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眼科研究 2009年第10期27卷 839-843页

作者：李燕陈建苏李晓霞王伟暨南大学眼科研究室再生医学教育部重点实验室暨南大学附属第一临床医学院眼科广州510632

目的检测转谷氨酰胺酶交联胶原凝胶对三维培养的角膜基质细胞的影响,探讨可提高机械性能的组织工程角膜基质层新途径。方法胶原酶消化法获取原代兔角膜基质细胞,以加入转谷氨酰胺酶与胶原凝胶交联为实验组,不加酶交联为对照组。倒置显... 详细信息

目的检测转谷氨酰胺酶交联胶原凝胶对三维培养的角膜基质细胞的影响,探讨可提高机械性能的组织工程角膜基质层新途径。方法胶原酶消化法获取原代兔角膜基质细胞,以加入转谷氨酰胺酶与胶原凝胶交联为实验组,不加酶交联为对照组。倒置显微镜下每日观察细胞生长情况、Alamar-Blue试剂检测细胞增生、免疫荧光法检测凝胶内细胞波形蛋白、检测透光度、酶消化法检测胶原凝胶抗消化能力。结果实验组细胞胶原凝胶内附着和生长优于对照组,细胞在凝胶内呈树枝状生长。2组细胞均随培养时间延长明显增生(P=0.000)。共焦显微镜下见2组细胞胞浆波形蛋白均阳性表达,实验组细胞伪足更丰富。实验组透光度稍差于对照组。实验组抵抗胶原酶消化的能力显著增强。结论酶交联的胶原凝胶对角膜基质细胞无毒性作用,重构的基质层结构更加稳定,有利于组织工程角膜基质层的构建。

关键词：转谷氨酰胺酶交联胶原凝胶组织工程角膜

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CdSe／ZnS核壳结构量子点用于人诱导多能干细胞标记的研究

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中华实验眼科杂志 2013年第9期31卷 819-822页

作者：谭美华陈建苏陈剑吴静招志毅戴应李善义暨南大学第一临床医学院眼科广州510632 暨南大学医学院眼科研究所广州510632 再生医学教育部重点实验室

背景近年来，诱导多能干细胞（iPSCs）的多向分化特性为各种临床疾病的细胞替代治疗提供了新的种子来源，在眼科领域，iPSCs已成为人眼变性类疾病发病机制研究的良好模型，而更好的iPSCs识别和鉴定技术是对其体内生物学特性进行研究的... 详细信息

背景近年来，诱导多能干细胞（iPSCs）的多向分化特性为各种临床疾病的细胞替代治疗提供了新的种子来源，在眼科领域，iPSCs已成为人眼变性类疾病发病机制研究的良好模型，而更好的iPSCs识别和鉴定技术是对其体内生物学特性进行研究的基础。目的探讨量子点标记人iPSCs的可行性及其最佳浓度，并观察量子点标记人iPSCs的光稳定性，为iPSCs应用于眼部细胞移植的实验研究和临床研究提供一种新的示踪技术。方法用无饲养层细胞培养法培养和扩增脐带间充质基质细胞一人iPSCs系，并用免疫荧光法对其干细胞特性进行鉴定；选取不同浓度CdSe／ZnS核壳结构的量子点对扩增培养的iPSCs进行标记，用三维去卷积实时活细胞成像系统观察标记效果。将量子点标记后的iPSCs继续培养，分别于1次传代后1周和2次传代后1周观察荧光标记的稳定性。结果倒置显微镜下观察可见培养和扩增的iPSCs呈克隆样生长，免疫荧光检测显示iPSCs中OCT4和Nanog两种干细胞标志蛋白均阳性表达。5．0、7．5、10．0nmol／L三种浓度的量子点标记后均可见iPSCs中的橘红色荧光，随着量子点浓度的增加，iPSCs中标记的橘红色颗粒明显增加，10．0nmol／L量子点标记后iPSCs中的橘红色荧光最强，荧光颗粒最多。iPSCs2次传代1周后仍可观察到量子点的橘红色荧光，但与传代前和1次传代后1周相比荧光强度减弱。结论量子点标记技术可示踪iPSCs，其荧光标记效果呈浓度依赖性。本研究实验条件下量子点标记的荧光至少可维持2周。

关键词：量子点标志物诱导多能干细胞示踪

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兔角膜内皮细胞球形培养的活性和细胞表型

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中华实验眼科杂志 2014年第9期32卷 786-790页

作者：杨艳刘庆郭永龙王婵傅婷陈建苏暨南大学第一临床医学院眼科广州510632 暨南大学第一临床医学院再生医学教育部重点实验室广州510632 暨南大学第一临床医学院眼科研究所广州510632

背景组织工程角膜内皮层的构建和细胞注射疗法需要足够数量的角膜内皮细胞（CECs）,因此如何在体外培养大量高活性的角膜内皮种子细胞是当前亟需解决的问题. 目的建立兔CECs高活性三维（3D）球形培养方法,探索培养细胞的生物学特性. ... 详细信息

背景组织工程角膜内皮层的构建和细胞注射疗法需要足够数量的角膜内皮细胞（CECs）,因此如何在体外培养大量高活性的角膜内皮种子细胞是当前亟需解决的问题. 目的建立兔CECs高活性三维（3D）球形培养方法,探索培养细胞的生物学特性. 方法酶消化法分离和培养兔CECs并进行传代,经低黏附振动培养法产生兔CECs球,倒置相差显微镜下观察培养细胞的形态;采用扫描电子显微镜观察CECs球的表面超微结构;用吖啶橙染色法鉴定CECs球中细胞的活性;采用CCK-8试剂盒检测细胞的吸光度（A450）值,判断细胞的增生情况.将CECs球接种到6孔细胞培养板贴壁培养1周,球形培养的细胞为球形培养组,常规培养的细胞为常规培养组.采用免疫荧光法检测闭锁小带蛋白1（ZO-1）和Na＋/K＋-ATP酶在细胞中的表达.结果经球形培养的CECs呈聚集生长,培养1周细胞形态为六角形或多边形,融合成单层,呈铺路石状排列;扫描电子显微镜下可见兔CECs球体周围有细胞爬出,未长散的细胞球中细胞与细胞之间结合紧密,球体表面凹凸不平.吖啶橙染色表明,细胞球中90％细胞呈绿色荧光;球形培养组细胞平均A450值为1.524±0.013,常规培养组细胞平均A450值为1.265±0.021,球形培养组细胞增生值明显增加,2个组间差异有统计学意义（t=-3.436,P=0.010）.免疫荧光检测表明,培养的细胞中ZO-1和Na＋/K＋-ATP酶阳性细胞膜对FITC呈绿色荧光,细胞核DAPI染色呈蓝色荧光.结论 CECs的3D球形培养方法培养的细胞可保持细胞的高活性、高增生能力和细胞表型,为构建组织工程角膜内皮及细胞疗法提供了更好的角膜内皮种子细朐.

关键词：角膜内皮细胞球形培养三维细胞活性细胞表型

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共培养环境中兔角膜内皮细胞诱导人iPSCs分化

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中国病理生理杂志 2012年第8期28卷 1488-1493页

作者：谭美华陈建苏招志毅丁勇钟敬祥戴应李善义杨皓庄暨南大学第一临床医学院眼科暨南大学医学院眼科研究所暨南大学再生医学教育部重点实验室暨南大学医学院病理生理学系广东广州510632

目的:观察人诱导多能干细胞(induced pluripotent stem cells,iPSCs)与兔角膜内皮细胞(cornealendothelial cells,CECs)共培养前后的形态学变化,检测iPSCs向CECs分化前后部分标志蛋白表达的变化,为研究iPSCs向CECs的分化提供实验依据。... 详细信息

目的:观察人诱导多能干细胞(induced pluripotent stem cells,iPSCs)与兔角膜内皮细胞(cornealendothelial cells,CECs)共培养前后的形态学变化,检测iPSCs向CECs分化前后部分标志蛋白表达的变化,为研究iPSCs向CECs的分化提供实验依据。方法:分离培养兔CECs并传代,同时使用无饲养层细胞法培养扩增人脐带源iPSCs,Western blotting对其进行鉴定;用量子点对iPSCs进行标记示踪,以不同密度比例建立iPSCs与CECs的共培养模式,用原子力显微镜(atomic force microscopy,AFM)结合倒置显微镜观察共培养前后iPSCs的形态学变化,免疫荧光法检测iPSCs分化前后CD34、CD133、CD31和水通道蛋白1(AQP1)蛋白表达的变化。结果:培养扩增的兔CECs形态为六边形,呈典型的铺路石样外观;iPSCs呈克隆样生长,Western blotting检测Oct4、Nanog和Sox2多能性标志蛋白均呈阳性;10 nmol/L量子点标记的iPSCs以1/4悬液与融合60%的兔CECs共培养为最佳模式;AFM结合倒置显微镜观察到共培养后iPSCs体积增大,胞浆增多,核浆比减小,细胞膜表面可见颗粒状突起物,膜表面粗糙度增加;免疫荧光法检测分化前iPSCs的CD34、CD133、CD31和AQP1表达均呈阴性,共培养2周后iPSCs的CD34、CD133和CD31表达阴性,AQP1表达阳性。结论:与兔CECs混合共培养后人iPSCs不仅从形态学上向内皮样细胞方向转化,同时表达角膜内皮细胞标志蛋白AQP1。

关键词：诱导多能干细胞角膜内皮细胞混合培养显微镜检查原子力水通道蛋白1

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有序排列微模板培养角膜基质细胞及其细胞生物学变化

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眼科研究 2010年第8期28卷 699-702页

作者：田振彩陈建苏周平李沁华李晓霞戴静赵秀丽暨南大学附属第一医院眼科暨南大学医学院眼科研究室再生医学教育部重点实验室广州510632 暨南大学生物医学工程系广州510632

目的探讨CO2激光打标机处理的有序排列微模板培养兔角膜基质细胞的生长特征及其细胞生物学变化。方法用CO2激光打标机刻制的聚苯乙烯有序排列微模板培养兔角膜基质细胞,模板沟槽划线间隔距离0.25mm者为窄间隔组,间隔距离1mm者为宽间隔组... 详细信息

目的探讨CO2激光打标机处理的有序排列微模板培养兔角膜基质细胞的生长特征及其细胞生物学变化。方法用CO2激光打标机刻制的聚苯乙烯有序排列微模板培养兔角膜基质细胞,模板沟槽划线间隔距离0.25mm者为窄间隔组,间隔距离1mm者为宽间隔组,平板组作为对照组。将角膜基质细胞悬液以1×105/mL细胞密度接种于培养板中,倒置显微镜下观察细胞生长情况,苏木精-伊红染色观察细胞排列的形态学差异,免疫荧光法检测培养板上细胞的波形蛋白,实时监测显微镜下观察24h窄间隔组细胞的接触指引特性及细胞的动态生长过程。结果培养第1天倒置显微镜下见3组培养细胞贴壁生长状态无明显区别,窄间隔组和宽间隔组细胞逐渐围绕沟槽接触指引生长,表现为有序排列,且窄间隔组较宽间隔组明显。苏木精-伊红染色和免疫荧光染色显示培养的细胞在窄间隔组沟槽的接触指引下呈有序排列,呈现10余层细胞排列的平行板层结构。3组细胞波形蛋白免疫荧光染色均呈阳性反应。实时监测显微镜下可见窄间隔组细胞体部首先贴壁,在接触指引下生长,而细胞在干燥环境下的凋亡始于细胞伪足突起处。结论利用CO2激光打标机制备的有序排列微模板可获得有序排列的角膜基质细胞,有利于在接近生理状态条件下角膜基质层的构建。

关键词：角膜基质细胞有序排列细胞培养微纹理细胞生物学

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PACAP38对兔角膜瓣术后三叉神经节细胞及角膜神经生长的影响

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眼科研究 2010年第8期28卷 694-698页

作者：赵秀丽陈建苏余榕捷丁勇郑佩娥李晓霞田振彩戴静暨南大学附属第一医院眼科暨南大学医学院眼科研究室再生医学教育部重点实验室广州510632 暨南大学生物医学工程系广州510632

目的观察垂体腺苷酸环化酶激活肽(PACAP38)对培养的兔三叉神经节细胞及角膜瓣术后角膜神经生长的影响。方法从2周龄新西兰白兔中分离三叉神经节细胞,并在神经元基础培养液中进行培养。培养24h后在培养液中分别加入1μmol/LPACAP38(A组)... 详细信息

目的观察垂体腺苷酸环化酶激活肽(PACAP38)对培养的兔三叉神经节细胞及角膜瓣术后角膜神经生长的影响。方法从2周龄新西兰白兔中分离三叉神经节细胞,并在神经元基础培养液中进行培养。培养24h后在培养液中分别加入1μmol/LPACAP38(A组)、0.1μmol/LPACAP38(B组),C组培养液中加入PBS。1周后行抗神经纤维丝蛋白(NF200)免疫荧光染色鉴别培养的三叉神经节细胞。27只新西兰白兔右眼行角膜瓣手术,并分为3组,术后1d分别以10μmol/LPACAP38、5μmol/LPACAP38或PBS点眼,共8周,行角膜敏感度测定和NF200免疫荧光染色,评价术后不同时间角膜神经的修复情况。结果 PACAP38培养的三叉神经节细胞有较多神经细胞存活,伸出突触并交织呈网状,A组神经细胞存活最多。角膜瓣手术的3个组角膜敏感度随着术后时间的延长逐渐增加(Ftime=58.196,P=0.00),10μmol/LPACAP38点眼组角膜敏感度恢复最快。10μmol/LPACAP38点眼组和5μmol/LPACAP38点眼组角膜敏感度值明显高于PBS点眼组,差异均有统计学意义(P=0.000,P=0.005)。角膜神经染色示10μmol/LPACAP38点眼组角膜神经密度较5μmol/LPACAP38点眼组和PBS点眼组高,神经干短端多膨大,以出芽方式发出细微的新生神经纤维芽。结论 PACAP38能促进兔三叉神经节细胞增生及诱导神经突形成,可促进角膜敏感性恢复及角膜神经修复再生。

关键词：垂体腺苷酸环化酶激活肽细胞增生分化神经再生角膜

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自体血小板血浆对角膜基质细胞生物学功能的影响

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眼科新进展 2010年第8期30卷 705-708,713页

作者：戴静陈建苏李晓霞田振彩赵秀丽暨南大学附属第一医院眼科暨南大学医学院眼科研究室再生医学教育部重点实验室广东省广州市510632

目的观察自体血小板血浆对体外培养的角膜基质细胞生物学功能的影响。方法采用二次离心法分离兔全血获得富血小板血浆（platelet—richplasma，PRP）和贫血小板血浆（platelet—poorplasma，PPP）；原代培养兔角膜基质细胞，取第3代细... 详细信息

目的观察自体血小板血浆对体外培养的角膜基质细胞生物学功能的影响。方法采用二次离心法分离兔全血获得富血小板血浆（platelet—richplasma，PRP）和贫血小板血浆（platelet—poorplasma，PPP）；原代培养兔角膜基质细胞，取第3代细胞用于实验。在角膜基质细胞中分别加入体积分数5．0％的PRP和PPP，倒置显微镜下观察细胞生长情况，对比PRP和PPP对角膜基质细胞的促生长情况，以确定自体血小板血浆中促增殖作用的最有效成分。采用不同浓度的PRP（体积分数分别为2．5％、5．0％、10．0％）作用于角膜基质细胞，以及采用不同浓度PRP（体积分数分别为2．5％、5．0％、20．0％）联合FBS作用于角膜基质细胞，CCK-8法检测PRP、PRP联合FBS促进角膜基质细胞增殖的作用。对不同浓度（体积分数分别为2．5％、5．0％）PRP作用的角膜基质细胞进行免疫荧光法检测其表达的平滑肌型肌动蛋白（a-smooth muscle actin，a-SMA）．结果加入体积分数5．0％PRP组促细胞增殖作用强于加入体积分数5．0％PPP组。PRP在体积分数为2．5％～10．0％时，均能促进角膜基质细胞的增殖，其中体积分数为5．0％时作用最强；体积分数5．0％PRP与FBS联合作用时的吸光度值随时间的变化均明显高于两者单独作用时的吸光度值（均为P〈0．05），而体积分数20．0％的PRP与FBS联合作用时的吸光度值随时间的变化低于FBS单独作用时的吸光度值。不同浓度PRP处理的角膜基质细胞均可见a-SMA的阳性表达。结论低浓度的PRP能有效促进角膜基质细胞的增殖及活化，有利于角膜基质损伤的快速修复，促进伤口愈合，防止严重并发症的发生。

关键词：自体血小板血浆富血小板血浆贫血小板血浆角膜基质细胞兔

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异种全厚板层角膜和前板层角膜植片板层移植术后拆线时间探讨

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眼科新进展 2009年第3期29卷 165-169页

作者：吴连胜陈建苏徐锦堂丁勇郑佩娥暨南大学医学院眼科研究室再生医学教育部重点实验室广东省广州市510630 暨南大学附属第一临床医学院眼科暨南大学医学院病理教研室东莞市凤岗镇雁田广济医院眼科

目的研究全厚板层和前板层角膜移植后不同的角膜缝线拆除时间对植片的影响。方法将32只健康新西兰白兔随机分成4组,每组各8只:A组、B组(A、B2组又合为M组)为猫→兔异种全厚板层移植组。C组、D组(C、D2组又合为N组)为猫→兔异种前板层移... 详细信息

目的研究全厚板层和前板层角膜移植后不同的角膜缝线拆除时间对植片的影响。方法将32只健康新西兰白兔随机分成4组,每组各8只:A组、B组(A、B2组又合为M组)为猫→兔异种全厚板层移植组。C组、D组(C、D2组又合为N组)为猫→兔异种前板层移植组。术眼为右眼,植片直径为9.0mm,植床直径为8.0mm。A、C2组拆线时间为10d(A、C2组又合为G组),B、D2组拆线时间为1个月(B、D2组又合为H组)。观察时间为3个月。结果用两因素方差分析法分析3个月时的炎性反应指数:(1)角膜植片M组(2.560±2.065)与N组(5.250±2.887)比较差异有显著统计学意义(F=15.427,P=0.001<0.05),即M组炎性反应较轻;(2)拆线时间G组(2.560±2.128)与H组(5.250±2.840)比较差异有显著统计学意义(F=15.427,P=0.001<0.05),即G组炎性反应较轻;(3)角膜植片差异联合拆线时间差异:F=7.017,P=0.013<0.05,差异有统计学意义,即角膜植片差异和拆线时间之间存在交互影响角膜移植炎性反应作用。结论角膜植片差异和拆线时间差异均存在影响异种角膜移植炎性反应的作用,并且二者存在交互作用。

关键词：炎性反应指数异种角膜移植全厚板层角膜移植前板层角膜移植高渗葡萄糖角膜水肿兔猫

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肾纤维囊作为载体培养角膜基质细胞的研究

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广东医学 2009年第1期30卷 23-25页

作者：唐光霞陈建苏徐锦堂夏潮涌丁勇暨南大学附属第一医院眼科广州510630 暨南大学医学院眼科研究室再生医学教育部重点实验室广州510632 暨南大学医学院组织学与胚胎学教研室广州510632

目的探索以脱细胞的肾纤维囊作为载体培养角膜基质细胞并研究培养角膜基质细胞特性。方法将培养扩增的兔角膜基质细胞分别接种到培养板和肾纤维囊上进行体外培养,采用倒置显微镜、免疫组化(波形蛋白)和免疫荧光(AO、PI和Hoechst)的方法... 详细信息

目的探索以脱细胞的肾纤维囊作为载体培养角膜基质细胞并研究培养角膜基质细胞特性。方法将培养扩增的兔角膜基质细胞分别接种到培养板和肾纤维囊上进行体外培养,采用倒置显微镜、免疫组化(波形蛋白)和免疫荧光(AO、PI和Hoechst)的方法进行检测,观察兔角膜基质细胞在培养板和肾纤维囊上的生长情况。结果倒置显微镜和免疫荧光显微镜观察结果显示角膜基质细胞在肾纤维囊上快速贴壁生长并增殖,细胞形态呈多角形树枝状,多次传代后细胞仍维持原有的形态和功能,细胞能长期培养。在培养板上培养的细胞呈长梭形,细胞贴壁生长和增殖情况稍差。在肾纤维囊上的活细胞较在培养板上培养的细胞多。结论角膜基质细胞在脱细胞的肾纤维囊载体上生长良好,细胞形态结构明显。本研究为角膜基质细胞的体外培养,提供了简单和高效的方法。

关键词：肾纤维囊角膜基质细胞细胞培养

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重编程诱导多功能干细胞的研究进展

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中国病理生理杂志 2014年第7期30卷 1218-1222,1227页

作者：郭晓令刘庆王婵郭永龙余榕捷陈建苏暨南大学再生医学教育部重点实验室广东广州510632 暨南大学附属第一临床学院眼科广东广州510632 暨南大学生命科学技术学院细胞生物学系广东广州510632 暨南大学医学院眼科研究所广东广州510632

诱导多功能干细胞（ induced pluripotent stem cells，iPSCs），即通过不同的转导方法，将影响重编程的关键转录因子、RNA、蛋白或小分子化合物导入到成体细胞，使其＂返老还童＂回到胚胎干细胞状态，并能够被诱导分化产生不同的细胞... 详细信息

诱导多功能干细胞（ induced pluripotent stem cells，iPSCs），即通过不同的转导方法，将影响重编程的关键转录因子、RNA、蛋白或小分子化合物导入到成体细胞，使其＂返老还童＂回到胚胎干细胞状态，并能够被诱导分化产生不同的细胞类型。 iPSCs 的问世，对干细胞的发展具有划时代的意义，使得患者来源的体细胞可以被诱导成iPSCs，用于相关疾病的检测分析与干细胞治疗，规避了免疫排斥和道德论理等问题。但是由于iPSCs诱导的低效性和致瘤性，使得这个＂新星＂在临床中的应用被质疑，目前科学家一直围绕这2个核心问题展开研究，通过改进转导途径，改变重编程方法来提高它的安全性和效率，并取得了一系列喜人的结果，从而使iPSCs未来用于临床的前景变得越来越光明。

关键词：诱导多能性干细胞安全性有效性

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