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生理学报 2010年第1期62卷 73-78页

作者：王跃春张洹段阿林林伟霞郑乔丹徐文璐暨南大学医学院生理学教研室广州510632 暨南大学医学院血液病研究所广州510632

为探讨用单纯生物学制剂诱导人脐带间充质干细胞(mesenchymal stem cells derived from human umbilical cord,hUC-MSCs)向胰岛素分泌细胞分化的可行性,本研究用胶原酶Ⅱ、胰蛋白酶次序消化及两步离心法从人胎儿完整脐带中分离、纯化出h... 详细信息

为探讨用单纯生物学制剂诱导人脐带间充质干细胞(mesenchymal stem cells derived from human umbilical cord,hUC-MSCs)向胰岛素分泌细胞分化的可行性,本研究用胶原酶Ⅱ、胰蛋白酶次序消化及两步离心法从人胎儿完整脐带中分离、纯化出hUC-MSCs;用表皮生长因子、碱性成纤维生长因子、银杏提取液和高糖培养基IMDM诱导hUC-MSCs向胰岛素分泌细胞分化。在hUC-MSCs诱导前后,用倒置显微镜观察其形态变化,RT-PCR检测其胰岛相关基因的表达;双硫腙染色鉴定胰岛样细胞团(islet-like clusters,ILCs);细胞免疫荧光染色检测ILCs中PDX-1和免疫活性胰岛素(immunoreactive insulin,IRI)的表达;化学发光法检测ILCs的IRI分泌量;Western blot鉴定IRI的性质。结果显示:纯化的hUC-MSCs呈间充质干细胞特有的形态特征:长梭形,平行或螺旋形排列;在上述单纯生物学制剂的诱导下,hUC-MSCs逐渐变圆并聚集成团;在25cm2培养瓶的细胞生长面可见上百个ILCs;ILCs表达胰岛特异性基因pdx-1、insulin;ILCs呈PDX-1和IRI免疫染色阳性反应,双硫腙染色呈阳性;ILCs可分泌IRI,但多为胰岛素原(proinsulin,PI)。以上结果提示,用表皮生长因子、碱性成纤维生长因子、银杏提取液和高糖培养基IMDM可诱导hUC-MSCs快速分化为胰岛素分泌细胞,但ILCs功能不够成熟,难以产生足量真胰岛素。

关键词：脐带间充质干细胞胰岛素分泌细胞细胞分化生物学制剂

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独特型TCR Vα1-pIRES-TCR Vβ8表达载体构建及体外表达

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细胞与分子免疫学杂志 2008年第1期24卷 30-33页

作者：李闯吴秀丽李扬秋周羽竝陈少华杨力建朱康儿暨南大学医学院血液病研究所广东广州510632 暨南大学医学院生物化学教研室广东广州510632

目的:构建Jurkat细胞株独特型TCR Vα1-pIRES-TCR Vβ8表达载体,转染后了解其体外表达情况。方法:根据聚合酶链反应-基因扫描(PCR-Genescan)检测Jurkat细胞株TCR Vα及Vβ亚家族表达情况,分别将其所表达的单克隆性的TCR Vα1及TCR Vβ8... 详细信息

目的:构建Jurkat细胞株独特型TCR Vα1-pIRES-TCR Vβ8表达载体,转染后了解其体外表达情况。方法:根据聚合酶链反应-基因扫描(PCR-Genescan)检测Jurkat细胞株TCR Vα及Vβ亚家族表达情况,分别将其所表达的单克隆性的TCR Vα1及TCR Vβ8亚家族基因片段克隆至质粒pIRES的多克隆位点A(MCS A)和多克隆位点B(MCS B)中。通过限制性酶切分析、序列分析、RT-PCR、间接免疫荧光、流式细胞术(FCM)手段鉴定重组表达载体的正确性以及转染A549和Molt4细胞后基因及蛋白的表达情况。结果:构建了2组TCR Vα1-pIRES-TCR Vβ8表达载体,该表达载体转染A549和Molt4细胞后,在mRNA和蛋白水平检测到了TCR Vα1和TCR Vβ8的表达。结论:成功构建了2种独特型Vα1-pIRES-TCR Vβ8真核表达载体,为利用特异性TCR基因修饰T细胞的研究提供方法学依据。

关键词： Jurkat细胞株 T细胞受体转基因

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VEGF siRNA致中国仓鼠肺细胞染色体畸变的研究

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卫生研究 2011年第5期40卷 576-578页

作者：荆春霞张洹杨光吴赤蓬何林暨南大学医学院流行病学教研室广州510632 暨南大学医学院血液病学研究所广州510632 暨南大学医学院寄生虫系广州510632 暨南大学医学院卫生学教研室广州510632

目的研究VEGF siRNA对中国仓鼠肺细胞(CHL)的染色体畸变作用。方法采用25、50和100nmol/L的VEGF siRNA转染中国仓鼠的肺细胞,分别观察24h、48h后的染色体畸变情况。结果在VEGF siRNA转染24小时,仅100nmol/L VEGF siRNA产生可疑阳性反应... 详细信息

目的研究VEGF siRNA对中国仓鼠肺细胞(CHL)的染色体畸变作用。方法采用25、50和100nmol/L的VEGF siRNA转染中国仓鼠的肺细胞,分别观察24h、48h后的染色体畸变情况。结果在VEGF siRNA转染24小时,仅100nmol/L VEGF siRNA产生可疑阳性反应,其染色体的畸变率为6%;在VEGF siRNA转染48小时后,50nmol/L的VEGF siRNA和100nmol/L的VEGF siRNA均产生可疑阳性反应,染色体的畸变率分别为6%和10%。而25nmol/L的VEGF siRNA无论是在转染后24h还是48h,均未产生染色体的畸变作用。VEGF siRNA产生的染色体畸变类型有断裂、双着丝粒、多倍体、裂隙、三射体。结论 100nmol/L的VEGF siRNA分子可引起CHL细胞产生染色体畸变。

关键词：血管内皮生长因子 VEGF siRNA 中国仓鼠肺细胞(CHL) 染色体畸变

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细胞与分子免疫学杂志 2009年第2期25卷 136-138页

作者：陈少华李扬秋杨力建周羽竝李萡张学利罗更新暨南大学医学院血液病研究所暨南大学再生医学教育部重点实验室暨南大学医学院生化教研室暨南大学第一附属医院血液科广东广州510632

目的:分析急性早幼粒细胞白血病(APL)患者外周血TCRVα和Vβ克隆性增殖T细胞及CDR3序列特点。方法:利用RT-PCR法扩增1例APL患者外周血单个核细胞中29个TCRVα基因和24个Vβ基因CDR3,阳性PCR产物进一步经荧光标记和基因扫描分析确定其CDR... 详细信息

目的:分析急性早幼粒细胞白血病(APL)患者外周血TCRVα和Vβ克隆性增殖T细胞及CDR3序列特点。方法:利用RT-PCR法扩增1例APL患者外周血单个核细胞中29个TCRVα基因和24个Vβ基因CDR3,阳性PCR产物进一步经荧光标记和基因扫描分析确定其CDR3长度,了解其克隆性;寡克隆的PCR产物再进行CDR3区序列分析。结果:该例APL患者外周血T细胞分别在TCRVα6、Vα10和Vβ23亚家族中出现寡克隆性增殖T细胞,经序列分析显示TCRVα6、Vα10和Vβ23亚家族基因序列分别为Vα6NJα17、Vα10NJα35和Vβ23NDβ1NJβ2.7,其CDR3区氨基酸序列分别为CAMRENSAGNK,YLCAGDELLWECA,CASSSKWAG-GTYEQY,该3个TCR基因已被GenBank收录(登陆号:EU544946、EU544947和EU647219)。结论:APL患者外周血T细胞出现的TCRVα6、Vα10和Vβ23克隆性增殖T细胞可能是机体对抗白血病细胞所引起的抗原特异性免疫反应;这3个独特TCR重排序列将进一步作为开展APL特异性免疫治疗研究提供资料。

关键词： APL TCR CDR3 T细胞克隆

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PML-RARα多肽诱导脐血TCR VβT细胞增殖研究

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肿瘤防治研究 2005年第9期32卷 529-532页

作者：汤冀李扬秋杨力建陈少华周羽竝暨南大学医学院血液病研究所广州510632 暨南大学医学院生化教研室广州510632

目的了解PMLRARα多肽诱导脐血T细胞的T细胞受体(TCR)Vβ谱系表达和克隆性情况。方法以不同浓度(16.7μg/mL,33.3μg/mL或50μg/mL)的PMLRARα多肽联合IL2、抗CD3单抗以及抗CD28单抗诱导脐血T细胞增殖,利用RTPCR基因扫描技术分析诱导后... 详细信息

目的了解PMLRARα多肽诱导脐血T细胞的T细胞受体(TCR)Vβ谱系表达和克隆性情况。方法以不同浓度(16.7μg/mL,33.3μg/mL或50μg/mL)的PMLRARα多肽联合IL2、抗CD3单抗以及抗CD28单抗诱导脐血T细胞增殖,利用RTPCR基因扫描技术分析诱导后第3、6、9、12天后的脐血TCRVβ亚家族的利用和克隆性增殖的特点。结果限制性表达和克隆性增殖TCRVβ亚家族T细胞可见于PMLRARα多肽诱导后脐血T细胞。结论PMLRARα多肽可在体外诱导脐血T细胞呈克隆性增殖,此优势增殖的克隆性T细胞可能具有特异性细胞毒作用。

关键词：脐血急性早幼粒细胞白血病 T细胞受体克隆性

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实时荧光定量PCR分析脐血T细胞亚群中TRECs水平

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免疫学杂志 2004年第5期20卷 407-407,409页

作者：李扬秋杨力建陈少华韩素芳周羽竝陈青山暨南大学医学院血液病研究所广东广州510632 暨南大学医学院生化教研室广东广州510632 暨南大学医学院流行病学教研室广东广州510632

近期研究发现成人胸腺仍存在活化T细胞合成的功能，：胸腺近期功能需要通过测定胸腺近期输出的幼稚（Nail）T细胞的数量来衡量。而能够作为Nai＊eT细胞的标志的是T细胞受体删除DNA环（T-cell receptor excision DNA circles，TRECs）［... 详细信息

近期研究发现成人胸腺仍存在活化T细胞合成的功能，：胸腺近期功能需要通过测定胸腺近期输出的幼稚（Nail）T细胞的数量来衡量。而能够作为Nai＊eT细胞的标志的是T细胞受体删除DNA环（T-cell receptor excision DNA circles，TRECs）［1］。我们的前期研究也提供了正常人外周血T细胞和胸腺细胞中TRECs含量的情况［2］，本研究进一步分析脐血中不同组分T细胞的TRECs含量特点。

关键词：实时荧光定量PCR 脐血 T细胞亚群 TRECs 胸腺细胞外周血

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靶向抑制微小RNA-21提高白血病细胞对三氧化二砷的敏感性研究

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中国中西医结合杂志 2010年第2期30卷 170-173页

作者：李育敏谷景义朱雪娇陈万群郭敏姚君琳林春燕费嘉暨南大学医学院生物化学与分子生物学教研室广州510632 暨南大学医学院血液病研究所暨南大学医学院临床医学系

目的探讨以微小RNA-21(microRNA-21,miRNA-21)为靶标的反义核酸(AMO-miR-21)提高白血病K562细胞对三氧化二砷(As2O3)的敏感性及可能的作用机制。方法利用LipofectamineTM 2000将化学合成的反义核酸转染K562细胞。MTT法检测单独使用AMO-m... 详细信息

目的探讨以微小RNA-21(microRNA-21,miRNA-21)为靶标的反义核酸(AMO-miR-21)提高白血病K562细胞对三氧化二砷(As2O3)的敏感性及可能的作用机制。方法利用LipofectamineTM 2000将化学合成的反义核酸转染K562细胞。MTT法检测单独使用AMO-miR-21、As2O3以及两者联合使用对细胞增殖的抑制作用,并计算抑制率和IC50;PI单染检测细胞周期及凋亡;实时定量PCR检测miRNA-21表达水平的改变;免疫荧光法检测miRNA-21候选靶基因PDCD4蛋白表达的改变。结果AMO-miR-21与As2O3联合使用后,IC50从2.10μmol/L降低到1.23μmol/L,敏感性提高到单用As2O3的1.78倍;AMO-miR-21联合As2O3组细胞凋亡明显增加(P<0.05);单独转染AMO-miR-21可显著抑制K562细胞中miRNA-21的表达水平(P<0.01),同时抑癌基因PDCD4蛋白表达明显增加(P<0.05)。结论AMO-miR-21与As2O3联合使用可提高K562细胞对As2O3的敏感性,为白血病的治疗提供了新的方法。AMO-miR-21通过靶向抑制miRNA-21,进而上调抑癌基因PDCD4的表达而发挥抗肿瘤作用。

关键词：微小RNA-21 反义寡核苷酸三氧化二砷白血病化疗敏感性

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干细胞源胰岛素分泌细胞中胰岛素原转化障碍的原因及对策

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生命科学 2009年第4期21卷 536-541页

作者：王跃春段阿林李佳穗张洹暨南大学医学院生理教研室广州510632 暨南大学医学院血液病研究所广州510632

近年来,诱导干细胞向功能性胰岛素分泌细胞分化已取得了较大进展,但不论何种干细胞来源,采取何种诱导方案,诱导的胰岛素分泌细胞均不同程度地存在着胰岛素原向胰岛素转化的障碍,严重影响了其治疗糖尿病的效果。该文从胰岛素合成和分泌... 详细信息

近年来,诱导干细胞向功能性胰岛素分泌细胞分化已取得了较大进展,但不论何种干细胞来源,采取何种诱导方案,诱导的胰岛素分泌细胞均不同程度地存在着胰岛素原向胰岛素转化的障碍,严重影响了其治疗糖尿病的效果。该文从胰岛素合成和分泌的生理学角度探讨胰岛素分泌细胞不成熟的原因及机制,从而指出目前在干细胞向胰岛素分泌细胞诱导过程中存在的不足并提出相应的解决办法。

关键词：干细胞胰岛素分泌细胞胰岛素原胰岛素

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实时定量PCR检测白血病中BCL11B基因的表达水平

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免疫学杂志 2006年第4期22卷 463-465页

作者：李扬秋陈少华杨力建陈青山暨南大学医学院血液病研究所广州510632 暨南大学医学院流行病学教研室广州510632

目的建立BCL11B基因的定量检测方法,并分析其在白血病中的表达水平。方法利用实时定量RTPCR分析TALL(12例)、BALL(8例)、BCLL(6例)、AML(7例)和正常对照(10例)外周血单个核细胞(PBMC)中BCL11B基因的表达水平,以β2微球蛋白(β2M)基因表... 详细信息

目的建立BCL11B基因的定量检测方法,并分析其在白血病中的表达水平。方法利用实时定量RTPCR分析TALL(12例)、BALL(8例)、BCLL(6例)、AML(7例)和正常对照(10例)外周血单个核细胞(PBMC)中BCL11B基因的表达水平,以β2微球蛋白(β2M)基因表达水平作为内对照。结果TALL患者PBMC中BCL11B表达水平(553.84±564.01拷贝105β2M拷贝)明显高于正常对照和其他白血病患者(P=0.006,P=0.013,P=0.031,P=0.020);而AML组BCL11B表达水平(0.02±0.04拷贝105β2M拷贝)则明显低于正常对照组(P=0.000)、BALL组(P=0.006)和TALL组(P=0.020);BALL(1.99±1.59拷贝105β2M拷贝)和BCLL(2.26±3.57拷贝105β2M拷贝)中BCL11B表达水平与正常对照(2.20±1.01拷贝105β2M拷贝)无显著差别。结论建立了实时定量RTPCR检测BCL11B方法,TALL中BCL11B高表达可能与其发病有一定关系。

关键词： BCL11B基因白血病实时定量PCR

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BCR/ABL和SEA双基因重组载体的构建和表达

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暨南大学学报（自然科学与医学版） 2010年第4期31卷 336-340页

作者：田红霞林晨查显丰周羽竝黄欣高永鹏李扬秋暨南大学医学院微免教研室广东广州510632 暨南大学医学院血液病研究所广东广州510632 暨南大学医学院生化教研室广东广州510632

目的:构建和表达含BCR/ABL融合基因和葡萄球菌肠毒素A(SEA)的真核双表达质粒。方法:利用RT-PCR技术从K562细胞中扩增出含BCR/ABL融合位点基因片段,提取金黄色葡萄球菌基因组DNA扩增出SEA基因,分别将两基因片段连在pIRES载体的多克隆位点... 详细信息

目的:构建和表达含BCR/ABL融合基因和葡萄球菌肠毒素A(SEA)的真核双表达质粒。方法:利用RT-PCR技术从K562细胞中扩增出含BCR/ABL融合位点基因片段,提取金黄色葡萄球菌基因组DNA扩增出SEA基因,分别将两基因片段连在pIRES载体的多克隆位点A和B上,构建BCR/ABL-pIRES-SEA、SEA-pIRES-BCR/ABL重组质粒。将重组质粒转染K293细胞,RT-PCR鉴定重组质粒在真核细胞的转录情况,SDS-PAGE电泳鉴定目的蛋白在真核细胞的表达。结果:成功扩增出BCR/ABL和SEA基因片段;双酶切鉴定BCR/ABL-pIRES-SEA、SEA-pIRES-BCR/ABL重组质粒中含有BCR/ABL和SEA基因,测序证实完全正确;将重组质粒转染K293细胞后,经RT-PCR扩增鉴定,插入到重组质粒的BCR/ABL和SEA基因能在真核细胞正常转录,经SDS-PAGE电泳鉴定重组质粒能够在真核细胞中表达BCR/ABL和SEA蛋白。结论:成功构建BCR/ABL-pIRES-SEA、SEA-pIRES-BCR/ABL真核双表达质粒,可在真核细胞中正常转录并表达BCR/ABL和SEA蛋白。

关键词： BCR/ABL融合基因金黄色葡萄球菌肠毒素A 慢性粒细胞白血病 DNA疫苗

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