检索结果-内蒙古大学图书馆

细胞与分子免疫学杂志 2011年第5期27卷 531-534页

作者：韩波杨辉王巧利陈伟钱垂文熊盛暨南大学生物医药研究开发基地广东省生物工程药物重点实验室基因工程药物国家工程研究中心广东广州510630

目的:纯化CVN重组蛋白,检测其抗病毒活性,制备CVN多克隆抗体,并对其进行纯化和修饰。方法:利用两步Ni-NTA亲和层析和一步SUMO酶切制备CVN抗原,CPE法观察其抗病毒活性,活性抗原免疫新西兰白兔制备多克隆抗体,ELISA及Western blot鉴定其... 详细信息

目的:纯化CVN重组蛋白,检测其抗病毒活性,制备CVN多克隆抗体,并对其进行纯化和修饰。方法:利用两步Ni-NTA亲和层析和一步SUMO酶切制备CVN抗原,CPE法观察其抗病毒活性,活性抗原免疫新西兰白兔制备多克隆抗体,ELISA及Western blot鉴定其效价和特异性,抗血清经硫酸铵初步沉淀和DEAE离子交换层析获得纯化抗体,纯化抗体通过辣根过氧化物酶(HRP)标记获得修饰抗体。结果:纯化获得纯度达95%以上且具有明显抗流感病毒作用的非融合CVN,利用所得CVN抗原成功制备CVN多克隆抗体,酶联免疫分析显示其效价达到1∶16 000以上,Western blot分析表明其具明显特异性。抗血清经盐析和DEAE离子柱层析后获得效价为1∶6 400高纯度纯化抗体,经HRP修饰后获得具有较高生物活性的标记抗体。结论:获得高纯度,高效价兔抗CVN多克隆抗体,以及HRP标记的兔抗CVN多克隆抗体,为后续研究奠定了基础。

关键词： CVN 抗病毒活性多克隆抗体修饰抗体

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GRP78在食管癌细胞ECA-109增殖过程中的功能研究

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中国细胞生物学学报 2013年第1期35卷 41-46页

作者：丁伟超马岩岩邱贤秀王绍祥王莹任哲暨南大学生物医药研究开发基地广东省生物工程药物重点实验室广州510632 基因工程药物国家工程研究中心广州510632 暨南大学生命科学技术学院广州510632

食管癌在中国是高发性肿瘤,并具有较高的致死率。肿瘤细胞的持续增殖与细胞增殖失调密切相关。肿瘤细胞在增殖过程中需要合成大量蛋白质,葡萄糖调节蛋白78(glucose regulatedprotein,GRP78)作为分子伴侣,在蛋白质的折叠、组装、修饰和... 详细信息

食管癌在中国是高发性肿瘤,并具有较高的致死率。肿瘤细胞的持续增殖与细胞增殖失调密切相关。肿瘤细胞在增殖过程中需要合成大量蛋白质,葡萄糖调节蛋白78(glucose regulatedprotein,GRP78)作为分子伴侣,在蛋白质的折叠、组装、修饰和错误折叠蛋白的降解过程中发挥着重要作用。该研究通过构建pGRP78-EGFP-N1重组质粒,瞬时转染ECA-109细胞,研究GRP78过表达对细胞增殖能力的影响;采用RNA干扰技术,瞬时转染靶向GRP78的siRNA,研究敲低GRP78对细胞增殖能力的影响。该研究发现GRP78过表达后,更多的细胞从G1期进入S期和G2/M期,细胞增殖速率加快,细胞克隆形成率亦明显提高;敲低GRP78后,细胞更多地被阻滞在G1期而无法进入S期和G2/M期,细胞增殖速率减慢,细胞克隆形成率降低。GRP78可能通过调节细胞周期而促进ECA-109细胞的增殖。

关键词： GRP78 过表达 RNA干扰增殖细胞周期 ECA-109细胞

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人干细胞生长因子-α基因的克隆、表达及其协同rhGM-CSF对人脐带间充质干细胞的增殖作用

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生物工程学报 2011年第11期27卷 1667-1676页

作者：彭鑫磊马岩岩荣靖赵振岭韩波陈伟向阳飞刘秋英王一飞任哲周向荣陈海佳暨南大学生物医药研究开发基地广东省生物工程药物重点实验室广州510632 基因工程药物国家工程研究中心广州510632 亚太干细胞科研中心有限公司暨南.赛莱拉基因生物美容联合实验室广州510632

为了研究hSCGF-α对人脐带间充质干细胞(Human umbilical cord mesenchymal stem cells,hUCMSCs)的作用,采用基因工程技术获得重组人干细胞生长因子-α(Recombinant human Stem Cell Growth Factor-α,rhSCGF-α)。针对SCGF基因的高GC含量,采用PCR两步法获得hSCGF-α基因,插入pET-28a(+)载体质粒,构建重组质粒pET-28a-SCGF-α,转化大肠杆菌BL21(DE3)获得表达菌株。低温20℃诱导24 h,目标重组蛋白人干细胞生长因子-α以可溶性表达为主。通过Ni2+-NTA柱纯化,获得目标重组蛋白,电泳谱带扫描分析蛋白纯度可达90%以上。以巨噬细胞/粒细胞(Granulocyte/macrophage,GM)集落形成实验鉴定重组蛋白的生物学活性,并协同重组人巨噬细胞/粒细胞集落刺激因子(Recombinant human GM-colony stimulating factor,rhGM-CSF)研究其对人脐带间充质干细胞的影响。结果显示,纯化的重组蛋白rhSCGF-α具有生物学活性;hSCGF-α及rhGM-CSF对hUCMSCs均有刺激增殖活性,但协同作用效果最强。

关键词：干细胞生长因子人脐带间充质干细胞克隆协同作用集落

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人八聚体结合蛋白4(Oct4)cDNA的克隆及其在大肠杆菌和HEK293T细胞的表达

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细胞与分子免疫学杂志 2016年第3期32卷 308-312页

作者：阮碧波符吴萸芮雯陈海璇周朋君廖双叶吴小清王一飞陈宏远广东药科大学基础学院病原生物学与免疫学系广东药科大学中心实验室广东广州510006 暨南大学生物医药研究开发基地广东省生物工程药物重点实验室基因工程药物国家工程研究中心广东广州510632

目的克隆人八聚体结合蛋白4(Oct4)c DNA,研究其在原核及真核系统中的表达。方法提取人宫颈癌He La细胞中的总RNA,经反转录PCR获得c DNA,PCR扩增Oct4 c DNA并将其分别克隆入表达载体p ET-22b(+)原核质粒和pc DNATM3.1(+)真核质粒,构建含... 详细信息

目的克隆人八聚体结合蛋白4(Oct4)c DNA,研究其在原核及真核系统中的表达。方法提取人宫颈癌He La细胞中的总RNA,经反转录PCR获得c DNA,PCR扩增Oct4 c DNA并将其分别克隆入表达载体p ET-22b(+)原核质粒和pc DNATM3.1(+)真核质粒,构建含该序列的重组原核表达载体p ET-22b(+)-Oct4和真核表达载体pc DNA3.1(+)-his-Oct4。然后分别进行双酶切和测序鉴定。前者在*** BL21(DE3)中诱导表达目的蛋白,后者以脂质体介导法转染至HEK293T细胞,SDS-PAGE和Western blot法检测细菌和细胞中OCT4蛋白的表达水平。结果 PCR扩增得到约1100 bp目的 DNA片段;重组表达质粒p ET-22b(+)-Oct4和pc DNA3.1(+)-his-Oct4经双酶切鉴定和测序分析证明载体构建成功;p ET-22b(+)-Oct4经异丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷(IPTG)诱导表达后SDS-PAGE分析表明,目的蛋白在宿主*** BL21(DE3)中高效表达OCT4融合蛋白,相对分子质量(Mr)约38 000,与其理论Mr基本相符;pc DNA3.1(+)-his-Oct4转染HEK293T细胞经Western blot法检测,证实导入的Oct4成功表达。结论在大肠杆菌和HEK293T细胞成功表达OCT4蛋白。

关键词： Oct4基因分子克隆原核表达真核表达

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HSV-1 UL18基因重组载体的构建及其编码蛋白VP23的表达

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中国卫生检验杂志 2013年第7期23卷 1639-1640,1664页

作者：杨攀金富军夏敏侯志波王一飞任哲暨南大学生物医药研究开发基地广东省生物工程药物重点实验室基因工程药物国家工程研究中心广州510632 广东同德药业有限公司湛江524000

目的:构建含有单纯疱疹病毒1型(HSV-1)UL18基因的原核表达载体。方法:先将UL18基因进行全序列PCR扩增,再将PCR产物克隆进pET-28a(+)质粒,最后将重组质粒转化进入原核表达系统*** BL21(DE3)中表达出带有6个组氨酸标签的重组VP23蛋白。结... 详细信息

目的:构建含有单纯疱疹病毒1型(HSV-1)UL18基因的原核表达载体。方法:先将UL18基因进行全序列PCR扩增,再将PCR产物克隆进pET-28a(+)质粒,最后将重组质粒转化进入原核表达系统*** BL21(DE3)中表达出带有6个组氨酸标签的重组VP23蛋白。结果:UL18基因正确重组进pET-28a(+)质粒,并在*** BL21(DE3)中表达。结论:成功构建单纯疱疹病毒1型(HSV-1)UL18基因的重组载体,并在原核表达系统表达出其编码的衣壳蛋白VP23且带有组氨酸标签,为进一步优化VP23在发酵中的最佳表达条件,纯化并大量制备VP23,以及制备VP23的多克隆抗体奠定了基础。

关键词：单纯疱疹病毒1型(HSV-1) VP23 三聚体原核表达

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人热休克蛋白90AB1基因克隆、原核表达、中试发酵及纯化

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生物技术通报 2011年第10期27卷 120-125,134页

作者：刘凯胜王绍祥刘忠张嘉萱张庶民王一飞暨南大学生物医药研究开发基地广东省生物工程药物重点实验室基因工程药物国家工程研究中心广州510632 中国药品生物制品检定所北京100050

通过克隆人热休克蛋白90AB1基因(Hsp90AB1),构建其原核表达载体pET28a(+)-hHsp90AB1,表达纯化获得目的蛋白,为hHsp90靶向药物筛选奠定基础。提取宫颈癌HeLa细胞总RNA,并经RT-PCR获得hHsp90AB1-cDNA。以hH-sp90AB1-cDNA为模板进行PCR体外扩增,胶回收纯化hHsp90AB1。将hHsp90AB1及pET-28a(+)质粒经NdeⅠ和SalⅠ双酶切、胶回收纯化酶切片段后,体外连接酶切片段,使其定向重组,再将重组DNA转化DH5α,经复苏后,在含卡那霉素的LB固体养基上筛选出阳性克隆。挑取LB固体培养基上的单菌落经酶切及测序鉴定,证实为阳性克隆,即pET28a-hHsp90AB1体外重组成功,命名为pET28a(+)-hHsp90AB1。重组质粒转化Rosetta(DE3)菌株,IPTG诱导表达,并对表达条件优化,以及通过SDSA-PAGE和Western blotting分析均表明Hsp90AB1蛋白得到了正确的表达,且表达产物以可溶性形式存在,优化条件下蛋白表达量约占菌体总蛋白13%。接种到18 L发酵罐中试发酵,表达产物经Ni-NTA凝胶亲和层析,蛋白纯度达到98%。

关键词：热休克蛋白90AB1(Hsp90β) 克隆原核表达中试发酵纯化

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钴60γ射线灭活人工骨钉PRV病毒效果验证

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中国卫生检验杂志 2012年第7期22卷 1573-1575页

作者：钱垂文张美英徐斌王一飞暨南大学生物医药研发基地/基因工程药物国家工程研究中心广州510632 广东冠昊生物科技股份有限公司/再生型医用植入器械国家工程实验室广州510663

目的:验证钴60辐照灭活猪源性人工骨钉中指示病毒PRV活性的有效性。方法:首先利用CPE法测定不同辐照剂量γ射线灭活样品后指示病毒的感染活性,初步确定有效辐照剂量;然后利用三批样品对该辐照剂量灭活效果进行验证,辐照前后人工骨钉中... 详细信息

目的:验证钴60辐照灭活猪源性人工骨钉中指示病毒PRV活性的有效性。方法:首先利用CPE法测定不同辐照剂量γ射线灭活样品后指示病毒的感染活性,初步确定有效辐照剂量;然后利用三批样品对该辐照剂量灭活效果进行验证,辐照前后人工骨钉中指示病毒的滴度采用96孔板CPE法滴定。结果:CPE法测定结果显示,经20kGy及以上辐照剂量处理的样品中指示病毒PRV不能使宿主细胞PK-15出现细胞病变;三批样品经20kGy辐照剂量处理后,指示病毒PRV滴度下降值⊿lgTCID50分别>4.06,>4.75,>4.28,⊿lgTCID50值均大于4。结论:辐照剂量为20kGy的钴60γ射线辐照猪源性人工骨钉可以作为灭活PRV的有效手段。

关键词：辐照人工骨钉伪狂犬病毒病毒灭活

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CBZ-AAN-Dox新前药的计算机辅助设计及合成与活性检测

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中国抗生素杂志 2014年第7期39卷 503-506页

作者：陈宏远刘晓邵方元刘忠王一飞芮雯广东药学院基础学院广东省生物活性药物研究重点实验室广州510006 暨南大学生物医药研究开发基地广东省生物工程药物重点实验室基因工程药物国家工程研究中心广州510632 广东药学院中心实验室广州510006

目的探究一种以多柔比星为母药的低毒新型抗肿瘤前药。方法采用Sybyl 8.0的Sketch模块进行前药的计算机辅助设计,通过多种短肽共价偶联多柔比星形成前药库。虚拟筛选后用化学方法合成前药,通过硅胶柱和凝胶柱进行纯化,HPLC法检测与鉴定... 详细信息

目的探究一种以多柔比星为母药的低毒新型抗肿瘤前药。方法采用Sybyl 8.0的Sketch模块进行前药的计算机辅助设计,通过多种短肽共价偶联多柔比星形成前药库。虚拟筛选后用化学方法合成前药,通过硅胶柱和凝胶柱进行纯化,HPLC法检测与鉴定,体外特异性酶解试验及细胞毒性试验进行活性检测。结果计算机辅助药物设计所得到的新型前药N-苄氧羰基-丙氨酰-丙氨酰-天冬酰胺-多柔比星物理及化学参数较好,其化学合成产物纯度为94%,其天冬酰胺内肽酶酶解Km和Vmax分别为(68±7)μmol/L,(3.9±0.6)μmol/(L·s),对2种体外培养肿瘤细胞株的毒性作用约降低了约90%。结论计算机辅助药物设计在指导多柔比星前药合成过程中具有参考意义;前药合成与分离纯化方法简单可靠,分离效果好;新合成前药细胞毒性降低,可被天冬酰胺内肽酶酶解。

关键词：多柔比星天冬酰胺内肽酶前体药物

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穿膜肽KGF-2的构建及其对HaCaT增殖作用的影响

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生物技术 2013年第1期23卷 29-33页

作者：马岩岩荣靖彭鑫磊刘秋英舒辉萍陈海佳王一飞任哲暨南大学生物医药研究开发基地广东省生物工程药物重点实验室基因工程药物国家工程研究中心广东广州510632 广州赛莱拉生物科技有限公司广东广州510632

目的:构建穿膜肽KGF-2(TAT-KGF-2),研究其对人角质形成细胞HaCaT的增殖作用。方法:采用普通PCR技术和特殊引物从人胚胎肺成纤维细胞cDNA中扩增出目的基因TAT-KGF-2,并将其插入pET-28a(+)载体中构建pET28a-TAT-KGF-2重组质粒;将该质粒转... 详细信息

目的:构建穿膜肽KGF-2(TAT-KGF-2),研究其对人角质形成细胞HaCaT的增殖作用。方法:采用普通PCR技术和特殊引物从人胚胎肺成纤维细胞cDNA中扩增出目的基因TAT-KGF-2,并将其插入pET-28a(+)载体中构建pET28a-TAT-KGF-2重组质粒;将该质粒转化大肠杆菌Rosetta(DE3),IPTG诱导表达重组蛋白TAT-KGF-2;通过Ni-NTA柱纯化获得目标重组蛋白并利用Western blot进行鉴定;MTT法研究TAT-KGF-2对HaCa的增殖作用。结果:成功构建pET28a-TAT-KGF-2重组质粒,经序列比对,与GenBank上公布的人KGF-2基因序列同源性达到100%;获得穿膜肽KGF-2蛋白,分子量约为19 kDa,纯度达到95%以上;TAT-KGF-2对HaCaT在12.5ng/ml时具有增殖作用,并呈浓度依赖性,而且与不具有穿膜功能的KGF-2相比有更强的增殖效果。结论:成功纯化出TAT-KGF-2蛋白,并验证其对HaCaT具有增殖作用,为进一步研究该蛋白的结构和功能奠定了基础。

关键词： KGF-2 穿膜肽克隆原核表达纯化 HaCaT细胞株

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穿膜肽KGF-2的构建及其对HaCaT增殖作用的影响

穿膜肽KGF-2的构建及其对HaCaT增殖作用的影响

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中国遗传学会“第十一届全国激光生物学学术会议”暨《激光生物学报》创刊廿周年庆祝会、第十届粤港生物物理研讨会暨2012年广东生物物理学术年会

作者：马岩岩荣靖彭鑫磊刘秋英舒辉萍陈海佳王一飞任哲暨南大学生物医药研究开发基地广东省生物工程药物重点实验室基因工程药物国家工程研究中心

目的 :构建穿膜肽KGF-2(TAT-KGF-2),研究其对人角质形成细胞HaCaT的增殖作用。方法 :采用普通PCR技术和特殊引物从人胚胎肺成纤维细胞cDNA中扩增出目的基因TAT-KGF-2,并将其插入pET-28a(+)载体中构建pET28a-TAT-KGF-2重组质粒;将重组质... 详细信息

目的 :构建穿膜肽KGF-2(TAT-KGF-2),研究其对人角质形成细胞HaCaT的增殖作用。方法 :采用普通PCR技术和特殊引物从人胚胎肺成纤维细胞cDNA中扩增出目的基因TAT-KGF-2,并将其插入pET-28a(+)载体中构建pET28a-TAT-KGF-2重组质粒;将重组质粒转化大肠杆菌Rosetta(DE3),IPTG诱导表达重组蛋白TAT-KGF-2;通过Ni-NTA柱纯化获得目标重组蛋白并利用western blot进行鉴定;MTT法研究TAT-KGF-2对HaCa的增殖作用。结果 :成功构建pET28a-TAT-KGF-2重组质粒,经序列比对,与GenBank上公布的人KGF-2基因序列同源性达到100%;获得穿膜肽KGF-2蛋白,分子量约为19 KDa,纯度达到95%以上;TAT-KGF-2对HaCaT在12.5ng/ml时具有增殖作用,并呈浓度依赖性,而且与不具有穿膜功能的KGF-2相比有更强的增殖效果。结论 :成功纯化出TAT-KGF-2蛋白,并验证其对HaCaT具有增殖作用,为进一步研究该蛋白的结构和功能奠定了基础。

关键词： KGF-2 穿膜肽克隆原核表达纯化 HaCaT细胞株

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