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现代免疫学 2008年第5期28卷 353-357页

作者：段小红江逊何贤辉郑德育王晓燕史剑波许庚崔鹏程第四军医大学唐都医院耳鼻咽喉科西安710038 第四军医大学唐都医院小儿科西安710038 暨南大学组织移植与免疫中心广州510632 第四军医大学口腔医学院西安710036 中山大学附属第一医院耳鼻咽喉科广州510080

为检测吲哚胺2,3-双加氧酶(IDO)基因修饰的原代培养软骨细胞对T淋巴细胞的免疫抑制作用。将pEGFP-N1-IDO真核表达载体转染至C57小鼠原代培养的软骨细胞,体外检测IDO修饰的软骨细胞培养液中色氨酸水平的变化;使用CFSE标记技术,检测IDO修... 详细信息

为检测吲哚胺2,3-双加氧酶(IDO)基因修饰的原代培养软骨细胞对T淋巴细胞的免疫抑制作用。将pEGFP-N1-IDO真核表达载体转染至C57小鼠原代培养的软骨细胞,体外检测IDO修饰的软骨细胞培养液中色氨酸水平的变化;使用CFSE标记技术,检测IDO修饰的软骨细胞体外混合淋巴细胞反应中对同种异体T淋巴细胞增殖的影响。结果:pEGFP-N1-IDO成功被导入原代培养的小鼠软骨细胞,荧光显微镜和流式细胞术均检测到EGFP的表达;体外实验表明,原代培养的软骨细胞上清可检测到一定量的色氨酸水平,而转染IDO 24 h后的软骨细胞上清中未检测到色氨酸,提示IDO转染的软骨细胞表达了具有活性IDO;使用CFSE标记技术,检测IDO修饰的软骨细胞体外混合淋巴细胞反应中对同种异体T淋巴细胞增殖的影响,发现IDO基因转染组96 h后总体增殖指数为1.122±0.017,单纯淋巴细胞阴性对照组为1.026±0.016,阳性单纯软骨细胞组为1.201±0.026,较阳性对照组,IDO基因组同种异体T淋巴细胞增殖得到明显抑制。IDO基因修饰的软骨细胞可以抑制T淋巴细胞的增殖。

关键词：基因转染基因表达软骨细胞吲哚胺2,3-双加氧酶混合淋巴细胞反应

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体外培养人鼻中隔软骨细胞合成硫酸糖胺多糖的检测

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中国组织工程研究与临床康复 2008年第46期12卷 9041-9044页

作者：江逊段小红狄静芳史剑波许庚崔鹏程解放军第四军医大学唐都医院儿科陕西省西安市710038 解放军第四军医大学唐都医院耳鼻咽喉科陕西省西安市710038 暨南大学组织移植与免疫教育部重点实验室广东省广州市510632 中山大学附属第一医院耳鼻咽喉科广东省广州市510080

背景:软骨细胞的培养及稳定传代是转基因、构建组织工程化软骨组织及异体移植的前提条件。目的:定量检测体外培养人鼻中隔软骨细胞合成分泌硫酸糖胺多糖的变化情况,评价其对不同代次软骨细胞生物学功能活性。设计、时间及地点:对比观察... 详细信息

背景:软骨细胞的培养及稳定传代是转基因、构建组织工程化软骨组织及异体移植的前提条件。目的:定量检测体外培养人鼻中隔软骨细胞合成分泌硫酸糖胺多糖的变化情况,评价其对不同代次软骨细胞生物学功能活性。设计、时间及地点:对比观察的细胞学实验,于2004-01/2005-07在暨南大学组织移植与免疫教育部重点实验室完成。材料:人鼻中隔软骨细胞来自鼻中隔偏曲患者手术切除的软骨组织,患者对实验内容知情同意。方法:胶原酶消化分离原代人鼻中隔软骨细胞传代培养至第7代。主要观察指标:阿尔新蓝比色法测定各代细胞外基质的硫酸糖胺多糖含量,光镜观察甲苯胺蓝染色后细胞形态。结果:原代软骨细胞具有最高的硫酸糖胺多糖分泌活性,至第4代则出现了非常明显的下降,第4代以后很低下。甲苯胺蓝染色显示原代细胞对甲苯胺蓝呈明显的蓝色异染反应,第3代异染反应明显减弱,第4代以后异染反应微弱,其结果与硫酸糖胺多糖含量变化相一致。结论:人鼻中隔软骨细胞在体外培养过程中,随传代次数的增加而功能活性逐渐降低,第3代以后的细胞不适于作为人软骨组织工程种子细胞和用于细胞生物学等方面研究。

关键词：葡萄糖氨基浆糖类软骨细胞细胞外基质生物材料

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血卟啉单甲醚光动力学疗法对小鼠接触性超敏反应的抑制效应

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中国激光医学杂志 2008年第1期17卷 13-17,73页

作者：邱海霞刘红梅顾瑛李德生曾耀英何贤辉刘丽红中国人民解放军总医院激光医学科北京市100853 军事医学科学院附属医院神经外科暨南大学生命科学院组织移植与免疫中心

目的探讨血卟啉单甲醚光动力学疗法(hematoporphyrin monomethyl ether mediated photodynamic therapy,HMME-PDT)对小鼠接触性超敏反应(contacthypersensitivity,CHS)的影响。方法雌性BALB/c小鼠按功率密度分为50和100mW/cm2两个实验组,同时设置单纯照光组、单纯光敏剂组、空白对照组以及DNFB组。PDT处理后3d,各实验组分别以2,4-二硝基氟苯(DNFB)诱发小鼠右耳变应性接触性皮炎,以游标卡尺测量发敏前后右耳的厚度差;对于功率密度为50mW/cm2组,进一步观察了PDT处理前4d或PDT处理后1、3和12d,DNFB发敏前后小鼠右耳的厚度差,并对PDT后3d组行组织学检查,以目镜网格测微尺计算浸润炎症细胞数量。结果处理前4d预先以DNFB致敏,PDT对CHS无抑制作用(P>0.05)。反之,PDT照射后1、3或12d再以DNFB致敏,则PDT能对CHS产生显著抑制作用(P<0.01),其抑制率分别为58%,63%,47%。且无论是以50mW/cm2还是以100mW/cm2功率密度的激光照射,这种抑制作用均存在。未经任何干预,DNFB致敏组致敏右耳浸润的单核细胞和中性粒细胞的数量增加,而经PDT处理后,浸润的炎性细胞明显减少,二者之间存在显著性差异(P<0.01)。结论HMME-PDT能对正常小鼠接触性超敏反应产生明显抑制作用,并有短暂持续效应。

关键词：光动力学疗法血卟啉单甲醚接触性超敏反应

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茴香霉素在小鼠淋巴细胞增殖和活化中的作用

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中华微生物学和免疫学杂志 2007年第10期27卷 888-892页

作者：于哲邢飞跃王通陈笛陈玲暨南大学组织移植与免疫中心广州510632

目的研究茴香霉素在小鼠淋巴细胞增殖和活化中的作用。方法以活体染料羧基荧光素乙酰乙酸琥珀酰业胺酯染色,建立了在多克隆刺激剂刀豆蛋白A(Con A)刺激下评价小鼠淋巴细胞增殖的模型,通过流式细胞术及MTT法分析茴香霉素在不同剂量下对... 详细信息

目的研究茴香霉素在小鼠淋巴细胞增殖和活化中的作用。方法以活体染料羧基荧光素乙酰乙酸琥珀酰业胺酯染色,建立了在多克隆刺激剂刀豆蛋白A(Con A)刺激下评价小鼠淋巴细胞增殖的模型,通过流式细胞术及MTT法分析茴香霉素在不同剂量下对淋巴细胞增殖的作用;采用碘化丙锭染色分析茴香霉素对Con A或佛波醇酯(PDB)加离子霉素(Ion)刺激的小鼠淋巴细胞周期变化的作用;利用荧光标记的单克隆抗体双染技术结合流式细胞仪检测茴香霉素对小鼠CD3+淋巴细胞早期及中期活化标志分子CD69和CD25表达的影响。结果随着茴香霉素浓度从1.0 ng/ml逐渐增至25.0 ng/ml,Con A对淋巴细胞的促增殖作用逐渐减弱,以10.0 ng/ml和25.0 ng/ml茴香霉素的抑制作用最为明显,呈剂量依赖关系(r=-0.96,P<0.01)。进一步发现,1.0～25.0 ng/ml茴香霉素能够使Con A或PDB加Ion诱导的淋巴细胞停滞于G0/G1期,阻止其进入S期,且阻止作用随上述浓度的增加而增强,呈明显剂量依赖关系(r=-0.97,P<0.01和r=-0.98,P<0.01)。据此选用最佳剂量10.0 ng/ml,茴香霉素能够明显抑制淋巴细胞表面分子CD69和CD25的表达(P均<0.01)。结论茴香霉素能明显抑制小鼠淋巴细胞的增殖和活化。

关键词：茴香霉素淋巴细胞增殖细胞周期活化

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激光对细胞内反应氧、钙离子浓度及细胞膜完整性的影响

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解剖学报 2007年第3期38卷 330-333页

作者：季煜华曾耀英钱中清暨南大学组织移植与免疫中心广州510632

目的探讨在激光扫描共焦显微镜(LSCM)观测活细胞的过程中,激光对细胞内反应氧(ROS)、细胞内钙离子浓度([Ca2+]i)和细胞膜完整性的影响。方法用H2DCFDA、Fluo-4AM和Calcein-AM/PI分别检测488nm激光对脐静脉内皮细胞株(ECV-304)细胞内ROS... 详细信息

目的探讨在激光扫描共焦显微镜(LSCM)观测活细胞的过程中,激光对细胞内反应氧(ROS)、细胞内钙离子浓度([Ca2+]i)和细胞膜完整性的影响。方法用H2DCFDA、Fluo-4AM和Calcein-AM/PI分别检测488nm激光对脐静脉内皮细胞株(ECV-304)细胞内ROS、[Ca2+]i和细胞膜完整性的影响,Ultra view LCI(live cell image)共聚焦成像系统采集并分析结果。结果激光照射后细胞内DCF的荧光强度迅速上升,约80s达到峰值,随后下降并逐渐回到基础水平;Fluo-4的荧光强度在70min内持续平缓地上升;Calcein的荧光强度明显下降,少量细胞PI阳性染色。结论488nm激光照射可引起细胞内ROS和[Ca2+]i的增加,但对细胞膜的完整性没有显著影响。

关键词：激光反应氧细胞内钙离子浓度细胞活性激光扫描共焦显微镜脐静脉内皮细胞株

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可溶性人sPD-L1及其抗体的制备和鉴定

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生物工程学报 2007年第1期23卷 106-111页

作者：徐丽慧迟晓云李丰耀贾仟涛查庆兵何贤辉暨南大学生命科学技术学院组织移植与免疫实验中心

通过固定化金属离子亲和层析进行柱上复性与纯化,获得高纯度的可溶性PD-L1胞外域(sPD-L1),其纯度达95%,纯化的sPD-L1经免疫印迹分析得到验证,并具有与其受体PD-1的特异性结合活性;以该抗原免疫小鼠获得高滴度的抗血清,并以制备的sPD-L1-... 详细信息

通过固定化金属离子亲和层析进行柱上复性与纯化,获得高纯度的可溶性PD-L1胞外域(sPD-L1),其纯度达95%,纯化的sPD-L1经免疫印迹分析得到验证,并具有与其受体PD-1的特异性结合活性;以该抗原免疫小鼠获得高滴度的抗血清,并以制备的sPD-L1-HiTrap亲和层析柱纯化获得高纯度特异性抗体;将该抗体与另一商业化抗体结合建立了一种灵敏的双夹心ELISA法,检测范围为1ng/mL^100ng/mL,可用于分析可溶性PD-L1的含量。可溶性sPD-L1及其抗体的制备不仅可用于人体内特异性抗体和可溶性PD-L1的检测,同时也为进一步研究其体内外活性及其受体的性质提供了条件。

关键词： PD-L1 原核表达重折叠亲和层析抗体

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桑色素对小鼠T淋巴细胞体外活化、增殖和细胞周期的影响

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细胞与分子免疫学杂志 2007年第3期23卷 197-200页

作者：臧宁曾耀英黄秀艳王通叶雪仪周建国王会营暨南大学组织移植与免疫中心广东广州510632

目的:研究桑色素(morin)对小鼠T淋巴细胞活化、增殖和细胞周期的影响。方法:以刀豆蛋白A(ConA)刺激培养的淋巴结来源的小鼠淋巴细胞,再以不同终浓度的morin与T细胞共培养,利用流式细胞术(FCM),检测早期T细胞活化的标志CD69分子的表达,... 详细信息

目的:研究桑色素(morin)对小鼠T淋巴细胞活化、增殖和细胞周期的影响。方法:以刀豆蛋白A(ConA)刺激培养的淋巴结来源的小鼠淋巴细胞,再以不同终浓度的morin与T细胞共培养,利用流式细胞术(FCM),检测早期T细胞活化的标志CD69分子的表达,以羧基荧光素双醋酸盐琥珀酰脂(CFDA-SE)染色检测T细胞的增殖;以碘化丙锭(PI)染色分析T细胞的细胞周期。结果:小鼠T细胞培养6 h后,未经ConA刺激的对照组中CD69+T的细胞比率为(2.97±0.12)%,经ConA刺激的CD69+T细胞的比率明显增高,达到(72.52±0.66)%,与对照组相比差别明显(P<0.01)。终浓度为25、50、100μmol/L的morin均下调CD69+T细胞的比率,其中,100μmol/L的morin抑制作用最强,为(48.95±0.81)%,与对照组比较具有统计学意义(P<0.01)。CFDA-SE染色分析显示,ConA组培养48 h和72 h的T细胞的增殖指数(PI)分别为(1.58±0.04)和(1.95±0.02),各浓度的morin对ConA刺激的T细胞增殖,具有明显地抑制作用,以100μmol/L的morin抑制作用最明显。培养48 h的ConA组T细胞的PI为(1.02±0.02)、培养72 h的ConA组T细胞的PI为(1.03±0.01),与相应时间的对照组比较,均有统计学意义(P<0.01)。PI染色后流式细胞术分析的结果表明,ConA组处于S期的T细胞的比率为(27.05±0.39)%,显著高于对照组的比率(5.10±0.07)%。morin组中S期的细胞比率较高。结论:Morin可显著抑制ConA刺激的T细胞活化及增殖;其对增殖的抑制作用主要表现为S期的细胞的阻滞。

关键词：桑色素 T细胞活化增殖细胞周期

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鹰嘴豆芽素A对小鼠T淋巴细胞体外活化增殖和细胞周期的影响

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暨南大学学报（自然科学与医学版） 2007年第2期28卷 115-119页

作者：林长乐曾耀英曾祥凤赵令斋黄秀艳叶雪仪暨南大学组织移植与免疫实验中心广东广州510632

目的:研究黄酮类化合物鹰嘴豆芽素A(biochanin A,bioA)对小鼠T淋巴细胞的活化增殖和周期的影响。方法:运用双色荧光抗体染色技术结合流式细胞术分析bioA对小鼠T淋巴细胞在多克隆刺激剂(ConA)刺激下早期活化抗原CD69表达的影响;运用羧基... 详细信息

目的:研究黄酮类化合物鹰嘴豆芽素A(biochanin A,bioA)对小鼠T淋巴细胞的活化增殖和周期的影响。方法:运用双色荧光抗体染色技术结合流式细胞术分析bioA对小鼠T淋巴细胞在多克隆刺激剂(ConA)刺激下早期活化抗原CD69表达的影响;运用羧基荧光素乙酰乙酸(carboxyfluorescein diacetate,succinimidyl ester,CFDA-SE)标记技术结合流式细胞术,分析T淋巴细胞增殖相关指数;用碘化丙锭(propidium iodide,PI)染色分析T淋巴细胞细胞周期变化。结果:终浓度为25、50μmol/L的bioA对ConA刺激下的T淋巴细胞早期活化抗原CD69表达具有明显的抑制作用(P<0.05),50μmol/L抑制达到峰值;CFDA-SE染色法显示,25、50μmol/L bioA对ConA诱导的T淋巴细胞增殖作用具有显著的抑制作用(P<0.05);终浓度为5、25、50μmol/L的bioA能够使ConA刺激的T淋巴细胞滞留于G0/G1期,减少处于S期和G2/M期细胞数。结论:BioA对小鼠T淋巴细胞的活化增殖和周期具有明显的抑制作用。

关键词：鹰嘴豆芽素A T淋巴细胞早期活化细胞增殖细胞周期

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染料木黄酮与环孢菌素A联合用药对小鼠淋巴细胞体外免疫应答的影响

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暨南大学学报（自然科学与医学版） 2007年第3期28卷 322-326页

作者：叶雪仪曾耀英肇静娴狄静芳贺芳周建国赵令斋暨南大学组织移植与免疫实验中心广东广州510632

研究染料木黄酮(Gen)与环孢菌素A(CsA)联合用药对小鼠体外淋巴细胞增殖、周期及混合淋巴细胞反应的影响,从而为将Gen开发为免疫干预药物以降低CsA的临床用量提供理论依据.以刀豆蛋白A(ConA)诱导小鼠淋巴细胞增殖,通过CFDA-SE染色流式细... 详细信息

研究染料木黄酮(Gen)与环孢菌素A(CsA)联合用药对小鼠体外淋巴细胞增殖、周期及混合淋巴细胞反应的影响,从而为将Gen开发为免疫干预药物以降低CsA的临床用量提供理论依据.以刀豆蛋白A(ConA)诱导小鼠淋巴细胞增殖,通过CFDA-SE染色流式细胞术检测荧光强度的变化,用相关软件分析其增殖指数;以碘化丙锭(PI)染色分析细胞周期的分布情况;MTT法测定体外混合淋巴细胞反应(MLR).结果显示,细胞培养48 h后,ConA诱导下小鼠淋巴细胞与空白对照组相比有明显增殖(P<0.01),5、10μmol/L Gen以及0.02μmol/L CsA均可抑制这种增殖作用,二者联合用药后,这种抑制增殖的作用加强(P<0.01).对细胞周期分析显示,Gen和CsA抑制细胞由G0/G1期向S期转化.MTT法测定的结果显示,二者联合用药后Q值分别为1.82、1.39,对MLR呈协同抑制效应.以上结果表明与单剂量Gen、CsA相比,二者联合使用对ConA诱导的淋巴细胞增殖、细胞周期的阻滞、体外混合淋巴细胞反应的抑制作用更加明显,呈协同效应.

关键词：染料木黄酮环孢菌素A 增殖周期混合淋巴细胞反应

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红车轴草提取物对小鼠T淋巴细胞体外活化与增殖的影响

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暨南大学学报（自然科学与医学版） 2007年第6期28卷 537-540,545页

作者：杨志曾耀英黄秀艳滕菲李林宋兵姚满林暨南大学组织移植与免疫实验中心广东广州510632

目的:探讨红车轴草提取物(Trifoliumpratense Leguminosaeextract,TLE)对小鼠T淋巴细胞的体外活化和增殖的影响。方法:MTT比色法检测TLE对细胞的毒副作用及增殖抑制情况;双色荧光抗体染色结合流式细胞术分析TLE对小鼠T淋巴细胞在多克隆... 详细信息

目的:探讨红车轴草提取物(Trifoliumpratense Leguminosaeextract,TLE)对小鼠T淋巴细胞的体外活化和增殖的影响。方法:MTT比色法检测TLE对细胞的毒副作用及增殖抑制情况;双色荧光抗体染色结合流式细胞术分析TLE对小鼠T淋巴细胞在多克隆刺激剂(ConA)刺激下体外活化抗原CD69表达的影响;羧基荧光素乙酰乙酸(carboxyfluorescein diacetate,succinimidyl ester,CFDA-SE)标记技术结合流式细胞术,分析CD3+T淋巴细胞增殖相关指数。结果:TLE对小鼠淋巴结来源的淋巴细胞微毒副作用;终质量浓度为10、20、30、40 mg/L的TLE对ConA刺激下的T淋巴细胞体外活化抗原CD69表达具有明显的抑制作用(P<0.01),40 mg/L抑制达到峰值;MTT法和CFDA-SE染色法都显示,10、20、30、40 mg/LTLE对ConA诱导的T淋巴细胞增殖具有显著的抑制作用(P<0.01)。结论:TLE对小鼠T淋巴细胞的体外活化和增殖具有明显的抑制作用。

关键词：红车轴草提取物 T淋巴细胞活化增殖

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