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现代免疫学 2008年第5期28卷 353-357页

作者：段小红江逊何贤辉郑德育王晓燕史剑波许庚崔鹏程第四军医大学唐都医院耳鼻咽喉科西安710038 第四军医大学唐都医院小儿科西安710038 暨南大学组织移植与免疫中心广州510632 第四军医大学口腔医学院西安710036 中山大学附属第一医院耳鼻咽喉科广州510080

为检测吲哚胺2,3-双加氧酶(IDO)基因修饰的原代培养软骨细胞对T淋巴细胞的免疫抑制作用。将pEGFP-N1-IDO真核表达载体转染至C57小鼠原代培养的软骨细胞,体外检测IDO修饰的软骨细胞培养液中色氨酸水平的变化;使用CFSE标记技术,检测IDO修... 详细信息

为检测吲哚胺2,3-双加氧酶(IDO)基因修饰的原代培养软骨细胞对T淋巴细胞的免疫抑制作用。将pEGFP-N1-IDO真核表达载体转染至C57小鼠原代培养的软骨细胞,体外检测IDO修饰的软骨细胞培养液中色氨酸水平的变化;使用CFSE标记技术,检测IDO修饰的软骨细胞体外混合淋巴细胞反应中对同种异体T淋巴细胞增殖的影响。结果:pEGFP-N1-IDO成功被导入原代培养的小鼠软骨细胞,荧光显微镜和流式细胞术均检测到EGFP的表达;体外实验表明,原代培养的软骨细胞上清可检测到一定量的色氨酸水平,而转染IDO 24 h后的软骨细胞上清中未检测到色氨酸,提示IDO转染的软骨细胞表达了具有活性IDO;使用CFSE标记技术,检测IDO修饰的软骨细胞体外混合淋巴细胞反应中对同种异体T淋巴细胞增殖的影响,发现IDO基因转染组96 h后总体增殖指数为1.122±0.017,单纯淋巴细胞阴性对照组为1.026±0.016,阳性单纯软骨细胞组为1.201±0.026,较阳性对照组,IDO基因组同种异体T淋巴细胞增殖得到明显抑制。IDO基因修饰的软骨细胞可以抑制T淋巴细胞的增殖。

关键词：基因转染基因表达软骨细胞吲哚胺2,3-双加氧酶混合淋巴细胞反应

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血卟啉单甲醚光动力学疗法对小鼠接触性超敏反应的抑制效应

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中国激光医学杂志 2008年第1期17卷 13-17,73页

作者：邱海霞刘红梅顾瑛李德生曾耀英何贤辉刘丽红中国人民解放军总医院激光医学科北京市100853 军事医学科学院附属医院神经外科暨南大学生命科学院组织移植与免疫中心

目的探讨血卟啉单甲醚光动力学疗法(hematoporphyrin monomethyl ether mediated photodynamic therapy,HMME-PDT)对小鼠接触性超敏反应(contacthypersensitivity,CHS)的影响。方法雌性BALB/c小鼠按功率密度分为50和100mW/cm2两个实验组,同时设置单纯照光组、单纯光敏剂组、空白对照组以及DNFB组。PDT处理后3d,各实验组分别以2,4-二硝基氟苯(DNFB)诱发小鼠右耳变应性接触性皮炎,以游标卡尺测量发敏前后右耳的厚度差;对于功率密度为50mW/cm2组,进一步观察了PDT处理前4d或PDT处理后1、3和12d,DNFB发敏前后小鼠右耳的厚度差,并对PDT后3d组行组织学检查,以目镜网格测微尺计算浸润炎症细胞数量。结果处理前4d预先以DNFB致敏,PDT对CHS无抑制作用(P>0.05)。反之,PDT照射后1、3或12d再以DNFB致敏,则PDT能对CHS产生显著抑制作用(P<0.01),其抑制率分别为58%,63%,47%。且无论是以50mW/cm2还是以100mW/cm2功率密度的激光照射,这种抑制作用均存在。未经任何干预,DNFB致敏组致敏右耳浸润的单核细胞和中性粒细胞的数量增加,而经PDT处理后,浸润的炎性细胞明显减少,二者之间存在显著性差异(P<0.01)。结论HMME-PDT能对正常小鼠接触性超敏反应产生明显抑制作用,并有短暂持续效应。

关键词：光动力学疗法血卟啉单甲醚接触性超敏反应

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激光对细胞内反应氧、钙离子浓度及细胞膜完整性的影响

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解剖学报 2007年第3期38卷 330-333页

作者：季煜华曾耀英钱中清暨南大学组织移植与免疫中心广州510632

目的探讨在激光扫描共焦显微镜(LSCM)观测活细胞的过程中,激光对细胞内反应氧(ROS)、细胞内钙离子浓度([Ca2+]i)和细胞膜完整性的影响。方法用H2DCFDA、Fluo-4AM和Calcein-AM/PI分别检测488nm激光对脐静脉内皮细胞株(ECV-304)细胞内ROS... 详细信息

目的探讨在激光扫描共焦显微镜(LSCM)观测活细胞的过程中,激光对细胞内反应氧(ROS)、细胞内钙离子浓度([Ca2+]i)和细胞膜完整性的影响。方法用H2DCFDA、Fluo-4AM和Calcein-AM/PI分别检测488nm激光对脐静脉内皮细胞株(ECV-304)细胞内ROS、[Ca2+]i和细胞膜完整性的影响,Ultra view LCI(live cell image)共聚焦成像系统采集并分析结果。结果激光照射后细胞内DCF的荧光强度迅速上升,约80s达到峰值,随后下降并逐渐回到基础水平;Fluo-4的荧光强度在70min内持续平缓地上升;Calcein的荧光强度明显下降,少量细胞PI阳性染色。结论488nm激光照射可引起细胞内ROS和[Ca2+]i的增加,但对细胞膜的完整性没有显著影响。

关键词：激光反应氧细胞内钙离子浓度细胞活性激光扫描共焦显微镜脐静脉内皮细胞株

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种间胚胎植入对母体免疫系统T细胞比例的影响

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激光生物学报 2008年第4期17卷 440-445页

作者：王希朝曾耀英华南师范大学激光生命科学研究所暨激光生命科学教育部重点实验室广东广州510631 暨南大学组织移植与免疫研究所广东广州510632

目的:研究种间胚胎植入期母体外周血、外周免疫器官(淋巴结、脾脏)、中枢免疫器官(胸腺、骨髓)中总T细胞的百分比变化,并探讨这种变化对种间胚胎植入的影响。方法:利用荧光标记的单克隆抗体染色结合流式细胞术,检测种间、同种胚胎移植... 详细信息

目的:研究种间胚胎植入期母体外周血、外周免疫器官(淋巴结、脾脏)、中枢免疫器官(胸腺、骨髓)中总T细胞的百分比变化,并探讨这种变化对种间胚胎植入的影响。方法:利用荧光标记的单克隆抗体染色结合流式细胞术,检测种间、同种胚胎移植以及同期假孕母体外周血、淋巴结、脾脏、胸腺、骨髓中T淋巴细胞的百分率。结果:种间胚胎植入时其外周血T细胞计数极显著低于同种和同期假孕小鼠(P<0.01),而淋巴结、胸腺、骨髓中的T细胞计数则极显著高于同期假孕小鼠(P<0.01)。脾脏中同种胚胎植入母体则极显著高于种间和同期假孕小鼠(P<0.01),两后者之间无显著性差异(P>0.05)。结论:种间妊娠时早在植入期开始,母体全身免疫系统就开始发生不利于种间妊娠的反应。

关键词：大鼠小鼠胚胎植入总T细胞计数流式细胞术

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桑色素对小鼠T淋巴细胞体外活化、增殖和细胞周期的影响

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细胞与分子免疫学杂志 2007年第3期23卷 197-200页

作者：臧宁曾耀英黄秀艳王通叶雪仪周建国王会营暨南大学组织移植与免疫中心广东广州510632

目的:研究桑色素(morin)对小鼠T淋巴细胞活化、增殖和细胞周期的影响。方法:以刀豆蛋白A(ConA)刺激培养的淋巴结来源的小鼠淋巴细胞,再以不同终浓度的morin与T细胞共培养,利用流式细胞术(FCM),检测早期T细胞活化的标志CD69分子的表达,... 详细信息

目的:研究桑色素(morin)对小鼠T淋巴细胞活化、增殖和细胞周期的影响。方法:以刀豆蛋白A(ConA)刺激培养的淋巴结来源的小鼠淋巴细胞,再以不同终浓度的morin与T细胞共培养,利用流式细胞术(FCM),检测早期T细胞活化的标志CD69分子的表达,以羧基荧光素双醋酸盐琥珀酰脂(CFDA-SE)染色检测T细胞的增殖;以碘化丙锭(PI)染色分析T细胞的细胞周期。结果:小鼠T细胞培养6 h后,未经ConA刺激的对照组中CD69+T的细胞比率为(2.97±0.12)%,经ConA刺激的CD69+T细胞的比率明显增高,达到(72.52±0.66)%,与对照组相比差别明显(P<0.01)。终浓度为25、50、100μmol/L的morin均下调CD69+T细胞的比率,其中,100μmol/L的morin抑制作用最强,为(48.95±0.81)%,与对照组比较具有统计学意义(P<0.01)。CFDA-SE染色分析显示,ConA组培养48 h和72 h的T细胞的增殖指数(PI)分别为(1.58±0.04)和(1.95±0.02),各浓度的morin对ConA刺激的T细胞增殖,具有明显地抑制作用,以100μmol/L的morin抑制作用最明显。培养48 h的ConA组T细胞的PI为(1.02±0.02)、培养72 h的ConA组T细胞的PI为(1.03±0.01),与相应时间的对照组比较,均有统计学意义(P<0.01)。PI染色后流式细胞术分析的结果表明,ConA组处于S期的T细胞的比率为(27.05±0.39)%,显著高于对照组的比率(5.10±0.07)%。morin组中S期的细胞比率较高。结论:Morin可显著抑制ConA刺激的T细胞活化及增殖;其对增殖的抑制作用主要表现为S期的细胞的阻滞。

关键词：桑色素 T细胞活化增殖细胞周期

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三七提取物对小鼠淋巴细胞活化、增殖和腹腔巨噬细胞产生NO的影响

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中华微生物学和免疫学杂志 2007年第6期27卷 499-503页

作者：周建国曾耀英黄秀艳肇静娴叶雪仪臧宁钱中清何贤辉暨南大学组织移植与免疫研究中心广州510632

目的分析三七提取物(SE)对小鼠淋巴细胞体外活化、增殖以及对巨噬细胞产生NO的影响,探讨其免疫抑制作用的机制。方法以多克隆刺激剂刀豆蛋白A(Con A)刺激淋巴细胞活化和增殖,利用荧光标记的单克隆抗体双染技术和流式细胞术检测SE对小鼠C... 详细信息

目的分析三七提取物(SE)对小鼠淋巴细胞体外活化、增殖以及对巨噬细胞产生NO的影响,探讨其免疫抑制作用的机制。方法以多克隆刺激剂刀豆蛋白A(Con A)刺激淋巴细胞活化和增殖,利用荧光标记的单克隆抗体双染技术和流式细胞术检测SE对小鼠CD3^+ T细胞CD69表达的影响;通过CPSE染色流式细胞术检测SE对淋巴细胞增殖的影响;用脂多糖(LPS)或淋巴细胞培养上清液(lymphocytes culture supernate,LCS)体外诱导小鼠腹腔巨噬细胞分泌NO,采用Griess试剂盒检测NO的水平。结果在Con A刺激6 h后小鼠T细胞活化率为59.79%,50、100μg/ml的SE可显著降低其活化率,分别为46.50%和37.73%(P<0.01)。在培养72 h后,不同浓度SE能明显抑制Con A诱导T细胞的增殖。SE在12.5～100μg/ml的浓度范围内对淋巴细胞培养上清和LPS诱导小鼠腹腔巨噬细胞NO的释放具有抑制作用(P<0.01)。结论三七提取物对小鼠淋巴细胞的活化、增殖有明显抑制作用,并能抑制巨噬细胞产生NO(P<0.01)。

关键词：三七提取物淋巴细胞活化巨噬细胞 NO

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体外培养人鼻中隔软骨细胞合成硫酸糖胺多糖的检测

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中国组织工程研究与临床康复 2008年第46期12卷 9041-9044页

作者：江逊段小红狄静芳史剑波许庚崔鹏程解放军第四军医大学唐都医院儿科陕西省西安市710038 解放军第四军医大学唐都医院耳鼻咽喉科陕西省西安市710038 暨南大学组织移植与免疫教育部重点实验室广东省广州市510632 中山大学附属第一医院耳鼻咽喉科广东省广州市510080

背景:软骨细胞的培养及稳定传代是转基因、构建组织工程化软骨组织及异体移植的前提条件。目的:定量检测体外培养人鼻中隔软骨细胞合成分泌硫酸糖胺多糖的变化情况,评价其对不同代次软骨细胞生物学功能活性。设计、时间及地点:对比观察... 详细信息

背景:软骨细胞的培养及稳定传代是转基因、构建组织工程化软骨组织及异体移植的前提条件。目的:定量检测体外培养人鼻中隔软骨细胞合成分泌硫酸糖胺多糖的变化情况,评价其对不同代次软骨细胞生物学功能活性。设计、时间及地点:对比观察的细胞学实验,于2004-01/2005-07在暨南大学组织移植与免疫教育部重点实验室完成。材料:人鼻中隔软骨细胞来自鼻中隔偏曲患者手术切除的软骨组织,患者对实验内容知情同意。方法:胶原酶消化分离原代人鼻中隔软骨细胞传代培养至第7代。主要观察指标:阿尔新蓝比色法测定各代细胞外基质的硫酸糖胺多糖含量,光镜观察甲苯胺蓝染色后细胞形态。结果:原代软骨细胞具有最高的硫酸糖胺多糖分泌活性,至第4代则出现了非常明显的下降,第4代以后很低下。甲苯胺蓝染色显示原代细胞对甲苯胺蓝呈明显的蓝色异染反应,第3代异染反应明显减弱,第4代以后异染反应微弱,其结果与硫酸糖胺多糖含量变化相一致。结论:人鼻中隔软骨细胞在体外培养过程中,随传代次数的增加而功能活性逐渐降低,第3代以后的细胞不适于作为人软骨组织工程种子细胞和用于细胞生物学等方面研究。

关键词：葡萄糖氨基浆糖类软骨细胞细胞外基质生物材料

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鹰嘴豆芽素A抗HIV-1活性及抑制CD4^+淋巴细胞早期活化作用

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中国药理学通报 2007年第2期23卷 214-218页

作者：林长乐曾耀英曾祥凤赵令斋王通李海仙李莉平暨南大学组织移植与免疫实验中心广东广州510630

目的研究鹰嘴豆芽素A(biochanin A,BioA)对HIV-1活性及CD4+淋巴细胞早期活化作用的影响。方法①以MT-2和H9/HIV-1ⅢB细胞或HIV-1病毒共培养建立HIV-1感染模型,以不同浓度的BioA干预该过程,观察细胞融合情况和测定培养上清中的p24抗原含... 详细信息

目的研究鹰嘴豆芽素A(biochanin A,BioA)对HIV-1活性及CD4+淋巴细胞早期活化作用的影响。方法①以MT-2和H9/HIV-1ⅢB细胞或HIV-1病毒共培养建立HIV-1感染模型,以不同浓度的BioA干预该过程,观察细胞融合情况和测定培养上清中的p24抗原含量变化,以评价BioA的抗HIV-1活性。②以PHA刺激剂诱导人外周血CD4+淋巴细胞活化,利用流式细胞术检测不同浓度BioA对早期活化标志CD69分子的表达影响。结果①BioA在本实验所设浓度下均能减少由HIV-1介导的细胞融合数(EC50=5.1μmol.L-1,SI=39)及p24抗原的表达量(EC50=38μmol.L-1,SI=5.2)。②终浓度5、10、25、50μmol.L-1的BioA对CD4+淋巴细胞早期活化抗原CD69表达具有明显抑制作用(P<0.01),其中50μmol.L-1达到最大抑制率,能使活化率从(60.42±0.52)%降低到(19.70±0.38)%。结论BioA具有抗HIV-1介导的细胞融合和HIV-1复制的活性及抑制CD4+淋巴细胞早期活化作用。

关键词： biochanin A HIV-1 细胞融合 p24抗原早期活化

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白杨素对HIV-1感染、复制和CD4^+ T细胞活化的抑制作用研究

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中国免疫学杂志 2007年第2期23卷 99-102,107页

作者：赵令斋曾耀英曾祥凤林长乐李海仙黄秀艳王通暨南大学组织移植与免疫中心广州510632

目的:研究白杨素(CR)体外对人类免疫缺陷病毒(HIV-1)感染和复制的影响及对植物血凝素(PHA)刺激的正常人外周血CD4+T细胞活化的影响。方法:以CR对Calcein-AM标记的慢性感染HIV-1ⅢB的H9细胞(H9/HIV-1ⅢB)和MT-2细胞的融合、对HIV-1诱导的... 详细信息

目的:研究白杨素(CR)体外对人类免疫缺陷病毒(HIV-1)感染和复制的影响及对植物血凝素(PHA)刺激的正常人外周血CD4+T细胞活化的影响。方法:以CR对Calcein-AM标记的慢性感染HIV-1ⅢB的H9细胞(H9/HIV-1ⅢB)和MT-2细胞的融合、对HIV-1诱导的MT-2细胞形成合胞体及对感染HIV-1的MT-2细胞产生p24抗原的影响,探讨其抗HIV-1活性;以PHA刺激人外周血单个核细胞,利用流式细胞术,检测CD4+T细胞CD69表达的百分率,分析CR对免疫活化的影响。结果:CR抑制H9/HIV-1ⅢB细胞与MT-2细胞融合、HIV-1诱导的MT-2细胞形成合胞体和P24抗原产生的选择指数分别为7.24±0.43、6.74±0.47和8.16±0.30;CR降低PHA刺激的CD4+T细胞CD69的表达。结论:CR体外对HIV-1的感染和复制有一定的抑制作用,且可抑制抗原刺激的CD4+T细胞的活化。

关键词：白杨素 HIV-1 细胞融合慢性免疫活化流式细胞术

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人类免疫缺陷病毒-1 nef诱导凋亡及下调人类白细胞抗原-I类分子

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中山大学学报（医学科学版） 2007年第3期28卷 250-253页

作者：黄官友黄秀艳曾耀英曾祥凤吴晓萍暨南大学组织移植与免疫中心广东广州510632

【目的】研究人类免疫缺陷病毒(HIV)-1 nef调节细胞表面的人类白细胞抗原(HLA)-I类分子及诱导细胞凋亡情况。【方法】将293T细胞分为两组,用脂质体法将含HIV-1 nef基因的质粒及空载体分别转染细胞,Western blot检测HIV-1 nef在转染细胞... 详细信息

【目的】研究人类免疫缺陷病毒(HIV)-1 nef调节细胞表面的人类白细胞抗原(HLA)-I类分子及诱导细胞凋亡情况。【方法】将293T细胞分为两组,用脂质体法将含HIV-1 nef基因的质粒及空载体分别转染细胞,Western blot检测HIV-1 nef在转染细胞中的表达,荧光抗体染色结合流式细胞术检测细胞表面的HLA-I类分子表达及细胞凋亡情况。【结果】HIV-1 nef在转染细胞中有表达。转染HIV-1 nef的细胞与转染空载体的细胞经抗HLA-A,B,C-FITC染色后,平均荧光强度分别为205±22及269±15,两者相比有显著性差异(P<0.01);经Annexin V-APC/PI染色后,阳性细胞百分率分别为(60.82±8.32)%及(8.12±5.43)%,两者相比亦有显著性差异(P<0.01)。【结论】HIV-1 nef下调细胞表面的HLA-I类分子及诱导细胞凋亡。

关键词：人类免疫缺陷病毒-1 nef 人类白细胞抗原-Ⅰ类分子凋亡转染

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