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暨南大学学报（自然科学与医学版） 2008年第3期29卷 315-319页

作者：施焕敬徐丽慧韩捷卢宏松何贤辉暨南大学生命科学技术学院组织移植与免疫实验中心广东广州510632 暨南大学生命科学技术学院生物工程研究所广东广州510632

利用纯化的可溶性人PD-1胞外域(sPD-1)蛋白为免疫原免疫小鼠,获得抗血清.免疫印迹显示该抗血清与原核表达的sPD-1有特异性反应,但与某些菌体蛋白存在交叉反应.经菌体蛋白吸附法处理后,交叉反应明显减弱.以商业化抗人PD-1抗体和小鼠sPD-... 详细信息

利用纯化的可溶性人PD-1胞外域(sPD-1)蛋白为免疫原免疫小鼠,获得抗血清.免疫印迹显示该抗血清与原核表达的sPD-1有特异性反应,但与某些菌体蛋白存在交叉反应.经菌体蛋白吸附法处理后,交叉反应明显减弱.以商业化抗人PD-1抗体和小鼠sPD-1抗血清分析经亲和层析富集的活化的Jurkat T细胞表达的PD-1,只有自制的抗血清鉴定到特异反应条带,其表观分子质量为49 ku.

关键词：程序死亡蛋白-1 Jurkat T细胞抗血清免疫印迹

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H-2D^b四聚体的制备及其在检测LCMV特异性CD8^＋T细胞中的应用

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生物工程学报 2008年第2期24卷 278-284页

作者：刘毅徐丽慧曾学思孙建方何贤辉中国医学科学院中国协和医科大学皮肤病研究所南京210042 暨南大学生命科学技术学院生物工程研究所广州510632 暨南大学生命科学技术学院组织移植与免疫实验中心广州510632

MHC四聚体技术是研究抗原特异性淋巴细胞应答的关键技术之一。为研究H-2D^b基因型(如C57BL/6)小鼠的特异性CD8^+T细胞免疫应答,需要建立H-2D^b四聚体制备技术平台。首先以RT-PCR方法克隆H-2D^b重链基因的cDNA,进而构建H-2D^b胞外域与生... 详细信息

MHC四聚体技术是研究抗原特异性淋巴细胞应答的关键技术之一。为研究H-2D^b基因型(如C57BL/6)小鼠的特异性CD8^+T细胞免疫应答,需要建立H-2D^b四聚体制备技术平台。首先以RT-PCR方法克隆H-2D^b重链基因的cDNA,进而构建H-2D^b胞外域与生物素化酶BirA底物肽(BSP)融合蛋白的表达载体,并在大肠杆菌中获得表达。在LCMV GP_(33-41)抗原肽(KAVYNFATC,KAV)和人β_2-微球蛋白存在时,通过稀释法复性获得H-2D^b/KAV单体。该单体经生物素化并纯化后与PE-链亲和素按4:1的比例混合,即形成四聚体。通过流式细胞术检测经KAV肽免疫的C57BL/6小鼠体内的LCMV特异性CD8^+T细胞的频率.结果表明在外周血、引流淋巴结和脾脏中均可检测到一定频率的LCMV特异性CD8^+T细胞,其中以对外周血标本染色的效果最佳。成功建立了小鼠H-2D^b四聚体制备技术平台,为监测及分析基于H-2D^b基因型小鼠的实验性免疫治疗创造了条件。

关键词： H-2D^b MHC四聚体淋巴细胞性脉络丛脑膜炎病毒原核表达

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可溶性人sPD-L1及其抗体的制备和鉴定

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生物工程学报 2007年第1期23卷 106-111页

作者：徐丽慧迟晓云李丰耀贾仟涛查庆兵何贤辉暨南大学生命科学技术学院组织移植与免疫实验中心

通过固定化金属离子亲和层析进行柱上复性与纯化,获得高纯度的可溶性PD-L1胞外域(sPD-L1),其纯度达95%,纯化的sPD-L1经免疫印迹分析得到验证,并具有与其受体PD-1的特异性结合活性;以该抗原免疫小鼠获得高滴度的抗血清,并以制备的sPD-L1-... 详细信息

通过固定化金属离子亲和层析进行柱上复性与纯化,获得高纯度的可溶性PD-L1胞外域(sPD-L1),其纯度达95%,纯化的sPD-L1经免疫印迹分析得到验证,并具有与其受体PD-1的特异性结合活性;以该抗原免疫小鼠获得高滴度的抗血清,并以制备的sPD-L1-HiTrap亲和层析柱纯化获得高纯度特异性抗体;将该抗体与另一商业化抗体结合建立了一种灵敏的双夹心ELISA法,检测范围为1ng/mL^100ng/mL,可用于分析可溶性PD-L1的含量。可溶性sPD-L1及其抗体的制备不仅可用于人体内特异性抗体和可溶性PD-L1的检测,同时也为进一步研究其体内外活性及其受体的性质提供了条件。

关键词： PD-L1 原核表达重折叠亲和层析抗体

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细胞外信号调节激酶1/2的阻断剂PD98059对小鼠淋巴细胞增殖的影响

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细胞与分子免疫学杂志 2007年第2期23卷 102-105页

作者：滕振平邢飞跃王通李莉平暨南大学生命科学技术学院组织移植与免疫中心广东广州510632

目的探讨细胞外信号调节激酶1/2(ERK1/2)信号通路的特异性阻断剂PD98059对小鼠淋巴细胞体外增殖的影响。方法分离小鼠淋巴结细胞,藉羧基荧光素乙酰乙酸(CFDA-SE)染色,用多克隆刺激剂刀豆A蛋白(ConA)或者佛波醇酯(PDB)加离子霉素(Ion)刺... 详细信息

目的探讨细胞外信号调节激酶1/2(ERK1/2)信号通路的特异性阻断剂PD98059对小鼠淋巴细胞体外增殖的影响。方法分离小鼠淋巴结细胞,藉羧基荧光素乙酰乙酸(CFDA-SE)染色,用多克隆刺激剂刀豆A蛋白(ConA)或者佛波醇酯(PDB)加离子霉素(Ion)刺激,以流式细胞术分析PD98059对淋巴细胞增殖的影响;利用碘化丙锭(PI)染色分析PD98059对细胞周期的影响。结果CFDA-SE染色分析显示,当浓度为5、10、20、30、40μmol/L时,PD98059对ConA诱导的淋巴细胞增殖具有明显的抑制作用,并呈现明显的剂量依赖关系(r=0.985,P<0.01)。选择最佳浓度30μmol/L的PD98059,观察其对不同时间淋巴细胞增殖的影响,结果发现,随着时间的延长,PD98059对淋巴细胞增殖的抑制作用明显降低(P<0.01),但抑制率随时间的延长而明显升高。细胞周期分析进一步表明,PD98059可阻止ConA刺激的淋巴细胞进入S期和G2/M期,而亚二倍体峰变化并不明显。PD98059对PDB+Ion刺激的淋巴细胞细胞周期的影响与ConA刺激相似,不同的是S期和G2/M期的变化较ConA的作用更明显。结论PD98059对小鼠淋巴细胞的增殖有明显地抑制作用,并可阻止其进入S期和G2/M期,提示ERK1/2信号通路的活化在淋巴细胞增殖中起重要作用。

关键词：细胞外信号调节激酶1/2 淋巴细胞增殖细胞周期

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HLA-A^＊2402-BSP在大肠杆菌中的优化表达及其四聚体的制备和鉴定

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生物工程学报 2007年第2期23卷 284-291页

作者：贾仟涛徐丽慧李丰耀查庆兵何贤辉暨南大学生命科学技术学院组织移植与免疫实验中心广州510632 暨南大学生命科学技术学院生物工程研究所广州510632 暨南大学附属第一医院临床实验中心广州510632

HLA-A*2402是中国人群中最常见的等位基因之一,为研究该基因型人群的人巨细胞病毒(HCMV)特异性细胞毒T细胞(CTL)免疫应答,需要制备负载相应抗原肽的HLA-A*2402四聚体。以RT-PCR方法克隆HLA-A*2402重链基因的cDNA,并构建了羧基端融合生... 详细信息

HLA-A*2402是中国人群中最常见的等位基因之一,为研究该基因型人群的人巨细胞病毒(HCMV)特异性细胞毒T细胞(CTL)免疫应答,需要制备负载相应抗原肽的HLA-A*2402四聚体。以RT-PCR方法克隆HLA-A*2402重链基因的cDNA,并构建了羧基端融合生物素化酶BirA底物肽(BSP)的HLA-A*2402重链胞外域融合蛋白(HLA-A*2402-BSP)的表达载体,但该载体不能在大肠杆菌(***)中有效表达HLA-A*2402-BSP融合蛋白;通过对氨基端(N端)区域编码区的密码子进行优化,构建了同义突变的HLA-A*2402-BSP表达载体,融合蛋白在***中获得了高效表达。进而制备了负载HLA-A*2402限制性HCMVpp65341-349抗原肽(QYDPVAALF,QYD)的可溶性HLA-A*2402-QYD单体分子和四聚体,获得的四聚体具有与HLA-A24+供者抗原特异性CTL的结合活性,特异性CTL的频率为总CD8+T细胞的0·09%～0·37%。这些结果为进一步研究HLA-A*2402限制性的特异性CTL免疫应答规律奠定基础。

关键词：四聚体 HLA-A^＊2402 巨细胞病毒密码子优化原核表达包涵体

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HLA-A*0203-BSP的表达和复性及其四聚体的鉴定

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细胞与分子免疫学杂志 2007年第2期23卷 97-101页

作者：贾仟涛徐丽慧查庆兵李丰耀何贤辉曾耀英暨南大学生命科学技术学院组织移植与免疫中心广东广州510632 暨南大学生命科学技术学院生物工程研究所广东广州510632

目的优化诱导条件大批量表达生物素化酶BirA底物肽(BSP)与HLA-A0203重链胞外域的融合蛋白(HLA-A0203-BSP),并制备负载HLA-A0203限制性EB病毒抗原肽EBNA3596-604的四聚体(HLA-A0203/SVR)。方法以HLA-A0203-BSP原核表达载体转化***21(DE3)菌株,优化诱导条件进行大批量重组蛋白的表达。通过稀释法复性可溶性HLA-A0203/SVR单体,然后以BirA对其进行生物素化,并以阴离子交换树脂纯化。将纯化的HLA-A0203/SVR单体与荧光素标记的链亲和素按4∶1的比例混合形成四聚体,通过对特异性CTL进行染色验证其结合活性。结果当IPTG的浓度为0.4mmol/L,于37℃诱导过夜后,融合蛋白的表达最多。该重组蛋白相对分子质量(Mr)为34000,与HLA-A0203-BSP的理论Mr相一致。该重组蛋白以包涵体形式存在于沉淀部分,约占菌体总蛋白的30%。负载抗原肽的可溶性HLA-A0203/SVR单体是在同时存在HLA-A0203-BSP、β2微球蛋白及HLA-A0203限制性抗原肽SVR的情况下通过稀释法复性而获得。该单体生物素化并纯化后与荧光素标记的链亲和素按4∶1的比例混合后即形成四聚体。流式细胞术(FCM)分析证实,该四聚体具有与HLA-A2+供者特异性CTL结合的活性。结论HLA-A0203-BSP融合蛋白在优化条件下获得高效表达。以此蛋白制备的HLA-A0203/SVR四聚体具有与HLA-A2+供者特异性CTL结合的活性,为研究HLA-A0203个体EB病毒特异性CTL的免疫应答打下了基础。

关键词： HLA—A＊0203 EB病毒四聚体原核表达融合蛋白包涵体

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芹菜素对小鼠T淋巴细胞体外活化和增殖的抑制作用

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现代免疫学 2007年第6期27卷 481-487页

作者：梁兆端黄秀艳肇静娴曾耀英暨南大学生命科学技术学院组织移植与免疫中心广州510632

研究芹菜素（apigenin,AP）对小鼠T细胞体外活化和增殖的影响,探讨其作用机制,以及将其开发为免疫抑制药物的可能。无菌分离小鼠淋巴结细胞,加入不同浓度（25μmol/L、50μmol/L、100μmol/L、150μmol/L和200μmol/L）的芹菜素预孵育4... 详细信息

研究芹菜素（apigenin,AP）对小鼠T细胞体外活化和增殖的影响,探讨其作用机制,以及将其开发为免疫抑制药物的可能。无菌分离小鼠淋巴结细胞,加入不同浓度（25μmol/L、50μmol/L、100μmol/L、150μmol/L和200μmol/L）的芹菜素预孵育4 h,用多克隆刺激剂刀豆蛋白A（concanavalin A,ConA）诱导T细胞活化和增殖,并用MTT法检测该药物浓度对T细胞的毒性作用。荧光标记抗体双染色结合流式细胞术,检测各浓度AP对ConA诱导的小鼠T细胞表达早期、中期和晚期活化抗原CD69、CD25和CD71的影响;以二乙酰羧基荧光素-琥珀酰亚胺酯（carboxyfluoresceindiacetate-succinim-idyl ester,CFDA-SE）染色结合流式细胞术,检测各浓度AP对ConA诱导的小鼠T细胞增殖的影响,并应用ModFit软件分析其增殖指数（proliferation index,PI）。结果显示,25-200μmol/L AP对ConA诱导的T细胞CD69、CD25的表达有显著抑制作用（P〈0.01）,且呈剂量依赖关系;25μmol/L和50μmol/L的AP抑制CD71的表达,但高浓度（大于100μmol/L）才有显著抑制作用（P〈0.01）。各浓度AP对ConA诱导的T细胞增殖均有显著抑制作用（P〈0.01）,且呈剂量依赖关系。表明在一定浓度范围内,AP可显著抑制ConA诱导的小鼠T细胞体外活化及增殖,有望通过进一步研究将其开发成免疫抑制药物。

关键词：芹菜素 T淋巴细胞活化增殖

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健康青年人HCMV特异性CD8^+T细胞频率和表型分析

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免疫学杂志 2007年第3期23卷 260-264,269页

作者：查庆兵徐丽慧刘芳孙荭贾仟涛李丰耀何贤辉暨南大学生命科学技术学院组织移植与免疫实验中心暨南大学生物工程研究所暨南大学附属第一医院临床实验中心广州510632

目的利用负载pp65495-503抗原肽的HLA-A*0201四聚体染色结合流式细胞术,分析HLA-A2+健康青年供者外周血中HCMV pp65495-503特异性记忆CD8+T细胞的频率和表型。方法以优化的四聚体染色方法对22例中国青年供者全血进行染色,用流式细胞仪... 详细信息

目的利用负载pp65495-503抗原肽的HLA-A*0201四聚体染色结合流式细胞术,分析HLA-A2+健康青年供者外周血中HCMV pp65495-503特异性记忆CD8+T细胞的频率和表型。方法以优化的四聚体染色方法对22例中国青年供者全血进行染色,用流式细胞仪对样品进行三色荧光分析。结果健康中国青年人外周血中存在高频率的pp65495-503特异性CD8+T细胞,占CD8+T细胞的百分率为0.14~6.84%(均数2.45%);表型分析显示其CD28+细胞占四聚体阳性和四聚体阴性细胞的百分率分别为为32.5%(±21.7%)和58.58%(±10.4%)(P<0.001);CD57+细胞占四聚体阳性和四聚体阴性细胞的百分率分别为55.8%(±18.4%)和27.4%(±8.3%)(P<0.001)。同时,对三例健康青年人CD8+T细胞上多种表面分子的详细分析显示,pp65495-503特异性记忆CD8+T细胞有不同比率的细胞表达CD62L、CD45RO、CD38和CD27,而且还有一定比例的细胞表达CD45RA,但不表达活化抗原CD69分子。结论青年中国人外周血中存在高频率的HCMV特异性CD8+T细胞,这些细胞的表型存在高度异质性,可能是处于不同分化阶段的记忆和效应细胞群体组成。

关键词：四聚体技术人巨细胞病毒记忆型CD8^+T细胞流式细胞术

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MAPK信号通路在诱导Th1/Th2分化中的作用

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现代免疫学 2007年第1期27卷 81-84页

作者：于哲邢飞跃曾耀英广州暨南大学生命科学技术学院组织移植与免疫中心广州510632

丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)信号通路是介导细胞外刺激到细胞内反应的重要信号转号系统,在诱导Th1/Th2分化中起重要作用,其中JNK1能够抑制初始CD4+T细胞向Th2分化,JNK2诱导其向Th1分化并能促进相应细胞因子的分泌;p38既能诱导Th1分化,也... 详细信息

丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)信号通路是介导细胞外刺激到细胞内反应的重要信号转号系统,在诱导Th1/Th2分化中起重要作用,其中JNK1能够抑制初始CD4+T细胞向Th2分化,JNK2诱导其向Th1分化并能促进相应细胞因子的分泌;p38既能诱导Th1分化,也能促进Th2分化;ERK1/2则能诱导CD4+T细胞向Th2分化。

关键词： JNK p38 ERK Th1 Th2 分化

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可溶性HLA-A~*0203-BSP原核表达载体的构建及其在大肠杆菌中的高效表达

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中国生物工程杂志 2006年第9期26卷 5-10页

作者：贾仟涛徐丽慧迟晓云查庆兵李丰耀何贤辉暨南大学生命科学技术学院组织移植与免疫实验中心

目的：构建HLA—A＊0203重链胞外域羧基端融合生物素化酶BirA底物肽（BSP）的融合蛋白CHLA-A＊0203一BSP的原核表达载体，并在大肠杆菌中进行表达。方法：以RT-PCR方法从HLA—A28供者外周血单个核细胞（PBMC）中克隆HLA-A＊0203重链基因... 详细信息

目的：构建HLA—A＊0203重链胞外域羧基端融合生物素化酶BirA底物肽（BSP）的融合蛋白CHLA-A＊0203一BSP的原核表达载体，并在大肠杆菌中进行表达。方法：以RT-PCR方法从HLA—A28供者外周血单个核细胞（PBMC）中克隆HLA-A＊0203重链基因的cDNA，并测序鉴定，然后以PCR方法构建HLA-A＊0203一BSP的原核表达载体，在大肠杆菌BL21（DE3）菌株中诱导表达并以免疫印迹鉴定。结果：DNA测序显示，从3名HLA-A2＊供者PBMC中克隆的cDNA中，只有从供者2获得编码HLA-A＊0203重链基因的cDNA。将编码重链胞外域1-276的序列和编码BSP的序列融合，构建HLA-A＊0203-BSP融合蛋白的原核表达载体并经测序验证。该融合蛋白在BL21（ED3）中获得高效表达，约占菌体总蛋白的30％；产物相对分子质量约为34kDa，与理论大小一致。Western印迹分析显示融合蛋白完全存在于包涵体中。结论：成功克隆HLA-A＊0203重链基因的cDNA，构建HLA-A＊0203-BSP融合蛋白的原核表达载体，并在大肠杆菌中获得高效表达，为制备HLA-A＊0203四聚体打下基础。

关键词：人类白细胞抗原胞外域融合蛋白原核表达包涵体

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