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Ferrostatin-1通过抑制铁死亡延缓D-gal诱导的心肌细胞衰老的研究

天津医药 2023年第1期51卷 19-23页

作者：熊喜成王一平王刚张甜包雅丽迪娜·艾尼瓦尔孙湛新疆医科大学基础医学院病理生理学教研室 830000 新疆地方病分子生物学重点实验室

目的探讨D-半乳糖(D-gal)诱导的心肌细胞衰老是否存在铁死亡及铁死亡抑制剂Ferrostatin-1(Fer-1)能否延缓心肌细胞衰老。方法通过不同水平(0、5、10、20、40、80、100 g/L)D-gal诱导H9C2心肌细胞损伤从而制备心脏衰老模型,采用MTT法... 详细信息

目的探讨D-半乳糖(D-gal)诱导的心肌细胞衰老是否存在铁死亡及铁死亡抑制剂Ferrostatin-1(Fer-1)能否延缓心肌细胞衰老。方法通过不同水平(0、5、10、20、40、80、100 g/L)D-gal诱导H9C2心肌细胞损伤从而制备心脏衰老模型,采用MTT法检测细胞活力,确定后续实验采用的D-gal质量浓度。将细胞分为Control组、D-gal组和Fer-1组。MTT法检测细胞活力;DCFH-DA法检测细胞内活性氧(ROS)水平;微板法检测细胞内还原型谷胱甘肽(GSH)含量;硫代巴比妥酸法检测细胞内丙二醛(MDA)含量;Western blot检测溶质载体家族7成员11(SLC7A11)、谷胱甘肽过氧化物酶4(GPx4)、P53蛋白表达水平;微量法检测细胞内β-半乳糖苷酶(β-GAL)活性。结果 MTT法结果显示,细胞活力随D-gal质量浓度升高而降低(P<0.05),后续实验采用D-gal质量浓度为20 g/L。与D-gal组相比,Fer-1组细胞活力增加(P<0.05);与Control组相比,D-gal组中ROS、MDA含量、P53蛋白表达水平、β-GAL活性增强,GSH含量、SLC7A11、GPx4蛋白表达水平降低(P<0.05);与D-gal组相比,Fer-1组中ROS、MDA含量、P53蛋白表达水平、β-GAL活性降低,GSH、SLC7A11、GPx4蛋白表达升高(P<0.05)。结论 D-gal诱导的心肌细胞衰老过程中发生了铁死亡,Ferrostatin-1可抑制铁死亡,从而延缓心肌细胞衰老。

关键词：肌细胞,心脏细胞衰老半乳糖铁死亡 D-gal Ferrostatin-1

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维吾尔族妇女宫颈癌与TFPI-2基因启动区甲基化关系研究

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中国肿瘤临床 2013年第2期40卷 76-80页

作者：阿比班.阿克拉阿比达.阿布都卡德尔阿布力孜.阿布杜拉新疆医科大学基础医学院生物化学教研室乌鲁木齐市830011 第一附属医院妇科新疆地方病分子生物学重点实验室

目的:研究组织因子抑制物2(TFPI-2)基因在维吾尔族妇女宫颈病变组织中的甲基化水平,探讨其甲基化水平变化与宫颈病变的关系。方法:收集维吾尔族妇女慢性宫颈炎、宫颈内瘤变(CIN、cervical intraepithelial neoplasia)Ⅰ/Ⅱ/Ⅲ和宫颈鳞癌... 详细信息

目的:研究组织因子抑制物2(TFPI-2)基因在维吾尔族妇女宫颈病变组织中的甲基化水平,探讨其甲基化水平变化与宫颈病变的关系。方法:收集维吾尔族妇女慢性宫颈炎、宫颈内瘤变(CIN、cervical intraepithelial neoplasia)Ⅰ/Ⅱ/Ⅲ和宫颈鳞癌(cervical squamous cell carcinoma,CSCC)患者的新鲜组织标本,提取高质量基因组DNA和RNA,设计TFPI-2基因启动子区CpG岛片段特异性PCR引物及RT-PCR引物,应用Sequenom MassARRAY甲基化DNA定量分析平台和半定量RT-PCR技术,对维吾尔族妇女宫颈组织DNA进行甲基化水平定量分析。结果:分析Sequenom MassArray质谱数据,TFPI-2基因启动子区CpG岛片段(目的片段)甲基化水平定量差异显著(P<0.05)。分别对TFPI-2的单点CpG位点甲基化水平差异进行分析,可见TFPI-2基因的目的片段的CpG-1、CpG-6、CpG-7、CpG-8、CpG-9和CpG-11等六个CpG位点甲基化率在肿瘤与正常对照之间均有统计学差异(P<0.05)并且两个CpG位点相关性很密切(r<0.5、P<0.01);半定量RT-PCR鉴定结果表明,TFPI-2 mRNA表达水平在宫颈炎组增高,在CINⅠ/Ⅱ/Ⅲ组降低,而在宫颈鳞癌组最低,宫颈炎组与宫颈癌组比较,差异均有统计学意义(P<0.01),说明该基因转录表达水平下调伴随着宫颈病变进程。结论:维吾尔族宫颈癌细胞内的TFPI-2基因启动子区CpG岛高甲基化与该基因表达水平变化密切关联。在维吾尔族妇女宫颈病变进程中TFPI-2基因启动子高甲基化是其基因的转录水平(mRNA)下调的重要原因,可能是宫颈癌的早期预警指标,为该基因甲基化相关的表观遗传学研究提供了依据。

关键词：组织因子抑制物2 启动子区甲基化宫颈癌维吾尔族妇女

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脂肪组织内脂素、脂联素的表达与代谢综合征

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中华高血压杂志 2009年第11期17卷 980-984页

作者：关亚群王延蛟孙丽丽张成艾克拜尔.艾力焦谊新疆医科大学基础医学院生物化学与分子生物学教研室新疆乌鲁木齐830011 新疆维吾尔自治区人民医院新疆乌鲁木齐830000

背景内脂素是最近发现的一种脂肪细胞因子,参与烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD)的合成,其表达受脂肪组织多少、分布、炎症状态等影响。大多数研究认为内脂素在高血压、糖尿病、动脉粥样硬化时增高,但也有报道是降低的。目的探讨代谢综合征(MS... 详细信息

背景内脂素是最近发现的一种脂肪细胞因子,参与烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD)的合成,其表达受脂肪组织多少、分布、炎症状态等影响。大多数研究认为内脂素在高血压、糖尿病、动脉粥样硬化时增高,但也有报道是降低的。目的探讨代谢综合征(MS)患者脂肪组织内脂素、脂联素表达水平的变化及其与MS的关系。方法按照2005年国际糖尿病联盟(IDF)关于MS的诊断标准选取择期行胆石症手术的MS患者36例,非MS患者32例。测量身高、体质量、腰围、臀围后,留取血样检测空腹血糖、血脂、空腹胰岛素、血浆脂联素和内脂素等指标。采用半定量RT-PCR方法检测网膜与腹部皮下脂肪组织脂联素与内脂素的表达情况。结果MS组网膜脂肪组织脂联素mRNA的表达量(0.73±0.16)显著低于非MS组(0.83±0.17,P<0.05);进行性别分组后发现,男性MS组与非MS组比较,网膜脂肪组织脂联素mRNA表达差异有统计学意义(0.69±0.17比0.83±0.19,P<0.05)。内脂素mRNA的表达量在组间差异无统计学意义。血浆脂联素水平与HDL-C呈正相关(r=0.513,P<0.05),网膜脂肪组织内脂素mRNA表达量与HOMA-IR呈正相关(r=0.219,P<0.05),血浆内脂素与总胆固醇、三酰甘油、低密度脂蛋白胆固醇呈正相关。结论脂肪组织脂联素的表达水平变化可能与MS的发生有关,而内脂素在代谢综合征及非代谢综合征间没有差别。

关键词：代谢综合征脂联素内脂素

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甲状腺乳头状癌组织中DAPK1与RARβ的表达及临床意义

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癌变．畸变．突变 2011年第2期23卷 114-118页

作者：武爽古丽扎热叶.艾库拉纳菲沙.卡德尔阿布力孜.阿布杜拉夏米西努尔.伊力克新疆医科大学基础医学院细胞生物教研室新疆医科大学基础医学院生化教研室新疆乌鲁木齐830011

目的:通过检测新疆地区甲状腺乳头状癌组织及甲状腺良性病变组织中DAPK1和RARβ的蛋白表达特点,探讨其在甲状腺乳头状癌发生发展中的意义。方法:采用免疫组织化学S-P法,检测DAPK1与RARβ在新疆地区38例甲状腺乳头癌、21例甲状腺良性腺瘤... 详细信息

目的:通过检测新疆地区甲状腺乳头状癌组织及甲状腺良性病变组织中DAPK1和RARβ的蛋白表达特点,探讨其在甲状腺乳头状癌发生发展中的意义。方法:采用免疫组织化学S-P法,检测DAPK1与RARβ在新疆地区38例甲状腺乳头癌、21例甲状腺良性腺瘤、13例桥本氏甲状腺炎、6例结节性甲状腺肿和6例癌旁正常甲状腺组织中的蛋白表达,并分析其与临床病理因素间的关系。结果:DAPK1在甲状腺乳头状癌中的阳性表达明显低于甲状腺腺瘤、桥本氏甲状腺炎、结节性甲状腺肿和癌旁正常甲状腺组织(P<0.01);RARβ在甲状腺乳头状癌中的阳性表达明显高于在甲状腺良性腺瘤、桥本氏甲状腺炎、结节性甲状腺肿和癌旁正常甲状腺组织(P<0.01);DAPK1与RARβ在甲状腺乳头状癌中的表达与患者的年龄、性别、民族无明显相关关系(P>0.05)。结论:DAPK1可能参与了甲状腺乳头状癌的发生发展过程。检测DAPK1和RARβ的表达水平可作为判断甲状腺乳头状癌转移和预后的参考指标。

关键词： DAPK1 RARβ 甲状腺癌免疫组织化学表达

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pIRES2-EGFP-BMP-2真核表达质粒转染兔骨髓间充质干细胞

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中国组织工程研究与临床康复 2008年第47期12卷 9226-9230页

作者：詹玉林库热西.玉努斯黄国虹白靖平新疆医科大学第一附属医院骨科新疆维吾尔自治区乌鲁木齐市830054 新疆医科大学基础医学院分子生物学教研室新疆维吾尔自治区乌鲁木齐市830011 新疆医科大学附属肿瘤医院新疆维吾尔自治区乌鲁木齐市830011

背景:骨形成蛋白2是骨基质中最重要骨生长因子,主要生物学作用是促进未分化的间充质细胞和骨系细胞的募集和分化,是骨生成的启动因子,可以作为骨修复基因治疗的理想目的基因。目的:使用前期已经构建成功的pIRES2-EGFP-BMP-2真核表达质... 详细信息

背景:骨形成蛋白2是骨基质中最重要骨生长因子,主要生物学作用是促进未分化的间充质细胞和骨系细胞的募集和分化,是骨生成的启动因子,可以作为骨修复基因治疗的理想目的基因。目的:使用前期已经构建成功的pIRES2-EGFP-BMP-2真核表达质粒转染兔骨髓间充质干细胞。设计、时间及地点:细胞学观察实验,于2007-12/2008-06在新疆医科大学自治区地方病分子生物学实验室完成。材料:良种新西兰大白兔由新疆医科大学动物试验中心提供,pIRES2-EGFP-BMP-2由本校分子生物学实验室构建、保存。方法:采用贴壁法及密度梯度离心法提取骨髓间充质干细胞。采用脂质体介导转染法将pIRES2-EGFP-BMP-2真核表达质粒转染兔骨髓间充质干细胞。主要观察指标:通过荧光显微镜、反转录聚合酶链式反应、免疫组织化学及Western免疫印迹检测其转录、表达活性。结果:转染的兔骨髓间充质干细胞细胞可见绿色荧光蛋白的持续表达,绿色荧光蛋白分布于整个细胞,呈胞浆分布,说明重组载体构建成功并能在体细胞中表达。转染pIRES2-EGFP-BMP-2的兔骨髓间充质干细胞经G418抗性筛选并传代、培养4周后,RT-PCR反应可扩增出112kb条带,大小与预期相符合。Western免疫印迹检测显示,经pIRES2-EGFP-BMP-2转染的兔骨髓间充质干细胞经在相对分子质量为30×103处显现单一特异性条带,表明为骨形成蛋白2基因表达产物。免疫组织化学显示,转染pIRES2-EGFP-BMP-2后经G418抗性筛选并传代、培养4周后的兔骨髓间充质干细胞细胞质中有棕黄色颗粒阳性信号。结论:用pIRES2-EGFP-BMP-2真核表达质粒成功转染兔骨髓间充质干细胞并获得表达。

关键词：兔骨髓干细胞 pIRES2-EGFP 骨形成蛋白2

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泡球蚴蛋白促进脂肪间充质干细胞向肝细胞分化的研究

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中国病原生物学杂志 2022年第4期17卷 425-429,434页

作者：刘辉毕晓娟杨宁柯颖孙立楚瑨孙涛吕国栋林仁勇新疆医科大学基础医学院生物化学与分子生物学教研室新疆乌鲁木齐830011 新疆医科大学第一附属医院临床医学研究院省部共建中亚高发病成因与防治国家重点实验室

目的探讨泡球蚴蛋白(Echinococcus multilocularis protein,EmP)促脂肪间充质干细胞(Adipose tissue Derived Mesenchymal Stem Cells,ADSCs)向肝细胞分化的作用。方法体外分离人脂肪组织来源的ADSCs,第三代(P3)ADSCs分为对照组(HDM肝细胞诱导分化组)和Em蛋白处理组(HDM+EmP组),经无血清肝细胞诱导培养基培养7、14和21 d,检测对照组和EmP处理组肝细胞样细胞(iHep)百分比、糖原染色面积、肝细胞标志物白蛋白(Albumin,ALB)的蛋白及基因表达水平。Western-Blot法检测p-GSK-3β的表达情况。结果 P3代ADSCs具有成脂及成骨分化能力并表达干细胞标志物(CD29、CD90和CD105等)。在ADSCs向肝细胞诱导分化14 d,EmP处理组iHep细胞百分比显著高于对照组(P<0.05),EmP处理组糖原染色面积显著高于对照组(P<0.05)。免疫荧光染色结果显示两组细胞在诱导分化7 d开始表达ALB,荧光强度随诱导时间增加呈增强趋势。qPCR结果显示在诱导分化后第14 d,EmP处理组ALB表达水平显著高于对照组,两组间具有统计学差异(P<0.05)。Western-Blot结果显示,诱导分化第7 d和14 d,EmP处理组p-GSK-3β蛋白表达水平显著高于对照组(P<0.01和P<0.05)。结论 Em蛋白可能通过激活GSK-3β而具有促进ADSCs向肝细胞分化的作用,本研究为临床应用ADSCs移植治疗泡型棘球蚴病奠定了基础。

关键词：泡球蚴蛋白脂肪间充质干细胞肝细胞分化 GSK-3β

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喀什维吾尔族宫颈癌患者HPV16型感染及其人类白细胞抗原-DQB1基因多态性的关系

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临床与实验病理学杂志 2011年第3期27卷 274-277,281页

作者：祖菲娅.艾力再努尔.阿布都热衣木拉莱.苏祖克武爽新疆医科大学第一附属医院妇科乌鲁木齐830054 新疆医科大学基础医学院病理学教研室乌鲁木齐830054 新疆地方病分子生物学实验室乌鲁木齐830054

目的探讨HPV16型病毒感染与宿主人类白细胞抗原HLA—DQB1基因多态性和喀什维吾尔族宫颈癌发生的相关性。方法采用导流杂交基因芯片技术及聚合酶联反应序列特异性寡核苷酸探针（Polymerase chain reaction sequence—specific oligonncle... 详细信息

目的探讨HPV16型病毒感染与宿主人类白细胞抗原HLA—DQB1基因多态性和喀什维吾尔族宫颈癌发生的相关性。方法采用导流杂交基因芯片技术及聚合酶联反应序列特异性寡核苷酸探针（Polymerase chain reaction sequence—specific oligonncleotide，PCR—SSO）法检测111例喀什维吾尔族宫颈癌患者、100例正常妇女宫颈组织HPV感染及型别分布和HLA—DQB1的等位基因。结果（1）111例宫颈癌患者中，HPV总感染率81．9％（91／111），其中HPV16型感染占的比例最高，为91．2％（83／91），100例正常宫颈组织中HPV阳性者为9例，阳性率为9．00％（9／100），其中HPV16阳性2例，两组之间差异有显著性（P〈0．01）。（2）***1％03在宫颈癌组中出现的频率明显低于对照组，两组之间差异有统计学意义（x^2=4，P=0，OR=0．607，95％CI=1．042～2．478）。HLA-DQB1＊06在宫颈癌组中出现的频率明显高于对照组，两组之间差异有统计学意义（X^2=7．112、P=0，0R=2，95％CI=1．204—3．549）。宫颈癌中HLA—DQB1＊06阳性者HPV16的感染率明显高于阴性者（X^2=4．907，P=0．027，OR=2，95％CI=1．092—6．840），两组比较差异有统计学意义，说明携带HLA—DQB1＊06等位基因的维吾尔族妇女更容易被HPV16感染。HLA-DQB1的其他等位基因在宫颈癌组及对照组中出现的频率差异无显著性（P〉0．05）。结论HLA-DQB1＊03可能为维吾尔族妇女宫颈癌的保护基因，而HLA—DQB1＊06可能与维吾尔族妇女对宫颈癌的遗传易感性有关，是维吾尔族妇女对宫颈癌的易感基因，HLA—DQB1＊06基因型可能增加了HPV16阳性妇女患宫颈癌的危险性，可能是维吾尔族妇女宫颈癌患病率高的原因之一。维吾尔族妇女宫颈癌易感基因及保护基因的检测可能在高危人群的检测及群体遗传干预工作中有一定的指导意义。

关键词：宫颈肿瘤人乳头瘤病毒16 喀什维吾尔族妇女 HLA—DQ抗原多态性单核苷酸

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维药西帕依溃结安在大鼠溃疡性结肠炎模型中对iNOS基因表达的影响

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世界华人消化杂志 2010年第4期18卷 350-354页

作者：黄静静库热西·玉努斯贺捷倪群陈艳马文静哈木拉提·吾甫尔新疆医科大学基础医学院生物化学教研室新疆维吾尔自治区乌鲁木齐市830011 新疆医科大学基础医学院机能中心新疆维吾尔自治区乌鲁木齐市830011 新疆医科大学厚博学院新疆维吾尔自治区乌鲁木齐市830011 新疆地方病分子生物学实验室新疆维吾尔自治区乌鲁木齐市830011

目的:检测维药西帕依溃结安对大鼠溃疡性结肠炎模型中诱导型一氧化氮合酶(iNOS)基因表达的影响,探讨药物的可能作用机制.方法:采用2,4-二硝基氯苯(DNCB)复合乙酸法构建溃疡性结肠炎大鼠模型,建立维药西帕依溃结安大、中、小剂量干预组... 详细信息

目的:检测维药西帕依溃结安对大鼠溃疡性结肠炎模型中诱导型一氧化氮合酶(iNOS)基因表达的影响,探讨药物的可能作用机制.方法:采用2,4-二硝基氯苯(DNCB)复合乙酸法构建溃疡性结肠炎大鼠模型,建立维药西帕依溃结安大、中、小剂量干预组及生理盐水阴性对照组(NS组),应用半定量RT-PCR和Western blot方法检测各组中iNOS mRNA和蛋白质的表达水平.结果:与NS组相比,维药西帕依溃结安各干预组iNOS mRNA表达水平无统计学意义,iNOS蛋白表达水平下调,差异有统计学意义(0.44±0.40 vs 1.00±0.07,P<0.05).结论:维药西帕依溃结安治疗溃疡性结肠炎可能是通过在转录后水平上调节iNOS的表达而发挥作用.

关键词：维药西帕依溃结安溃疡性结肠炎诱导型一氧化氮合酶

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嗜酸乳杆菌与复方缓溃乐混悬剂灌胃对溃疡性结肠炎大鼠肠损伤的修复作用观察

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山东医药 2021年第15期61卷 15-20页

作者：卡思木江·阿西木江库尔班乃木·卡合曼希林古丽·吾守尔吴桂霞许晨波库热西·玉努斯新疆医科大学基础医学院生物化学与分子生物学教研室乌鲁木齐830017 新疆医科大学第一附属医院新疆医科大学基础医学院生物学教研室新疆医科大学基础医学院生理学教研室新疆医科大学维吾尔医学院

目的观察嗜酸乳杆菌(Lac)与复方缓溃乐混悬剂(HKL)灌胃对溃疡性结肠炎(UC)大鼠损伤肠黏膜的修复作用。方法选用SPF级Wistar大鼠随机分成5组。除正常组外,UC组、HKL组、Lac组、联合干预(LH)组先用2,4,6-三硝基苯磺酸(TNBS)/乙醇灌肠法构... 详细信息

目的观察嗜酸乳杆菌(Lac)与复方缓溃乐混悬剂(HKL)灌胃对溃疡性结肠炎(UC)大鼠损伤肠黏膜的修复作用。方法选用SPF级Wistar大鼠随机分成5组。除正常组外,UC组、HKL组、Lac组、联合干预(LH)组先用2,4,6-三硝基苯磺酸(TNBS)/乙醇灌肠法构建大鼠UC模型,造模成功后第2天观察大鼠的一般精神状态,并检测体质量。HKL组、Lac组、LH组分别用HKL、Lac、HKL+Lac进行灌胃干预,连续干预14 d后,称取体质量,然后处死大鼠,并取结肠组织行组织病理学评分;处死大鼠前取腹主动脉血,流式细胞术检测大鼠腹主动脉血中CD4+T、CD8+T淋巴细胞及CD4+T细胞亚群Th1、Th2、Th17、Treg。结果与正常组相比,UC组造模成功后第2天起出现食欲减退、精神萎靡、活动量减少等现象,大部分大鼠出现稀便、黏液脓血便,体质逐渐变得虚弱。UC组大鼠结肠表现为凹凸不平、明显缩短、异常变大,病变部位肠壁增厚、坏死水肿,部分大鼠结肠颜色发黑、有糜烂与肠粘连、管壁僵硬;Lac组大鼠的结肠损伤程度有改善;LH组和HKL组结肠组织损伤改善比较明显,其中LH组大鼠损伤减轻程度最为明显。干预结束时,与正常组相比,UC组大鼠体质量降低(P<0.01);与UC组相比,干预组大鼠体质量均增加,以LH组和HKL组增加最明显(P均<0.01)。UC组大鼠组织损伤程度评分高于正常组(P<0.01),而干预后LH组、HKL组组织损伤程度评分下降(P均<0.01)。与正常组比较,UC组大鼠血液中CD3+T、CD4+T、CD8+T细胞百分比均下降(P均<0.05);与UC组相比,HKL组和LH组CD3+T细胞、CD4+T细胞比例均上升(P<0.05);UC组Th2和Th17细胞的百分比高于正常组(P<0.05),Treg百分比低于正常组(P<0.05);与UC组相比,LH组Th2和Th17细胞百分比下降(P<0.05),而Treg的百分比升高(P<0.05)。结论HKL对UC大鼠肠黏膜损伤的修复作用优于Lac,Lac联合HKL的修复作用最佳;Lac与HKL可能通过抑制血液中Th17细胞的分化、促进Treg细胞的分化而起作用的。

关键词：复方缓溃乐混悬剂嗜酸乳杆菌炎症性肠病溃疡性结肠炎 T细胞

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刚地弓形虫巨噬细胞迁移抑制因子基因敲除虫株的构建与鉴定

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中国寄生虫学与寄生虫病杂志 2022年第3期40卷 349-354页

作者：王杰温红阳陈滢安然罗庆礼沈继龙都建安徽医科大学基础医学院生化与分子生物学教研室合肥230032 人畜共患病安徽高校省级重点实验室合肥230032 安徽医科大学基础医学院感染性疾病研究中心合肥230032 病原生物学安徽省重点实验室合肥230032

目的构建并鉴定刚地弓形虫RH株巨噬细胞迁移抑制因子(Tgmif)基因敲除虫株。方法设计刚地弓形虫RH株Tgmif的单向导RNA(sgRNA)和点突变引物,将pSAG1::Cas9-U6::sgUPRT质粒定点突变为针对Tgmif基因的pSAG1::Cas9-U6::sg Tgmif质粒。构建含... 详细信息

目的构建并鉴定刚地弓形虫RH株巨噬细胞迁移抑制因子(Tgmif)基因敲除虫株。方法设计刚地弓形虫RH株Tgmif的单向导RNA(sgRNA)和点突变引物,将pSAG1::Cas9-U6::sgUPRT质粒定点突变为针对Tgmif基因的pSAG1::Cas9-U6::sg Tgmif质粒。构建含有Tgmif上游1001 bp(Tgmif-up)、二氢叶酸还原酶-胸苷酸合成酶基因(dhfr-ts)和Tgmif下游1011 bp(Tgmif-down)等3个片段的Tgmif供体质粒,从Tgmif供体质粒PCR扩增获得Tgmif供体DNA。将pSAG1::Cas9-U6::sg Tgmif质粒和Tgmif供体DNA混合后电击转染野生型刚地弓形虫RH株(RH_(WT))速殖子,用乙胺嘧啶培养7 d,筛选获得稳定表达乙胺嘧啶抗性的虫株并进行单克隆筛选,PCR扩增dhfr-ts上、下游同源臂和Tgmif鉴定Tgmif基因敲除单克隆株(RH_(ΔTgmif))。提取RH_(ΔTgmif)和RH_(WT)株虫体蛋白,蛋白质免疫印迹(Western blotting)分析TgMIF蛋白的表达情况。RH_(ΔTgmif)在人包皮成纤维(HFF)细胞中传代10代,吉氏染色,镜检计数100个HFF中速殖子数,评估RH_(ΔTgmif)在体外培养HFF细胞中的增殖能力,以RH_(WT)为对照。将20只BABL/c小鼠随机分为RH_(WT)组和RH_(ΔTgmif)组(10只/组),各组分别腹腔注射RH_(WT)或RH_(ΔTgmif)株速殖子(1000个/鼠),记录小鼠生存情况。弓形虫增殖能力的比较采用独立样本t检验,小鼠生存率的比较采用Log Rank检验。结果PCR检测结果显示,含Tgmif-up、dhfr-ts和Tgmif-down等3个片段的Tgmif供体DNA片段长5049 bp,与预期相符;RH_(ΔTgmif)株分别扩增出1387、1524 bp的dhfr-ts上、下游同源臂条带,RH_(WT)株无相应条带;RH_(WT)株扩增出1837 bp的Tgmif条带,RH_(ΔTgmif)株无相应条带。Western blotting分析结果显示,RH_(WT)株在相对分子质量(M_(r))12500处出现1条蛋白条带,RH_(ΔTgmif)株无相应的蛋白条带。吉氏染色镜检结果显示,100个HFF中RH_(ΔTgmif)株速殖子为(2986±69.20)个,高于RH_(WT)株的(2067±51.08)个(t=18.50,P<0.01)。体内毒力试验结果显示,RH_(WT)组小鼠在第7天出现死亡,在第9天全部死亡;RH_(ΔTgmif)组小鼠在第5天出现死亡,第7天全部死亡,两组之间的差异有统计学意义(χ^(2)=17.45,P<0.01)。结论成功构建Tgmif基因敲除弓形虫虫株RH_(ΔTgmif),RH_(ΔTgmif)株的毒力比RH_(WT)株强。

关键词：刚地弓形虫巨噬细胞迁移抑制因子基因敲除

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