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中国兽医科学 2014年第4期44卷 373-378页

作者：梁云浩曹琛福陶虹吕建强唐勇暨南大学广东省分子免疫与抗体工程重点实验室广东广州510632 深圳出入境检验检疫局动植物检验检疫技术中心广东深圳518045

利用Bac-to-Bac杆状病毒表达系统表达出非洲猪瘟病毒P54蛋白。经SDS-PAGE和Westernblot分析后,以P54重组蛋白作为检测抗原包被酶标板,通过优化各反应条件,建立了检测非洲猪瘟血清抗体的间接ELISA方法。结果显示,P54重组蛋白的大小约为25... 详细信息

利用Bac-to-Bac杆状病毒表达系统表达出非洲猪瘟病毒P54蛋白。经SDS-PAGE和Westernblot分析后,以P54重组蛋白作为检测抗原包被酶标板,通过优化各反应条件,建立了检测非洲猪瘟血清抗体的间接ELISA方法。结果显示,P54重组蛋白的大小约为25ku;经Western-blot试验证实,它具有良好的抗原性。建立的间接ELISA方法的检测灵敏度可达1∶320,批内、批间变异系数均小于10%。与商品化的非洲猪瘟竞争ELISA试剂盒比较,符合率达100%。用该间接ELISA方法检测其他不同疫病猪的阳性血清样本,结果均为阴性,表明无交叉反应。结果表明,建立的用以检测非洲猪瘟病毒的间接ELISA方法具有敏感性高、重复性好、特异性好的特点。

关键词：非洲猪瘟病毒 P54蛋白重组杆状病毒间接ELISA

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抗人甲胎蛋白单克隆抗体的制备及双抗体夹心ELISA检测技术的建立

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中国医药生物技术 2014年第4期9卷 268-272页

作者：孙一帆杨全利黄建芳赵凤芝向军俭广东省分子免疫与抗体工程重点实验室/暨南大学抗体工程研究中心广州510632

目的：制备、筛选多株具有商用价值的可配对的高特异性、高亲和力的抗人甲胎蛋白（hAFP）单克隆抗体，初步建立双抗体夹心 ELISA 检测方法。方法通过经典的淋巴细胞杂交瘤技术筛选分泌抗 hAFP单抗的杂交瘤细胞株；对筛选所得单抗的特性... 详细信息

目的：制备、筛选多株具有商用价值的可配对的高特异性、高亲和力的抗人甲胎蛋白（hAFP）单克隆抗体，初步建立双抗体夹心 ELISA 检测方法。方法通过经典的淋巴细胞杂交瘤技术筛选分泌抗 hAFP单抗的杂交瘤细胞株；对筛选所得单抗的特性进行鉴定分析；双抗体夹心 ELISA 法筛选最佳配对抗体；初步建立DAS-ELISA 检测方法并检测血样，绘制其标准检测曲线并与进口试剂盒比较。结果共获得12株稳定分泌抗 hAFP 单抗的杂交瘤细胞株，其中 Ab 1-Ab 55株单抗的腹水效价均高于600万， Ab 5的效价高达3000万；特异性鉴定结果表明 Ab 1-Ab 5均能够特异识别天然 hAFP 分子，但 Ab 5与人血清白蛋白（HSA）存在较强交叉反应；抗体配对实验共筛选出5对（Ab 1/HRP-Ab 2、Ab 1/HRP-Ab 4、Ab 3/HRP-Ab 2、Ab 3/HRP-Ab 4和 Ab 4/HRP-Ab 1）能够满足 hAFP 检测要求且无交叉反应的配对抗体，最终确定 Ab 1＋ Ab 3/HRP-Ab 2和 Ab 1＋Ab 3/HRP-Ab 4为最佳配对组合；利用最佳配对抗体组合建立标准检测曲线，其线性检测范围为5-250 ng/ml，最低检测限2 ng/ml，检测上限400 ng/ml，优于进口试剂盒的线性范围5-200 ng/ml 和最低检测限5 ng/ml；样检结果显示自制试剂盒的阳性血清检测准确率99.2%（119/120例），阴性血清准确率100%（40/40例）。结论筛选获得的4株高亲和力、高特异性抗 hAFP 单抗均可应用于 DAS-ELISA 试剂盒的研制，Ab 1和 Ab 3适合作为捕获抗体，Ab 2和 Ab 4适合作检测抗体；自制试剂盒的线性检测范围和最低检测限均优于进口试剂盒，表明具有商用价值。

关键词：甲胎蛋白类抗体单克隆双抗体夹心 ELISA

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二硫键稳定的人源性抗bFGF双链抗体抑制肿瘤的作用

二硫键稳定的人源性抗bFGF双链抗体抑制肿瘤的作用

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第九届全国免疫学学术大会

作者：张晋霞蔡亚雄姜浩武王金胜宋其芳黄建芳邓宁暨南大学抗体工程研究中心分子免疫与抗体工程广东省重点实验室

背景:bFGF抗体具有抑制肿瘤血管新生、抑制肿瘤生长和转移到的作用。我们在抗bFGF人源性ScFv抗体的基础上,通过连接肽连接轻重链可变区并和引入二硫键,成功构建了二硫键稳定的人源性抗bFGF双链抗体(ds-Diabody),并将ds-Diabody基因构建... 详细信息

背景:bFGF抗体具有抑制肿瘤血管新生、抑制肿瘤生长和转移到的作用。我们在抗bFGF人源性ScFv抗体的基础上,通过连接肽连接轻重链可变区并和引入二硫键,成功构建了二硫键稳定的人源性抗bFGF双链抗体(ds-Diabody),并将ds-Diabody基因构建到酵母表达载体pPICZαA中,在毕赤酵母GS115表达系统中进行高效表达,纯化后通过间接ELISA检测其抗原结合活性和稳定性,并通过细胞实验和动物实验进一步研究其体内外抗肿瘤活性,为临床抗肿瘤药物的研发奠定基础。目的:为提高小分子抗体表达量,利用酵母表达系统表达二硫键稳定的人源性抗bFGF双链抗体(ds-Diabody)并研究其体内外抗肿瘤活性。方法:利用间接ELISA检测纯化后ds-Diabody抗体与抗原结合活性。CCK-8法检测ds-Diabody对肿瘤细胞的增殖抑制作用,划痕修复实验和Transwell系统检测其对肿瘤细胞的迁移侵袭影响,成管实验和Transwell检测其对血管内皮细胞体外成管和迁移的抑制作用,信号通路分析其作用于肿瘤细胞的机制。使用BALB/C裸小鼠建立人乳腺癌荷瘤模型,并检测尾静脉注射抗体对荷瘤小鼠肿瘤生长,瘤重及小鼠体重的影响。免疫组化法检测肿瘤组织CD3 1和LYVE的表达情况,初步探讨抗bFGF的人源性ds-Diabody抗体的抗肿瘤机制。对肿瘤组织,以Annexin V/PI双染,流式细胞仪检测ds-Diabody抗体诱导人乳腺癌细胞调亡的情况。结果:ELISA结果显示纯化的ds-Diabody可与bFGF更好地特异性结合,并且具有良好的稳定性。CCK-8结果显示,纯化的ds-Diabody可剂量依赖性地抑制人卵巢癌细胞株Skov3 cells,人乳腺癌细胞株MCF-7 cells,人黑色素瘤细胞株A375 cells和人肺癌细胞株A549 cells的增殖,细胞增殖抑制率为30-43.4%。划痕实验和Transwell结果表明ds-Diabody可以抑制MCF-7 cells的迁移及侵袭。而且ds-Diabody可以抑制血管内皮细胞的成管及迁移。信号通路分析结果表明ds-Diabody能有效阻断与bFGF相关的MAPK和Akt通路。ds-Diabody作用于荷人乳腺癌MCF-7的BALB/C裸鼠,给药10次后,肿瘤生长抑制率达61.52%;流式细胞结果显示dsDiabody能够诱导肿瘤细胞的凋亡。能较好的抑制肿瘤的生长。

关键词： bFGF ds-Diabody 毕赤酵母乳腺癌细胞成管肿瘤

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bFGF/VEGF复合肽的免疫应答以及抑瘤作用

bFGF/VEGF复合肽的免疫应答以及抑瘤作用

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第九届全国免疫学学术大会

作者：潘磊翁锐强潘荣标于云飞吕成定宋其芳黄建芳邓宁暨南大学抗体工程研究中心分子免疫与抗体工程广东省重点实验室

背景:bFGF和VEGF是最重要的肿瘤血管新生因子,在肿瘤血管新生,促进肿瘤的转移中具有协同作用,bFGF抗体和VEGF抗体在体内均可抑制肿瘤的生长。bFGF和VEGF还可以通过促进PDGF-B-PDGFβ信号来共同促进肿瘤的生长。抑制肿瘤高表达的bFGF和V... 详细信息

背景:bFGF和VEGF是最重要的肿瘤血管新生因子,在肿瘤血管新生,促进肿瘤的转移中具有协同作用,bFGF抗体和VEGF抗体在体内均可抑制肿瘤的生长。bFGF和VEGF还可以通过促进PDGF-B-PDGFβ信号来共同促进肿瘤的生长。抑制肿瘤高表达的bFGF和VEGF对抑制肿瘤的生长和转移具有重要的作用。对肿瘤血管新生和转移的多个因素同时进行抑制和阻断将可能是更理想的解决抑制肿瘤血管新生的有效途径。我们在前期开展bFGF和VEGF表位肽研究的基础上,设计了VEGF/bFGF复合肽,它包含了多个VEGF表位肽和bFGF表位肽,并通过连接肽链接成多表位融合蛋白。从多种构建方式中筛选到具有较强免疫原性的VEGF/bFGF复合肽VBP3。这种独特的针对VEGF/bFGF多表位疫苗设计,可刺激机体同时产生抗VEGF和抗bFGF中和抗体而靶向抗肿瘤血管生成。目的:通过对VEGF/bFGF复合多肽(VBP3)免疫C57小鼠后免疫应答分析以及该多肽疫苗的抑瘤作用。方法:纯化出的VBP3蛋白免疫BALB/c小鼠,ELISA方法检测抗体效价和特异性。取免疫VBP3的小鼠脾细胞,加入不同浓度的(4-128μg/ml)VBP3共刺激培养,加入Percp-标记的抗鼠CD8单克隆抗体和PE-标记的抗鼠CD4单克隆抗体,然后加入含有皂素进行破膜处理,最后加入FITC-标记的抗鼠的IFN-γ单克隆抗体,流式细胞仪检测分析。VBP3多肽免疫6周龄雌性的C57小鼠,三次免疫后在C57小鼠的右前背部接种肺癌细胞。测量肿瘤大小,流式细胞分析肿瘤淋巴细胞的分布情况。结果:VBP3免疫的BALB/c小鼠可以诱导产生CD4,CD8 T细胞和IFN-γ。结果表明CD4+T细胞明显的增加了,从10.78%增加到15.13%,CD8+T细胞明显的从6.82%增长到11.58%。而由VBP3免疫诱导产生IFN-γ从1.36%增加到1.5%。由此可以表明小鼠免疫VBP3后产生了特异性的免疫应答反应。C57BL/6J小鼠肿瘤模型实验表明免疫VBP3多肽的小鼠体内肿瘤明显小于对照组,肿瘤抑制率为88.5%,结果表明在一定程度上抑制了体内肿瘤的生长。流式细胞检测肿瘤的淋巴细胞,结果显示其髓系抑制细胞的比例降低了,从而可能会影响其免疫逃逸作用。免疫VBP3的小鼠肿瘤细胞中DC细胞较免疫PBS组的有所增高,而免疫VBP3的小鼠肿瘤细胞中巨噬细胞所占的比例有所降低。

关键词： bFGF VEGF 复合多肽血管新生增殖抑制磷酸化肿瘤

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二硫键稳定的人源性抗bFGF双链抗体抑制肿瘤的作用

二硫键稳定的人源性抗bFGF双链抗体抑制肿瘤的作用

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中国免疫学会第九届全国免疫学学术大会

作者：张晋霞蔡亚雄姜浩武王金胜宋其芳黄建芳邓宁暨南大学抗体工程研究中心分子免疫与抗体工程广东省重点实验室

背景:bFGF抗体具有抑制肿瘤血管新生、抑制肿瘤生长和转移到的作用.我们在抗bFGF人源性ScFv抗体的基础上,通过连接肽连接轻重链可变区并和引入二硫键,成功构建了二硫键稳定的人源性抗bFGF双链抗体(ds-Diabody),并将ds-Diabody基因构建... 详细信息

背景:bFGF抗体具有抑制肿瘤血管新生、抑制肿瘤生长和转移到的作用.我们在抗bFGF人源性ScFv抗体的基础上,通过连接肽连接轻重链可变区并和引入二硫键,成功构建了二硫键稳定的人源性抗bFGF双链抗体(ds-Diabody),并将ds-Diabody基因构建到酵母表达载体pPICZαA中,在毕赤酵母GS115表达系统中进行高效表达,纯化后通过间接ELISA检测其抗原结合活性和稳定性,并通过细胞实验和动物实验进一步研究其体内外抗肿瘤活性,为临床抗肿瘤药物的研发奠定基础.

关键词： bFGF ds-Diabody 毕赤酵母乳腺癌细胞成管肿瘤

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玉米赤霉烯酮单克隆抗体的制备及胶体金免疫层析法的建立

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细胞与分子免疫学杂志 2013年第7期29卷 729-733页

作者：骆敏儿唐勇向军俭张晓丽付强强王宏暨南大学广东省分子免疫与抗体工程重点实验室广东广州510632

目的制备并鉴定玉米赤霉烯酮(ZEN)单克隆抗体(mAb),并初步建立ZEN的胶体金免疫层析检测方法。方法采用活泼酯法制备人工抗原ZEN-OVA和ZEN-BSA,以ZEN-OVA作为免疫原制备ZEN mAb。ELISA法鉴定抗体效价、亚类、特异性等。ZEN mAb-胶体金复... 详细信息

目的制备并鉴定玉米赤霉烯酮(ZEN)单克隆抗体(mAb),并初步建立ZEN的胶体金免疫层析检测方法。方法采用活泼酯法制备人工抗原ZEN-OVA和ZEN-BSA,以ZEN-OVA作为免疫原制备ZEN mAb。ELISA法鉴定抗体效价、亚类、特异性等。ZEN mAb-胶体金复合物包被于胶体金结合垫上,检测原ZEN-BSA和山羊抗小鼠IgG分别结合于硝酸纤维膜上作为检测线(T线)和质控线(C线),建立ZEN的胶体金免疫层析检测法。结果经紫外分光光度法和SDS-PAGE鉴定,ZEN人工抗原合成成功。经3次克隆化后,筛选出1株能稳定分泌ZEN mAb的杂交瘤细胞株1G4,腹水效价为1∶1.6×105;抗体亚类为IgG2b;对ZEN的IC50为10.2 ng/mL,检测限为0.58 ng/mL。mAb对ZEN具有高度的特异性,除与β-玉米赤霉烯醇的交叉反应率为12.8%外,与其他ZEN代谢物α-玉米赤霉醇、β-玉米赤霉醇、玉米赤霉酮及其他相似毒素呕吐毒素、伏马毒素、赭曲霉素A等几乎无交叉反应。制备的胶体金免疫层析试纸条在5 min内即可肉眼观察到结果,对ZEN的最低检测限为100 ng/mL。结论成功制备出1株ZEN mAb,并初步建立了其胶体金免疫层析检测方法,最低检测限为100 ng/mL。

关键词：玉米赤霉烯酮单克隆抗体胶体金免疫层析法

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免疫磁珠富集技术联合选择性培养基快速检测单增李斯特菌

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生物工程学报 2013年第5期29卷 672-680页

作者：闻一鸣李志清童吉宇向军俭广东省分子免疫与抗体工程重点实验室暨南大学抗体工程研究中心广东广州510632

单增李斯特菌是一种危害极大的食源性致病菌，建立快速及特异的检测方法对于食品安全监控尤为重要。丈中联合免疫磁珠与选择性培养基对不同浓度（10^1～10^5CFU／mL）单增李斯特菌进行检测，并对3种李斯特菌、金黄色葡萄球菌及副溶血弧... 详细信息

单增李斯特菌是一种危害极大的食源性致病菌，建立快速及特异的检测方法对于食品安全监控尤为重要。丈中联合免疫磁珠与选择性培养基对不同浓度（10^1～10^5CFU／mL）单增李斯特菌进行检测，并对3种李斯特菌、金黄色葡萄球菌及副溶血弧菌进行交叉试验；同时模拟食物污染，探索免疫磁珠．平板法检测样品的检测限以及该方法的最快检测时间。结果显示特异性免疫磁珠联合选择性平板法可检出浓度为10^3 CFU／mL及以上的单增李斯特菌；牛奶样品仅需6h增菌能被检出，检测限为0．7CFU／mL。联合使用免疫磁珠富集技术与选择性培养基，能在30h内完成对牛奶样品的检测，较国标法减少38h以上，且具有同等的灵敏度。

关键词：单增李斯特菌免疫磁珠选择性培养基检测限

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非洲猪瘟病毒p54蛋白抗原表位预测及鉴定

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中国预防兽医学报 2014年第11期36卷 848-851页

作者：曹琛福梁云浩花群俊吕建强孙洁廖立珊唐金明张彩虹杨俊兴张桂红深圳出入境检验检疫局动植物检验检疫技术中心广东深圳518045 华南农业大学兽医学院广东广州510642 暨南大学广东省分子免疫与抗体工程重点实验室广东广州510632 云南省武定县动物疫病预防控制中心云南武定651600

为鉴定非洲猪瘟病毒(ASFV)p54蛋白的B细胞线性抗原表位,本研究利用生物信息学方法结合抗原指数对ASFV p54蛋白进行抗原表位的预测,人工合成预测的抗原表位多肽,利用ASFV阳性血清以及特异性单克隆抗体(MAb),采用间接ELISA和阻断ELISA方... 详细信息

为鉴定非洲猪瘟病毒(ASFV)p54蛋白的B细胞线性抗原表位,本研究利用生物信息学方法结合抗原指数对ASFV p54蛋白进行抗原表位的预测,人工合成预测的抗原表位多肽,利用ASFV阳性血清以及特异性单克隆抗体(MAb),采用间接ELISA和阻断ELISA方法验证所预测抗原表位多肽的免疫学特性。预测结果显示,可能的抗原表位区域有:aa23-aa29,aa36-aa45,aa72-aa94,aa114-aa120,aa124-aa130,aa137-aa150。间接ELISA试验表明aa23-aa29,aa36-aa45,aa72-aa94,aa114-aa120,aa137-aa150多肽的抗原性较好,其中aa36-aa45,aa72-aa94多肽可以分别与两株杂交瘤细胞分泌的MAb发生特异性反应,本研究为ASF多肽疫苗及免疫学临床诊断方法的建立奠定基础。

关键词：非洲猪瘟 p54蛋白抗原表位

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基于独特型-抗独特型初步建立玉米赤霉烯酮无毒ELISA定量检测技术

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中国免疫学杂志 2013年第12期29卷 1317-1321页

作者：宋其芳向军俭骆敏儿钟娜黄婉君贾彦琼王宏暨南大学广东省分子免疫与抗体工程重点实验室广州510632

目的:初步建立以玉米赤霉烯酮(ZEN)抗独特型单抗替代玉米赤霉烯酮标准品,检测ZEN残留的无毒ELISA定量检测技术。方法:以ZEN-BSA为包被原,ZEN单抗(1G4)为反应抗体,分别以不同浓度的ZEN毒素或ZEN抗独特型单抗1D5(Ab2β-1D5)为竞争物,建立... 详细信息

目的:初步建立以玉米赤霉烯酮(ZEN)抗独特型单抗替代玉米赤霉烯酮标准品,检测ZEN残留的无毒ELISA定量检测技术。方法:以ZEN-BSA为包被原,ZEN单抗(1G4)为反应抗体,分别以不同浓度的ZEN毒素或ZEN抗独特型单抗1D5(Ab2β-1D5)为竞争物,建立竞争抑制曲线。根据抑制率在20%~80%间,在相同抑制率条件下,ZEN与1D5间浓度对应关系,绘制替代标准曲线及对应的浓度转换方程。以ZEN类似毒素代替ZEN作为竞争抗原,检验方法的特异性;板内、板间试验检验方法的精密度。结果:初步建立了ZEN无毒ELISA定量检测技术,1D5与ZEN毒素之间的替代标准曲线方程为:y=1.2846x1.9310(y为ZEN毒素浓度ng/ml,x为抗独特型抗体浓度(μg/ml)。检出限(IC2 0)为1.041 ng/ml,检测范围为1.041~25.99 ng/ml。方法的批内平均变异系数为3.88%,批间平均变异系数为4.96%。方法特异性好,与ZEN类似毒素几乎无交叉反应。结论:利用ZEN单抗和ZEN抗独特型单抗初步建立了ZEN的无毒ELISA定量检测方法。

关键词：玉米赤霉烯酮单克隆抗体抗独特型单抗无毒ELISA检测法

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呋喃它酮代谢物5-甲基吗啉-3-氨基-2-恶唑烷酮单克隆抗体的制备、鉴定与胶体金免疫层析试纸条的研制

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食品工业科技 2013年第13期34卷 161-165页

作者：张晓丽颜露向军俭邹军辉唐勇广东省分子免疫与抗体工程重点实验室暨南大学抗体工程中心广东广州510632

目的:制备5-甲基吗啉-3-氨基-2-恶唑烷酮(AMOZ)单克隆抗体,并建立AMOZ胶体金试纸条检测方法。方法:AMOZ与对醛基苯甲酸反应生成半抗原CP-AMOZ,将CP-AMOZ与BSA、OVA偶联制备完全抗原。免疫小鼠后制备腹水型抗体,ELISA检测抗体效价与其对C... 详细信息

目的:制备5-甲基吗啉-3-氨基-2-恶唑烷酮(AMOZ)单克隆抗体,并建立AMOZ胶体金试纸条检测方法。方法:AMOZ与对醛基苯甲酸反应生成半抗原CP-AMOZ,将CP-AMOZ与BSA、OVA偶联制备完全抗原。免疫小鼠后制备腹水型抗体,ELISA检测抗体效价与其对CP-AMOZ半抑制浓度(IC50)和最低检测限(LOD),并检测抗体的特异性。胶体金与单抗偶联,同时在NC膜上包被完全抗原、兔抗鼠多抗分别作为检测线和质控线,制备免疫层析试纸条,测定试纸条的灵敏度与特异性。结果:成功制备CP-AMOZ-BSA、CP-AMOZ-OVA完全抗原及抗CP-AMOZ的单抗,抗体效价为1∶1.6×105,对CP-AMOZ IC50为0.86μg/L,LOD0.07μg/L,与其他硝基呋喃类药物代谢物及其衍生物均无交叉反应。制备的胶体金试纸条灵敏度5μg/L。结论:成功合成了CP-AMOZ的完全抗原,免疫小鼠后制备了特异性强的单抗,并以此为基础研制出敏感、特异的胶体金快速检测试纸条。

关键词： CP—AMOZ 单克隆抗体胶体金免疫层析

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