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解剖学报 2015年第1期46卷 1-5页

作者：李晗杨慈清王聪睿胡阿珍付苏雷林俊堂新乡医学院生命科学技术学院河南新乡453003 河南省医用组织再生重点实验室河南新乡453003

目的探讨鸡胚发育过程中,sonic hedgehog（Shh）在脊髓中超表达后对神经纤维投射的影响。方法在鸡胚龄2.5～3d（E2.5～E3）时,利用鸡胚活体原位电转基因技术将Shh表达质粒和携带有报告基因绿色荧光蛋白（GFP）的质粒共转入鸡胚脊髓,E6... 详细信息

目的探讨鸡胚发育过程中,sonic hedgehog（Shh）在脊髓中超表达后对神经纤维投射的影响。方法在鸡胚龄2.5～3d（E2.5～E3）时,利用鸡胚活体原位电转基因技术将Shh表达质粒和携带有报告基因绿色荧光蛋白（GFP）的质粒共转入鸡胚脊髓,E6时取材切片,至少取3个材料,免疫荧光技术检验Shh的超表达,利用Open Book技术研究Shh在鸡胚脊髓中超表达后对神经纤维投射的影响。结果在脊髓组织切片水平上,免疫荧光结果表明,Shh在鸡胚脊髓中成功超表达,无论在组织切片上还是通过Open Book技术进行观察,与对照组相比,超表达后转染侧神经纤维都无法正常通过底板投射到对侧,表明Shh在鸡胚脊髓神经纤维投射方面具有重要作用。结论在鸡胚发育过程中,脊髓中Shh超表达后对神经纤维投射具有抑制作用。

关键词： Shh 神经纤维投射活体原位电转 Open Book 鸡胚

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金葡菌类肠毒素K原核表达载体构建及其生物学活性分析

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中国生物工程杂志 2015年第12期35卷 45-50页

作者：刘彦礼牛荣成杨芬朱文慧林俊堂新乡医学院生命科学技术学院新乡453003 河南省医用组织再生重点实验室新乡453003

目的:金葡菌类肠毒素K(SElK)原核表达载体构建及其生物学活性初步分析。方法:通过常规分子生物学技术将SElK基因片段插入载体p ET-28a中,阳性单菌落扩大培养,诱导目的基因表达后通过Ni+亲和层析纯化SElK重组蛋白;小鼠脾淋巴细胞增殖实... 详细信息

目的:金葡菌类肠毒素K(SElK)原核表达载体构建及其生物学活性初步分析。方法:通过常规分子生物学技术将SElK基因片段插入载体p ET-28a中,阳性单菌落扩大培养,诱导目的基因表达后通过Ni+亲和层析纯化SElK重组蛋白;小鼠脾淋巴细胞增殖实验及尾静脉注射后血常规检测SElK超抗原活性;进一步通过检测血清中谷丙转氨酶(ALT)、谷草转氨酶(AST)、乳酸脱氢酶(LDH)和肌酸激酶(CK)活性及尿素(Urea)和肌酐(CR)含量来评价SElK潜在肠毒性。结果:成功构建SElK原核表达载体,并通过Ni^+亲和层析获得高纯度SElK重组蛋白(>95%);随后的超抗原活性检测发现SElK能够在体外刺激小鼠脾淋巴细胞显著增殖,尾静脉注射后能够有效地刺激血液中淋巴细胞增殖;最终的肠毒性检测结果发现SElK能够显著增加血清中AST活性及Urea含量。结论:成功构建并纯化获得高纯度SElK重组蛋白,并对其超抗原活性及潜在肠毒性进行初步分析,为开发更优的抗肿瘤制剂提供备选药物。

关键词：超抗原金葡菌类肠毒素 T淋巴细胞血常规肠毒性

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N-cadherin通过β-catenin调控鸡胚脊髓连合纤维向对侧的投射

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中国免疫学杂志 2015年第10期31卷 1357-1360,1374页

作者：杨慈清李小英王聪睿张必超李晗林俊堂河南省医用组织再生重点实验室新乡453003 新乡医学院生命科学技术学院新乡453003

目的:阐明鸡胚发育过程中神经钙黏蛋白(N-cadherin)和β-连环蛋白(β-catenin)在脊髓连合纤维发育中的作用。方法:在鸡胚发育第3天(stage22),将N-cadherin和β-catenin干扰载体通过活体电转基因技术导入脊髓,电转后继续培养3 d(stage29)... 详细信息

目的:阐明鸡胚发育过程中神经钙黏蛋白(N-cadherin)和β-连环蛋白(β-catenin)在脊髓连合纤维发育中的作用。方法:在鸡胚发育第3天(stage22),将N-cadherin和β-catenin干扰载体通过活体电转基因技术导入脊髓,电转后继续培养3 d(stage29),取材、固定、包埋和切片。分为N-cadherin干扰组、β-catenin干扰组,β-catenin和N-cadherin共同干扰组以及转染p GU6-GFP-neo表达质粒对照组;采用荧光免疫组织化学法检测N-cadherin和β-catenin蛋白表达变化;根据GFP表达结果,观察脊髓连合纤维的投射情况。结果:在鸡胚发育过程中,在脊髓抑制N-cadherin的表达会降低β-catenin的表达;在Ncadherin抑制表达72 h后观察到脊髓连合纤维向对侧的投射产生被抑制;抑制β-catenin表达出现类似向对侧投射障碍;Ncadherin和β-catenin同时被干扰时,连合纤维投射的抑制效果相似。结论:N-cadherin参与调控脊髓连合纤维的发育过程,其部分作用机制可能是通过下调β-catenin的表达实现的。

关键词：鸡胚神经钙黏蛋白 β-连环蛋白神经纤维

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两种真核启动子体内外转录活性比较研究

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中国细胞生物学学报 2015年第10期37卷 1370-1376页

作者：刘彦礼于亚楠杨坤林俊堂新乡医学院生命科学技术学院河南省医用组织再生重点实验室新乡453003

启动子作为基因工程表达载体的核心组成部分,在很大程度上决定了目的基因的转录活性。为筛选出一个转录活性较高的真核启动子,以目的蛋白与增强型绿色荧光蛋白融合表达的形式,在体内外检测CMV和CAG两种真核启动子的转录活性。首先,通过... 详细信息

启动子作为基因工程表达载体的核心组成部分,在很大程度上决定了目的基因的转录活性。为筛选出一个转录活性较高的真核启动子,以目的蛋白与增强型绿色荧光蛋白融合表达的形式,在体内外检测CMV和CAG两种真核启动子的转录活性。首先,通过常规分子生物学技术将神经钙黏着蛋白(N-cad)克隆到p CAG-MCS-EGFP质粒中(携带CAG启动子),菌落PCR、双酶切及测序验证;与p EGFP-N-cad质粒(携带CMV启动子)一起通过磷酸钙法分别转染HEK293T细胞,比较两种质粒在体外细胞水平转染目的基因效率;随后,通过已建立的鸡胚脊髓活体电转方法比较两种质粒在活体鸡胚脊髓内转录目的基因效率,冷冻切片后进行荧光强度观察;而体内外实验均应用常规Western blot和RT-PCR技术验证目的基因N-cad在蛋白及基因水平上的表达。荧光显微镜观察结果表明,CMV启动子仅能在体外细胞水平上行使其转录活性,而CAG启动子可在体内体外高效行使其转录活性,进一步的Western blot和RT-PCR结果与荧光观察结果一致。该研究结果可为体内研究目的基因功能时的载体构建提供借鉴。

关键词：启动子转录活性活体电转技术增强型绿色荧光蛋白

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三种经典钙黏蛋白分子在鸡胚脊髓发育过程中的表达模式

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解剖学杂志 2015年第3期38卷 261-264,F0003页

作者：李晗杨慈清乔梁张必超于亚楠林俊堂新乡医学院生命科学技术学院新乡453003 新乡医学院河南省医用组织再生重点实验室新乡453003

目的：揭示神经钙黏蛋白、钙黏蛋白6与钙黏蛋白7在鸡胚脊髓发育过程中的时空表达模式。方法：取鸡胚正常发育过程 E3、E4、E5、E6、E8和 E10各时期的脊髓,原位杂交法检测神经钙黏蛋白、钙黏蛋白6与钙黏蛋白7在鸡胚脊髓发育过程中的时空... 详细信息

目的：揭示神经钙黏蛋白、钙黏蛋白6与钙黏蛋白7在鸡胚脊髓发育过程中的时空表达模式。方法：取鸡胚正常发育过程 E3、E4、E5、E6、E8和 E10各时期的脊髓,原位杂交法检测神经钙黏蛋白、钙黏蛋白6与钙黏蛋白7在鸡胚脊髓发育过程中的时空表达模式。结果：在 E3~E6时期,神经钙黏蛋白主要在神经上皮层、生皮节、脊索、顶板、底板以及背根神经节区域表达,E8~E10时期,其 mRNA 信号主要在灰质区和背根神经节；在 E3~E5时期,钙黏蛋白6主要在生皮节、顶板和底板表达,之后在顶板和底板的表达均减弱,主要在侧运动柱表达；E3~E6时期,钙黏蛋白7主要在生皮节、底板、基板背部、运动柱、背根和腹根强烈表达,E8之后其表达主要集中在灰质区和腹根。结论：神经钙黏蛋白、钙黏蛋白6与钙黏蛋白7不同的表达模式预示着它们在脊髓及其周围组织发育过程中扮演不同角色。

关键词：神经钙黏蛋白钙黏蛋白6 钙黏蛋白7 原位杂交表达模式

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Caspase-3和Caspase-9在PC-12细胞移植肿瘤模型中的表达及意义

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黑龙江畜牧兽医 2015年第5期 27-29,268页

作者：李小英杨慈清王聪睿付苏雷林俊堂新乡医学院生命科学技术学院河南新乡453003 河南省医用组织再生重点实验室河南新乡453003

为了在建立的PC-12细胞肿瘤移植模型基础上,对不同时间点肿瘤组织中的Caspase-3和Caspase-9的表达进行检测,探讨Caspase-3和Caspase-9在肿瘤发展过程中的作用和意义,试验将指数生长期的PC-12细胞以0.1 m L(1×107个/m L)的密度接种... 详细信息

为了在建立的PC-12细胞肿瘤移植模型基础上,对不同时间点肿瘤组织中的Caspase-3和Caspase-9的表达进行检测,探讨Caspase-3和Caspase-9在肿瘤发展过程中的作用和意义,试验将指数生长期的PC-12细胞以0.1 m L(1×107个/m L)的密度接种于出生第7天的昆明白小鼠右前肢腋窝皮下,在接种后的不同时间点(7,14,21天)分别进行取材,将肿瘤块及邻近组织一并取下,通过多聚甲醛固定、包埋剂包埋后进行冰冻切片,采用荧光免疫组织化学法对Caspase-3和Caspase-9的表达进行检测。结果表明:刚出生7天的昆明白小鼠,接种PC-12细胞后7天时便可以明显观察到肿瘤块的形成,在14天时肿瘤块最大,21天时肿块减小,到28天时肿瘤块基本消失;对照组小鼠肌肉组织中Caspase-3和Caspase-9都呈现低表达。在移植肿瘤7天的肿块实体组织中,Caspase-3和Caspase-9都呈阳性表达;在14天时实体组织中表达降低,但是在周围组织中的表达增强;在21天时周围组织的表达也减弱。说明普通昆明白小鼠幼鼠中不能够建立真正的肿瘤模型,但是短期内仍能形成瘤块,在不同时间点,Caspase-3和Caspase-9表达具有明显的区域和量的差异,但是Caspase-3和Caspase-9表达部位和表达量的变化具有相似性。

关键词： PC-12细胞细胞移植肿瘤 Caspase-3 Caspase-9

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体外转染CyclinA2基因对原代大鼠心肌细胞增殖的影响

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解剖学报 2015年第1期46卷 57-62页

作者：卢杏张进忠郭志坤常玉巧贾银明徐振平新乡医学院生命科学技术学院新乡医学院河南省医用组织再生重点实验室河南新乡453003 安阳市中医院心内科河南安阳455000 河南医学高等专科学校基础医学部生物学教研室郑州451191

目的探讨体外转染细胞周期素A2（Cyclin A2）基因对原代大鼠心肌细胞增殖的影响,为心脏再生提供细胞学依据。方法 SD乳鼠12只,分离、培养、鉴定原代乳鼠心肌细胞并分为3组,实验组：转染带有强化绿色荧光蛋白（GFP）和Cyclin A2基因的重... 详细信息

目的探讨体外转染细胞周期素A2（Cyclin A2）基因对原代大鼠心肌细胞增殖的影响,为心脏再生提供细胞学依据。方法 SD乳鼠12只,分离、培养、鉴定原代乳鼠心肌细胞并分为3组,实验组：转染带有强化绿色荧光蛋白（GFP）和Cyclin A2基因的重组腺病毒（Ad-Cyclin A2-GFP）;空病毒组：转染不含目的基因带有GFP的重组腺病毒（Ad-Null-GFP）;阴性对照组：未做转染处理,仅加入等量的培养基。利用GFP示踪技术,评估原代心肌细胞转染效率;转染后的细胞继续体外培养3～5d,利用免疫荧光技术分别检测Cyclin A2、磷酸化组蛋白H3（H3P）、心肌肌钙蛋白-T（c Tn T）。结果 1.荧光GFP示踪表明原代心肌细胞的转染效率高达（97±0.74）%;2.免疫荧光标记显示,空病毒组和对照组结果相似;心肌细胞特异性标记蛋白c Tn T分布于细胞质,原代心肌细胞纯度高达（95±0.62）%;心肌细胞Cyclin A2主要在胞核内聚集,少数分布于细胞质。H3P为核蛋白在细胞核内分布。3.转染Cyclin A2后,实验组H3P阳性率明显高于空病毒组和对照组,差异具有统计学意义（P〈0.05）;实验组可见大量多核细胞,以双核为主,伴少量3核细胞。结论腺病毒作为转染载体对原代心肌细胞有很好的侵染效率;Cyclin A2超表达促进原代心肌细胞形成双核。

关键词： Cyclin A2 心肌细胞增殖基因转染免疫荧光大鼠

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视网膜钙黏蛋白在中枢神经系统发育中的作用研究现状

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新乡医学院学报 2015年第9期32卷 804-806页

作者：于亚楠刘彦礼徐振平林俊堂新乡医学院生命科学技术学院河南新乡453003 河南省医用组织再生重点实验室河南新乡453003

钙黏蛋白通过介导神经系统中细胞间黏附,影响神经细胞的分选、迁移和定位以及轴突的生长和路径选择,在中枢神经系统发育中扮演重要角色。视网膜钙黏蛋白因最早在视网膜中被发现而命名,其隶属于经典钙黏蛋白家族中的I型钙黏蛋白,与其他... 详细信息

钙黏蛋白通过介导神经系统中细胞间黏附,影响神经细胞的分选、迁移和定位以及轴突的生长和路径选择,在中枢神经系统发育中扮演重要角色。视网膜钙黏蛋白因最早在视网膜中被发现而命名,其隶属于经典钙黏蛋白家族中的I型钙黏蛋白,与其他家族成员相比,视网膜钙黏蛋白在中枢神经系统发育过程中的功能,如神经元定位调控、轴突路径选择及突触连接等在国内外尚缺乏较深入的研究。因此,本研究就视网膜钙黏蛋白的结构及其在中枢神经系统中的作用作一综述,以期为研究与之相关的人类神经性疾病提供理论依据。

关键词：钙黏蛋白视网膜钙黏蛋白中枢神经系统神经疾病

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原钙黏蛋白家族在中枢神经系统发育过程中的表达特点及功能

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新乡医学院学报 2015年第9期32卷 800-803页

作者：张必超林俊堂新乡医学院生命科学技术学院河南新乡453003 河南省医用组织再生重点实验室河南新乡453003

原钙黏蛋白(Pcdh)家族是钙黏蛋白超家族中最庞大的1个亚家族,在哺乳动物中,已发现有70多个家族成员。根据基因组结构的差异,Pcdh家族可分为成簇Pcdh(Pcdh-α、Pcdh-β和Pcdh-γ)和非成簇Pcdh(Pcdh-δ和solitary Pcdh)。Pcdh主要在中枢... 详细信息

原钙黏蛋白(Pcdh)家族是钙黏蛋白超家族中最庞大的1个亚家族,在哺乳动物中,已发现有70多个家族成员。根据基因组结构的差异,Pcdh家族可分为成簇Pcdh(Pcdh-α、Pcdh-β和Pcdh-γ)和非成簇Pcdh(Pcdh-δ和solitary Pcdh)。Pcdh主要在中枢神经系统中表达,所以被认为在神经构筑及通路的形成过程中起重要作用,异常表达与一些神经类疾病的发生有关,因此具有十分重要的研究价值,但目前对其功能和机制知之甚少。本文总结了Pcdh在中枢神经系统的表达模式及其潜在的功能,为后续研究Pcdh在中枢神经系统的功能和机制提供基础信息。

关键词：原钙黏蛋白中枢神经系统表达功能

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音猬因子Sonic hedgehog在脊椎动物脊髓发育中的功能

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新乡医学院学报 2015年第9期32卷 795-799页

作者：李晗林俊堂新乡医学院生命科学技术学院河南新乡453003 河南省医用组织再生重点实验室河南新乡453003

脊髓是神经系统的重要组成部分,主要功能是传送脑与外周之间的神经信息。脊髓的发育过程受到众多分子调控,其中音猬因子是一种非常关键的分子,不仅作为形成素调控神经前体细胞的分化,控制脊髓背腹轴的形成,而且是一种双重功能的轴突导... 详细信息

脊髓是神经系统的重要组成部分,主要功能是传送脑与外周之间的神经信息。脊髓的发育过程受到众多分子调控,其中音猬因子是一种非常关键的分子,不仅作为形成素调控神经前体细胞的分化,控制脊髓背腹轴的形成,而且是一种双重功能的轴突导向分子,控制脊髓中联合神经元轴突的投射,使不同部位神经元间建立正确的连接。本文主要介绍音猬因子信号通路及其在脊髓形态建成和轴突导向方面的功能。

关键词：脊髓音猬因子形成素轴突导向

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