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第十五次全国动物遗传育种学术讨论会

作者：刘艳黄海军高其双蒋思文农业动物遗传育种与繁殖教育部重点实验室＆农业部猪遗传育种重点开放实验室华中农业大学武汉市农业技术科学院畜牧兽医所生物技术实验室

引言胚胎干细胞(embryonic stem cells,ESCs)是由附植前早期胚胎内细胞团(inner cell mass,ICM)或附植后胚胎原始生殖细胞(primordial germ cells,PGCs)经体外分化抑制培养筛选出的一种多潜能细胞。自1981

关键词：胚胎干细胞内细胞团分离传代山羊

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猪流感病毒神经氨酸酶基因(N1和N2)在昆虫细胞中的表达

猪流感病毒神经氨酸酶基因(N1和N2)在昆虫细胞中的表达

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中国畜牧兽医学会畜牧兽医生物技术学分会暨中国免疫学会兽医免疫分会第七次研讨会

作者：万春和刘明刘春国杨涛中国农业科学院哈尔滨兽医研究所农业部动物流感重点开放实验室/兽医生物技术国家重点实验室福建省农业科学院畜牧兽医研究所

根据GenBank发表的N1和N2亚型猪流感NA基因序列设计引物,扩增出NA基因片段,将其克隆到pFastBacGP67A和pFastBacGP67C杆状病毒载体上,筛选阳性重组转座载体pFastBacGP67A-N1和pFastBacGP67C-N2,转化含有杆状病毒穿梭载体(Bacmid)的DH10Bac感受态细胞,构建杆状病毒表达载体获得重组转座子rBacmid-N1和rBacmid-N2,在脂质体介导下转染sf9昆虫细胞,获得重组杆状病毒rBv-N1和rBv-N2,再感染细胞,收获目的蛋白。通过SDS-PAGE蛋白电泳、免疫印迹法、免疫组化分析表明该蛋白得到表达,且具有良好的生物学活性。

关键词：猪流感病毒神经氨酸酶基因昆虫细胞杆状病毒表达

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H3N2亚型猪流感病毒HA基因序列测定及抗原性分析

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动物医学进展 2008年第3期29卷 5-9页

作者：刘大飞杨涛刘明刘春国桑学波刘大程中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室农业部动物流感重点开放实验室黑龙江哈尔滨150001 黑龙江农垦总局畜牧兽医总站哈尔滨分站．黑龙江哈尔滨150038 莱阳市城厢兽医站山东莱阳265200

采用RT～PCR技术对4株H3N2亚型猪流感病毒的HA基因进行了扩增，将获得的PCR产物分别与pMD18-T克隆载体连接，进行序列测定。测序结果显示，4个毒株均含有完整的开放阅读框，并且均未发现核苷酸插入或缺失现象；分离毒株间核苷酸同源性... 详细信息

采用RT～PCR技术对4株H3N2亚型猪流感病毒的HA基因进行了扩增，将获得的PCR产物分别与pMD18-T克隆载体连接，进行序列测定。测序结果显示，4个毒株均含有完整的开放阅读框，并且均未发现核苷酸插入或缺失现象；分离毒株间核苷酸同源性为99．4％～99．7％，氨基酸同源性为98．2％～99．3％。同源性分析表明，4个毒株与2003年的猪流感病毒广东分离株有很高同源性（均在99％以上），说明近段时间我国H3N2亚型的猪流感病毒变异不大，重组的频率不是很高，同时又与人流感病毒香港分离株有较高的同源性（均为99．4％）。交叉血凝抑制试验显示，S3株与其他3毒株抗原性差异明显。鉴于猪在流感病毒传播与复制间的特殊地位，应密切监测猪流感。

关键词：猪流感病毒 HA基因克隆抗原性分析

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H3N2亚型猪流感病毒的拯救

H3N2亚型猪流感病毒的拯救

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中国畜牧兽医学会畜牧兽医生物技术学分会暨中国免疫学会兽医免疫分会第七次研讨会

作者：杜金玲刘明杨涛刘春国李洪涛孙恩成万春和刘大飞陈浩齐金龙中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室农业部动物流感重点开放实验室黑龙江八一农垦大学动物科技学院福建省农科院畜牧兽医研究所

利用反向遗传学操作技术,以A/Swine/Henan/S4/01(H3N2)毒株为亲本株,采用RT-PCR技术对该病毒的8个基因片段分11段进行扩增,通过与双向转录载体pHW2000连接,转染293T和MDCK共培养细胞,成功拯救出全部基因均来自于A/Swine/Henan/S4/01(H3... 详细信息

利用反向遗传学操作技术,以A/Swine/Henan/S4/01(H3N2)毒株为亲本株,采用RT-PCR技术对该病毒的8个基因片段分11段进行扩增,通过与双向转录载体pHW2000连接,转染293T和MDCK共培养细胞,成功拯救出全部基因均来自于A/Swine/Henan/S4/01(H3N2)的猪流感病毒,生物学实验结果表明该拯救毒株在鸡胚半数感染量,组织培养半数感染量,稳定性试验等方面都与亲本株保持一致。拯救的H3N2亚型猪流感病毒经鸡胚多次传代后血凝价最高可达到1颐256,在接种MDCK60h后,血凝价可达到1颐64。H3N2亚型猪流感病毒的拯救成功,为研究流感病毒突破种间屏障分子机制和猪流感基因工程疫苗株的筛选奠定了基础。

关键词：猪流感 H3N2亚型反向遗传病毒拯救

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不同亚型流感病毒NP基因的原核表达研究

不同亚型流感病毒NP基因的原核表达研究

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第15届世界禽病大会、中国畜牧兽医学会2007年学术年会

作者：刘大飞杨涛刘明刘春国何利昆刘大程桑学波中国农业科学院哈尔滨兽医研究所农业部动物流感重点开放实验室兽医生物技术国家重点实验室中国农业科学院哈尔滨兽医研究所农业部动物流感重点开放实验室兽医生物技术国家重点实验室中国农业科学院哈尔滨兽医研究所农业部动物流感重点开放实验室兽医生物技术国家重点实验室中国农业科学院哈尔滨兽医研究所农业部动物流感重点开放实验室兽医生物技术国家重点实验室辽宁省动物疫病预防控制中心莱阳市城厢兽医站黑龙江农垦总局畜牧兽医总站哈尔滨分站

为了进一步研究 A 型流感病毒核蛋白功能及在诊断中的应用。本研究采用 RT-PCR 技术分别扩增 A/Swine/Guangdong/LM2/05(H1N1)、A/Chicken/Guangdong/W2/04(H5N1)流感病毒的 NP 基因,分别将其克隆到原核表达载体 pET30(a)上,在大肠杆菌... 详细信息

为了进一步研究 A 型流感病毒核蛋白功能及在诊断中的应用。本研究采用 RT-PCR 技术分别扩增 A/Swine/Guangdong/LM2/05(H1N1)、A/Chicken/Guangdong/W2/04(H5N1)流感病毒的 NP 基因,分别将其克隆到原核表达载体 pET30(a)上,在大肠杆菌中进行诱导表达。SDS-PAGE 和 Western-Blotting 检测表明：H1N1亚型猪流感病毒 NP 蛋白得到表达,并且能分别与 H1N1和 H5N1亚型流感病毒的鼠高免血清发生特异性反应,具有良好的反应活性;而 H5N1亚型禽流感病毒的重组 NP 蛋白未获得表达。结论为以 NP 蛋白为诊断抗原的诊断试剂的开发、ELISA 诊断方法的建立、及蛋白功能的研究奠定了基础;本结果同时说明不同毒株的 NP 蛋白在大肠杆菌中的表达具有一定差异性。

关键词：流感病毒原核表达

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H3N2亚型猪流感病毒HA基因序列测定及抗原性分析

H3N2亚型猪流感病毒HA基因序列测定及抗原性分析

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第七届全国病毒学学术研讨会暨第二届武汉现代病毒学国际研讨会

作者：刘大飞杨涛刘明刘春国何利昆桑学波刘大程中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室农业部动物流感重点开放实验室辽宁省动物疫病预防控制中心黑龙江农垦总局畜牧兽医总站哈尔滨分站莱阳市城厢兽医站

采用 RT-PCR 技术对4株 H3N2亚型猪流感病毒的 HA 基因进行了扩增,将获得的 PCR 产物分别与 pMD18-T 克隆载体连接,进行序列测定。测序结果显示:4 个毒株均含有完整的开放阅读框,并且均未发现核苷酸插入或缺失现象;分离毒

关键词：

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4株不同亚型流感病毒NP基因的原核表达

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动物医学进展 2007年第12期28卷 12-18页

作者：刘大飞杨涛刘明刘春国何利昆桑学波刘大程中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室农业部动物流感重点开放实验室黑龙江哈尔滨150001 辽宁省动物疫病预防控制中心辽宁沈阳110161 黑龙江农垦总局畜牧兽医总站哈尔滨分站黑龙江哈尔滨150038 莱阳市城厢兽医站山东莱阳265200

为了进一步研究A型流感病毒核蛋白功能及在诊断中的应用,采用RT-PCR技术分别扩增H1N1、H3N2、H5N1、H9N2等4株不同亚型流感病毒的NP基因,分别将其克隆到原核表达载体pET30(a)上,在大肠埃希菌中进行诱导表达。SDS-PAGE和Western blot检... 详细信息

为了进一步研究A型流感病毒核蛋白功能及在诊断中的应用,采用RT-PCR技术分别扩增H1N1、H3N2、H5N1、H9N2等4株不同亚型流感病毒的NP基因,分别将其克隆到原核表达载体pET30(a)上,在大肠埃希菌中进行诱导表达。SDS-PAGE和Western blot检测结果表明,H1N1亚型流感病毒NP蛋白得到表达,并且能分别与H1N1和H5N1亚型流感病毒的鼠高免血清发生特异性反应,具有良好的反应活性;而H3N2、H5N1、H9N2亚型流感病毒的重组NP蛋白未获得表达。本研究结果表明,不同毒株的NP蛋白在大肠埃希菌中的表达具有一定差异性,为把NP蛋白作为诊断抗原的开发、ELISA诊断方法的建立以及蛋白功能的研究奠定了基础。

关键词：流感病毒 NP基因原核表达

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表达载体pCAGGS显著增强禽流感DNA疫苗的免疫保护效果

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中国农业科学 2006年第4期39卷 825-830页

作者：姜永萍张洪波步志高李呈军赵有淑王秀荣于康震陈化兰中国农业科学院哈尔滨兽医研究所农业部动物流感重点开放实验室中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室农业部畜牧兽医总站

目的将A/Goose/GuangDong/1/96(H5N1)[GD/1/96(H5N1)]的HA基因插入鸡β-actin启动子高效真核表达载体pCAGGS,构建了DNA疫苗质粒pCAGGHA5,以提高H5亚型禽流感DNA疫苗的表达水平和免疫保护效果。方法将pCAGGHA5和表达GD/1/96(H5N1)HA基因的质粒pCIHA5通过间接免疫荧光法和Western-blot分析检测转染293T细胞后瞬时表达的HA抗原蛋白,随之将pCAGGHA5及pCIHA5分别以100μg和10μg剂量一次免疫3周龄SPF鸡,4周后用100LD50的HPAIVGD/1/96(H5N1)鼻腔途径进行攻击。结果间接免疫荧光法和Western-blot分析表明2种表达质粒均可正确表达H5亚型HA抗原蛋白,载体pCAGGS表达水平显著高于载体pCI;免疫SPF鸡后,100μgpCAGGHA5可形成5/5的免疫保护,100μgpCIHA5可形成2/4的免疫保护,10μgpCAGGHA5可形成对免疫鸡5/5的免疫保护,而10μgpCIHA5则基本不能形成免疫保护,pCAGGHA5诱导的HI抗体水平远远高于pCIHA5。结论鸡β-actin启动子表达载体pCAGGS可显著提高HA基因体外表达水平和H5亚型禽流感DNA疫苗诱导的保护性抗体免疫反应水平,增强免疫保护效果。

关键词：禽流感 H5亚型鸡β-actin启动子 DNA疫苗免疫保护

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HA基因密码子及表达载体优化的H5亚型禽流感DNA疫苗免疫保护效果比较

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农业生物技术学报 2006年第3期14卷 301-306页

作者：姜永萍张洪波李呈军步志高邓国华于康震陈化兰中国农业科学院哈尔滨兽医研究所农业部动物流感重点开放实验室/兽医生物技术国家重点实验室中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室农业部畜牧兽医总站

为评估HA基因密码子优化及不同表达载体对H5亚型禽流感DNA疫苗免疫效果的影响,pCIHA5、pCAGGHA5、pCIoptiHA5和pCAGGoptiHA5分别以100和10μg剂量一次免疫3周龄SPF鸡,4周后分别用100LD50的高致病力禽流感病毒(HPAIV)A/Goose/GuangDong/1/96(H5N1)[GD/1/96(H5N1)]鼻腔途径进行攻击,观察发病与死亡情况,分别于攻毒后第3、5和7无采集喉头及泄殖腔拭子进行病毒分离、滴定检测排毒情况,同时检测免疫后、攻毒前及攻毒后血清HI抗体、AGP抗体的动态变化,对4种疫苗单次免疫的免疫保护效果进行比较评估。结果表明,100μg剂量组中,pCAGGoptiHA5和pCAGGHA5均可对免疫鸡形成100%完全保护(不发病、不致死和不排毒),pCIoptHA5(75%)和pCIHA5(50%)仅可形成部分免疫保护;10μg剂量免疫组中,pCAGGoptiHA5和pCAGGHA5可对免疫鸡形成100%的保护(不发病和不致死),pCIoptiHA5可形成对免疫鸡的部分免疫保护(75%),而pCIHA5则基本不能形成免疫保护。结果表明,HA基因密码子的优化以及鸡β-actin启动子表达载体pCAGGS可显著提高H5亚型禽流感DNA疫苗诱导的保护性抗体免疫反应水平,增强免疫保护效果同时证明,通过密码子和载体的优化,可使H5亚型禽流感DNA疫苗有效免疫保护剂量降低至10μg,其推广应用已具备充分的经济可行性。pCAGGoptiHA5作为免疫效果良好、成本低廉的优化DNA疫苗,有望成为预防H5亚型高致病力禽流感的高效、安全新型基因工程疫苗。

关键词：禽流感 H5亚型 DNA疫苗免疫保护

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鸡沙门氏菌外膜蛋白的免疫效果观察

鸡沙门氏菌外膜蛋白的免疫效果观察

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全国人畜共患病学术研讨会

作者：成进李文蓉谷文喜沙依兰古丽依米提新疆畜牧科学院兽医研究所新疆畜牧科学院农业部畜牧兽医生物技术重点开放实验室

用含EDTA的提取剂制备了鸡沙门氏菌外膜蛋白(OMP),经琼脂扩散试验检测,与同源株抗血清出现特异性沉淀线,与不同源株出现完全同源和部分同源的沉淀线,经SDS-PAGE分析,OMP抗原所含的蛋白质分子量介于14～67KD之间,并用电洗脱方法分别制备... 详细信息

用含EDTA的提取剂制备了鸡沙门氏菌外膜蛋白(OMP),经琼脂扩散试验检测,与同源株抗血清出现特异性沉淀线,与不同源株出现完全同源和部分同源的沉淀线,经SDS-PAGE分析,OMP抗原所含的蛋白质分子量介于14～67KD之间,并用电洗脱方法分别制备了分子量为20～30KD、30～43KD和43～67KD的OMP抗原组分,并将起用于免疫攻毒试验,结果表明,OMP铝佐剂疫苗对鸡的死亡保护率为89.4%,油乳剂疫苗组为97.5%,OMP中起主要保护作用的是分子量为30～43KD组分的蛋白质。

关键词：鸡沙门氏菌外膜蛋白免疫效果

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