白的单克隆抗体的杂交瘤细胞株，并鉴定其特性，为建立快速诊断HBV感染的方法奠定基础。方法：以重组乙肝疫苗免疫BALB／c小鼠，通过细胞融合建立了能稳定分泌抗HBsAg单抗的杂交瘤细胞株，利用间接ELISA技术和Western blot进行单抗特异性的鉴定，同时采用间接ELISA方法鉴定mAb的Ig亚类，检测mAb的效价及相对亲和力。结果：获得1株可分泌特异性mAb的杂交瘤细胞4D2，其抗体亚类为IgG1型，腹水效价为1：106，相对亲和力在10^5以上。结论：成功地制备出抗HBVS蛋白的单克隆抗体，为建立快速特异检测HBV感染的实验方法提供了有力的工具。

关键词：乙型肝炎病毒乙型肝炎表面抗原单克隆抗体

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同种肝细胞移植细胞排斥反应机理及肝再生增强因子的作用

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免疫学杂志 2007年第6期23卷 668-671页

作者：张艳王志毅石小枫孙航李红刘杞重庆医科大学附属第二医院感染科重庆医科大学附属第二医院病毒性肝炎研究所教育部感染性疾病分子生物学重点实验室重庆400010

目的探讨同种异体肝细胞腹腔内移植治疗急性肝衰竭大鼠的细胞排斥反应机制及肝再生增强因子(ALR)的免疫作用。方法采用D-氨基半乳糖诱导大鼠急性肝衰竭(ALF),诱导后24h,随机分成5组。Ⅰ组:注射生理盐水;Ⅱ组:单纯移植肝细胞;Ⅲ组:肝细... 详细信息

目的探讨同种异体肝细胞腹腔内移植治疗急性肝衰竭大鼠的细胞排斥反应机制及肝再生增强因子(ALR)的免疫作用。方法采用D-氨基半乳糖诱导大鼠急性肝衰竭(ALF),诱导后24h,随机分成5组。Ⅰ组:注射生理盐水;Ⅱ组:单纯移植肝细胞;Ⅲ组:肝细胞移植联合CsA;Ⅳ组:肝细胞移植联合ALR;Ⅴ组:注射ALR;肝细胞和药物均腹腔内注射。观察大鼠的存活率、组织学改变、移植肝细胞存活情况,检测大网膜CD4、CD8、CD68。结果Ⅳ组存活率显著高于Ⅰ组(66.7%vs0%,P=0.001),余组间无差异。Ⅳ组移植肝细胞存活时间更长。d1-2大网膜CD68阳性率Ⅱ组高于Ⅰ、Ⅳ组;CD4、CD8阳性率Ⅰ、Ⅱ组均高于Ⅳ、Ⅴ组,且Ⅱ组CD4阳性率高于Ⅲ组。d14大网膜CD4、CD8、CD68阳性率各组间无差异,但Ⅳ组CD4、CD8、CD68阳性率d1-2均低于d14的,Ⅱ组CD68阳性率d1-2高于d14的。结论同种肝细胞腹腔内移植联合ALR能提高ALF大鼠的存活率,同种肝细胞移植能引起CD4、CD8、CD68介导的细胞免疫,ALR能有效的抑制同种异体细胞免疫,促进移植肝细胞存活和增殖。

关键词：肝再生增强因子肝细胞移植细胞免疫

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