目的克隆屋尘螨(Dermatophagoides pteronyssinus)第十类变应原Der p 10基因,表达并纯化Der p 10重组蛋白,分析其免疫原性和生物学信息。方法挑取经纯培养的屋尘螨,提取总RNA,逆转录生成cDNA,RT-PCR扩增Der p 10基因。将pET-24a载体与De...
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目的克隆屋尘螨(Dermatophagoides pteronyssinus)第十类变应原Der p 10基因,表达并纯化Der p 10重组蛋白,分析其免疫原性和生物学信息。方法挑取经纯培养的屋尘螨,提取总RNA,逆转录生成cDNA,RT-PCR扩增Der p 10基因。将pET-24a载体与Der p 10基因连接并转化入Top10克隆菌体中,经BamHⅠ和XhoⅠ双酶切鉴定和测序后转入大肠埃希菌BL21(DE3)中,1 mmol/L IPTG诱导后,采用12%十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)分析重组蛋白表达情况。经Ni+离子亲和层析纯化后,以尘螨过敏患者血清为一抗,蛋白质免疫印迹(Western blotting)分析重组蛋白的免疫原性。使用ProtParam Tools、HNN、SWISS MODEL、DNAStar预测Der p 10的理化性质、原肌球蛋白的二级和三级结构、B细胞抗原表位,Blastp和MEGA工具构建Der p 10系统进化树。结果RT-PCR获得目的基因Der p 10,其开放阅读框为855 bp,可编码284个氨基酸。双酶切结果显示Der p 10已连接至载体上。SDS-PAGE分析结果显示,Der p 10重组蛋白相对分子质量(Mr)为38000,为可溶性蛋白。Western blotting分析结果显示,Der p 10重组蛋白与尘螨过敏患者血清反应呈阳性结果。信息学分析结果显示,Der p 10蛋白不稳定,二级结构和三级结构均以α-螺旋为主。DNAStar预测到Der p 10存在1个B细胞抗原表位肽序列。Blastp和MEGA分析结果显示,与粉尘螨Der f 10亲缘关系较近,序列相似性达94.4%。结论成功构建Der p 10表达菌并纯化出与尘螨过敏患者血清中的IgE抗体结合较高及纯度较好的Der p 10重组蛋白并证实其反应原性。
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