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第六届“全国石斑鱼类繁育与养殖产业化”论坛

作者：佘晴晴王晴晴郭银李高飞姚谧刘晓春林浩然有害生物控制与资源利用国家重点实验室中山大学生命科学大学院水生经济动物研究所广东省水生经济动物良种繁育重点实验室广州 510275

促性腺激素释放激素(gonadotropin releasing hormone,GnRH)是由下丘脑合成和分泌的十肽激素,是动物生殖过程中的重要激素之一,是下丘脑-垂体-性腺生殖轴(hypothalamus pituitary gonadal axis,HPG)的关键信号分子,它与脑垂体促性腺激... 详细信息

促性腺激素释放激素(gonadotropin releasing hormone,GnRH)是由下丘脑合成和分泌的十肽激素,是动物生殖过程中的重要激素之一,是下丘脑-垂体-性腺生殖轴(hypothalamus pituitary gonadal axis,HPG)的关键信号分子,它与脑垂体促性腺激素分泌细胞上的促性腺激素释放激素受体(gonadotropin releasing hormone receptor,GnRH-R)结合后,刺激促性腺激素(gonadotropin,GtH)的合成和分泌,在脊椎动物的性腺发育、性成熟和繁殖功能的维持中起着至关重要的调节作用。在硬骨鱼的进化中,随着基因组的复制,GnRH及其内源性的受体的种类和数量都有所增加,在鲈形目的斜带石斑鱼中,发现了三种GnRH(sbGnRH、cGnRH、sGnRH)和五种GnRHR(ecGnRHR-1A、ecGnRHR-1B、ecGnRHR-2A、ecGnRHR-2B、ecGnRHR-2C),并且已经克隆得到了这三种GnRH基因和五种GnRHR基因ORF(open reading frame)全长,为了进一步的阐明GnRH/GnRH-R在斜带石斑鱼这种雌雄同体,先雌后雄的鲈形目鱼类中对生殖调控的作用以及GnRH基因启动的下游信号及细胞内信号变化情况,本论文以斜带石斑鱼为对象,通过用COS-7细胞系进行转染试验研究了斜带石斑鱼两种GnRHR(ecGnRHR-1B、ecGnRHR-2A)和三种GnRH的结合特性。

关键词：斜带石斑鱼 GnRH GnRHR 结合特性

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养殖密度、水质和分级对水泥池鱖鱼苗种培育的影响

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广东农业科学 2015年第16期42卷 84-88页

作者：古勇明卢薛胥鹏曾爽周磊曾雷李朝兵佛山市百容水产良种有限公司广东佛山528216 有害生物控制与资源利用国家重点实验室/水生经济动物研究所/广东省水生经济动物良种繁育重点实验室/中山大学生命科学学院广东广州510275

为研究养殖密度、水质和分级对水泥池鳜苗种培育的影响，以翘嘴鳜鱼苗（体长0．7～1cm）为对象，在不同密度下投喂麦瑞加拉鲮进行试验。结果表明：（1）小规格苗种（〈2．5cm）的放养密度宜在4000尾／m^3左右，大规格苗种（2．5～6．5c... 详细信息

为研究养殖密度、水质和分级对水泥池鳜苗种培育的影响，以翘嘴鳜鱼苗（体长0．7～1cm）为对象，在不同密度下投喂麦瑞加拉鲮进行试验。结果表明：（1）小规格苗种（〈2．5cm）的放养密度宜在4000尾／m^3左右，大规格苗种（2．5～6．5cm）的放养密度不宜超过800尾／m^3。（2）养殖水体中氨氮和亚硝酸盐的浓度均与鳜鱼苗养殖密度成显著正相关，水泥池中进行鳜鱼苗种培育不宜密度过高，密度越高，疾病暴发的风险越大。（3）分级过筛选取鳜苗体长为2～3、5-6、8-9cm时的3个节点进行，保持饱食投喂，能较好地提高鳜鱼苗种的整齐度，降低残食率，提高成活率。

关键词：翘嘴鳜苗种培育养殖密度水质分级

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两种杂交石斑鱼及其亲本的形态差异分析

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水产学报 2014年第6期38卷 778-785页

作者：王燕张勇张海发黄文肖玲李水生杨宇晴林浩然中山大学水生经济动物研究所暨广东省水生经济动物良种繁育重点实验室广东省海洋渔业试验中心

为研究两种杂交石斑鱼及其亲本的形态差异,实验采用传统形态学测定与现代框架测定结合的方法,测定了青龙斑(斜带石斑鱼♀×鞍带石斑鱼♂)和虎龙斑(棕点石斑鱼♀×鞍带石斑鱼♂)及其亲本的可数性状和可量性状,并进行相关统计分... 详细信息

为研究两种杂交石斑鱼及其亲本的形态差异,实验采用传统形态学测定与现代框架测定结合的方法,测定了青龙斑(斜带石斑鱼♀×鞍带石斑鱼♂)和虎龙斑(棕点石斑鱼♀×鞍带石斑鱼♂)及其亲本的可数性状和可量性状,并进行相关统计分析。结果显示,在外观方面,青龙斑与亲本相比,其斜带边缘清晰连贯,而虎龙斑体侧分布有不同于亲本的大型环状斑;在外部形态框架方面,青龙斑背鳍前端及躯干形态都偏向于母本,呈现出背腹部压缩的细长型,而虎龙斑背鳍前端的框架形态偏向于母本、躯干的框架形态却偏向于父本,呈现出两种框架形态组合的特点。综合传统可量数据和框架数据聚类分析、判别分析和主成分分析的结果表明:两种杂交石斑鱼在外部形态方面更偏向于母本。

关键词：杂交石斑鱼亲本形态差异可数性状分析可量性状分析

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中国南方沿海13种石斑鱼类的分子系统进化关系分析

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中山大学学报（自然科学版） 2014年第4期53卷 123-130页

作者：陈兴汉郭梁李明明蒙子宁林浩然阳江职业技术学院生命科学与技术系广东阳江529566 中山大学水生经济动物研究所暨广东省水生经济动物良种繁育重点实验室广东广州510275

石斑鱼类(Groupers)是世界性海洋经济鱼类,也是中国南方沿海省份重要的海水增养殖对象,其种类繁多,由于缺乏明显的种间外部形态区别特征,石斑鱼的分类一直是鱼类系统分类学的一个难题,存在着较多的争议和混淆。为了从分子水平揭示石斑... 详细信息

石斑鱼类(Groupers)是世界性海洋经济鱼类,也是中国南方沿海省份重要的海水增养殖对象,其种类繁多,由于缺乏明显的种间外部形态区别特征,石斑鱼的分类一直是鱼类系统分类学的一个难题,存在着较多的争议和混淆。为了从分子水平揭示石斑鱼类的系统进化关系,应用线粒体细胞色素b基因(Cyt b)及两个核糖体RNA基因(16S和12S)序列联合构建系统进化树对中国近海石斑鱼亚科3属13种进行种类鉴定及亲缘关系分析,探讨了石斑鱼类的分子系统进化。结果表明:①线粒体基因序列在石斑鱼类种间存在较大的变异,种内变异极小,是进行石斑鱼类种类鉴定较为适宜的分子标记;②所研究的3属13种石斑鱼类中,石斑鱼属与九棘鲈属的亲缘关系较近,与鳃棘鲈属的较远;③赤点石斑鱼和青石斑鱼、蜂巢石斑鱼与鲑点石斑鱼、斜带石斑鱼与棕斑石斑鱼两两间具有较近的亲缘关系。

关键词：石斑鱼类 Cyt b 16S rRNA 12S rRNA 分子系统进化

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广东沿海3个斜带石斑鱼养殖群体的RAPD和线粒体Cyt b基因序列变异分析

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南方水产科学 2014年第4期10卷 27-33页

斜带石斑鱼（Epinephelus coioides）为中国南方重要的海水增养殖经济鱼类,但过度捕捞和人工养殖的快速扩张导致了其自然资源衰退和遗传多样性降低。文章采用随机扩增多态DNA（RAPD）和线粒体细胞色素b（Cyt b）基因序列分析方法,对惠... 详细信息

斜带石斑鱼（Epinephelus coioides）为中国南方重要的海水增养殖经济鱼类,但过度捕捞和人工养殖的快速扩张导致了其自然资源衰退和遗传多样性降低。文章采用随机扩增多态DNA（RAPD）和线粒体细胞色素b（Cyt b）基因序列分析方法,对惠州、深圳和湛江3个斜带石斑鱼养殖群体进行了遗传多样性状况和遗传差异的研究。结果表明：1）相比较于线粒体Cyt b基因序列分析,RAPD技术在研究斜带石斑鱼种内遗传变异方面具有更高的灵敏性和多态性;2）相比较于其他已经报道的石斑鱼类,斜带石斑鱼的遗传多样性较低,RAPD检测到的多态位点百分率（P）为40.57%,究其原因,可能是受过度捕捞和人工养殖的影响;3）RAPD检测到的群体间遗传相似度（Ⅰ）高达0.967 1～0.980 8,而Cyt b的核苷酸多样性仅为0.003 8;斜带石斑鱼养殖群体间的遗传差异显然很小,具有相似的遗传背景。文章还探讨了斜带石斑鱼线粒体Cyt b基因的特点,并针对目前斜带石斑鱼的养殖现状提出了相应保护遗传多样性的对策与建议。

关键词：斜带石斑鱼 RAPD 线粒体Cyt b 遗传变异

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激素诱导斜带石斑鱼(Epinephelus coioides)雄性化的研究

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海洋与湖沼 2014年第6期45卷 1317-1323页

作者：黄文杨宪宽徐新肖玲李水生赵会宏张海发张勇林浩然中山大学水生经济动物研究所暨广东省水生经济动物良种繁育重点实验室广州510275 华南农业大学动物科学学院广州510642 广东省海洋渔业试验中心惠州516081 海南大学海洋学院海口570228

石斑鱼属雌雄同体雌性先成熟鱼类,低龄鱼卵巢先成熟,表现为雌性,高龄鱼才性转变为雄性。本实验通过持续跟踪取样,分析了人工养殖条件下斜带石斑鱼(Epinephelus coioides)在36月龄内的性腺发育过程,发现其性分化完成后,雌性卵巢在9月龄... 详细信息

石斑鱼属雌雄同体雌性先成熟鱼类,低龄鱼卵巢先成熟,表现为雌性,高龄鱼才性转变为雄性。本实验通过持续跟踪取样,分析了人工养殖条件下斜带石斑鱼(Epinephelus coioides)在36月龄内的性腺发育过程,发现其性分化完成后,雌性卵巢在9月龄后开始发育。因此,采取投喂含有雄激素甲基睾酮(MT)饲料的方法,可以在石斑鱼卵巢发育之前,成功诱导8月龄的斜带石斑鱼幼鱼向雄性方向发育。结果表明,以MT 10mg/kg饲料的剂量投喂3个月能够有效诱导卵巢未发育的幼鱼往雄性方向发育;但停止投喂MT后,幼鱼精巢又开始出现退化,不会继续往雄性方向发展,而转变为雌性。以上结果表明,斜带石斑鱼性别决定和分化除了受遗传因子和内分泌调控外,还受到年龄、体型和群体、环境等因子的影响,人工投喂MT激素的作用并不能从根本上影响石斑鱼幼鱼的性腺发育的方向,只有在持续剂量的MT激素诱导下,石斑鱼幼鱼才能发育为成熟的雄鱼。

关键词：斜带石斑鱼甲基睾酮性别分化性腺发育

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LHRH-A、DA对施氏鲟脑垂体碎片释放GtH的影响

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水产学报 2014年第3期38卷 378-384页

作者：胡红霞张勇朱华李立成姚志刚北京市水产科学研究所暨国家淡水渔业工程技术研究中心(北京) 农业部都市农业(北方)重点实验室中山大学有害生物控制与资源利用国家重点实验室中山大学水生经济动物研究所暨广东省水生经济动物良种繁育重点实验室

为了探讨在古老的软骨硬鳞鱼中促性腺激素(GtH)的双重内分泌调节作用,本实验设计用离体灌流的方法研究促黄体素释放激素类似物(LHRH-A)和多巴胺(DA)对施氏鲟脑垂体碎片分泌GtH的影响。引入10、100和1 000 nmol/L 3个浓度的LHRH-A对施氏... 详细信息

为了探讨在古老的软骨硬鳞鱼中促性腺激素(GtH)的双重内分泌调节作用,本实验设计用离体灌流的方法研究促黄体素释放激素类似物(LHRH-A)和多巴胺(DA)对施氏鲟脑垂体碎片分泌GtH的影响。引入10、100和1 000 nmol/L 3个浓度的LHRH-A对施氏鲟脑垂体碎片3次脉冲式刺激实验;每次间隔1 h,持续5 min,研究不同剂量LHRH-A对鲟鱼脑垂体释放GtH的作用;用200 nmol/L DA对施氏鲟脑垂体碎片持续2 h灌流后引入5 min的1 000nmol/L LHRH-A刺激实验,研究DA如何抑制鲟鱼脑垂体释放GtH。每5 min收集一管灌流液,用放射免疫测定法(RIA)检测灌流液中GtH的含量。结果显示,低剂量LHRH-A随着刺激引入脑垂体释放GtH出现波浪式的增加,中、高剂量出现释放延后现象。LHRH-A在10nmol/L到1 000 nmol/L范围内对刺激脑垂体释放GtH没有剂量依存关系。DA对施氏鲟脑垂体碎片GtH的分泌没有显著影响,但是可以抑制LHRH-A引起的GtH分泌,即DA不能抑制施氏鲟GtH的基础分泌,而只能抑制LHRH-A诱导的GtH分泌。研究结果证明,在高等硬骨鱼类中存在的双重神经内分泌调节在古老的鲟鱼中也存在。

关键词：施氏鲟脑垂体促黄体素释放激素类似物多巴胺促性腺激素离体灌流

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急性操作胁迫对刀鲚应激反应相关神经内分泌因子的影响

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水产学报 2014年第6期38卷 803-812页

作者：王宇卢丹琪李伟萍徐跑顾若波姚谧梁瑶思张勇林浩然海南大学海洋学院中国水产科学研究院淡水渔业研究中心农业部淡水渔业和种质资源利用重点实验室中山大学生命科学学院水生经济动物研究所暨广东省水生经济动物良种繁育重点实验室

为深入了解刀鲚应激反应中相关神经内分泌因子作用的分子机理,采用手工捕捉的方式对刀鲚进行了急性操作胁迫。通过放射免疫法和化学发光法测定刀鲚应激反应后头肾和血浆皮质醇含量的变化,结果显示,刀鲚胁迫刺激后血浆皮质醇含量极显著... 详细信息

为深入了解刀鲚应激反应中相关神经内分泌因子作用的分子机理,采用手工捕捉的方式对刀鲚进行了急性操作胁迫。通过放射免疫法和化学发光法测定刀鲚应激反应后头肾和血浆皮质醇含量的变化,结果显示,刀鲚胁迫刺激后血浆皮质醇含量极显著性升高,血浆皮质醇浓度平均升高56.48%,头肾皮质醇含量显著性升高,头肾皮质醇浓度平均升高49.68%,表明急性操作胁迫确实引起刀鲚的应激反应。通过同源克隆的方法获得刀鲚促肾上腺皮质激素释放激素(CRH)、硬骨鱼紧张肽(UI)、阿黑皮素原(POMC)基因的部分序列,并应用实时荧光定量PCR(RT-qPCR)方法检测上述神经内分泌因子mRNA的表达变化,结果显示,CRH基因的表达水平极显著性下降,POMC基因的表达水平显著性下降,UI基因的表达水平有下降趋势但不显著。上述结果显示,皮质醇、CRH、UI和POMC等神经内分泌因子通过鱼类下丘脑—脑垂体—肾间腺轴参与刀鲚应激反应的调节,为进一步了解刀鲚胁迫应答的作用机理,实现对其有效调控打下基础。

关键词：刀鲚应激反应促肾上腺皮质激素释放激素(CRH) 硬骨鱼紧张肽(UI) 阿黑皮素原(POMC) 皮质醇

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雌激素对斜带石斑鱼GnIH基因转录调节的分子机制研究

雌激素对斜带石斑鱼GnIH基因转录调节的分子机制研究

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第五届“全国石斑鱼类繁育与养殖产业化”论坛

作者：王晴晴郭银刘晓春林浩然中山大学生命科学大学院水生经济动物研究所广东省水生经济动物良种繁育重点实验室广州510275

目前,在鱼类生殖轴(下丘脑-垂体-性腺)上检测到高表达的雌激素受体信号,表明了雌激素受体介导的雌激素效应调控着整个生殖活动的上下游.但是对于调控GnIH神经元的潜在机制知道的很少.在本研究中,克隆得到斜带石斑鱼(Epinephelus coioide... 详细信息

目前,在鱼类生殖轴(下丘脑-垂体-性腺)上检测到高表达的雌激素受体信号,表明了雌激素受体介导的雌激素效应调控着整个生殖活动的上下游.但是对于调控GnIH神经元的潜在机制知道的很少.在本研究中,克隆得到斜带石斑鱼(Epinephelus coioides)GnIH基因的5'侧翼序列,其中包括转录起始位点上游片段1573bp及第一外显子片段25bp.并通过在线软件分析GnIH基因启动子上的转录因子结合位点.斜带石斑鱼的GnIH启动子序列拥有2个1/2雌激素反应元件(estrogen responsive element (ERE) half-sites,1/2ERE),2个cAMP反应元件(cAMP-responsive element,CRE),1个雌激素受体特异蛋白-1结合位点(ER/specificity protein-1 binding site,Spl),1个与ERE元件共同序列(5'GGTCAnnnTCACC3')相差仅两个碱基的ERE-like元件(ERE-like sequence),序列为5'CGTCAGGTGACG3'.用构建好的斜带石斑鱼GnIH基因启动子的重组质粒GnIH-1573,本文研究了斜带石斑鱼GnIH的启动子在HEK 293T细胞系中的活性.将GnIH启动子重组载体和斜带石斑鱼pcDNA-ERαt或pcDNA-ERβ2共转染至HEK 293T细胞系中,结果表明,10-7M的雌激素处理共转染pcDNA-ERβ2能够使得GnIH启动子活性显著降低,而10-7M的雌激素处理共转染pcDNA-ERα的细胞不能影响GnIH启动子的活性.表明,当ERα存在与否时,E2均不能够激活GnIH启动子的活性.当ERβ2存在时,E2能够激活GnIH启动子的活性,而当缺失ERβ2时,则刺激作用消失.进一步了解雌激素对于GnIH基因启动子活性的调节作用,我们用不同浓度的雌激素(10-10 M-10-7M)进行处理.结果表明,不同浓度雌激素处理共转染pcDNA-ERα的细胞不能影响GnIH启动子的活性.不同浓度雌激素处理共转染pcDNA-ERβ2的细胞均能够使得GnIH启动子活性显著降低,且浓度越大,GnIH启动子活性降低的幅度越大.表明,雌激素可以通过ERβ2介导抑制斜带石斑鱼GnIH基因启动子活性.鉴定启动子上哪些区域参与了由ERβ2介导的雌激素对斜带石斑鱼GnIH基因的转录调节,我们构建了GnIH基因5'端长度逐渐缺失的启动子报告基因重组载体,对GnIH基因启动子的结构进行分析.研究结果显示,随着启动子片段的不断删除,GnIH基因启动子的基本活性并无显著性变化.当GnIH基因启动子片段递减至起始位点5'上游-235bp时雌激素对启动子的活性仍有显著性降低趋势,但是当GnIH基因启动子片段递减至起始位点5'上游-93bp时,雌激素对启动子活性没有抑制作用.在5'上游235bp到-93bp间,必定存在与之相关的雌激素应答元件.在5'上游-235bp到-93bp间,存在着一个CRE元件和一个ERE-like元件.进一步验证ERE-like元件是否为雌激素作用于GnIH的位点,我们对-ll2bp到-101bp的ERE-like元件运用融合PCR技术进行突变,并且构建了突变载体.共转染结果发现,突变使由E2对GnIH启动子活性抑制作用消失.结果表明,E2是通过与ERE-like元件结合实现对GnIH启动子活性的调节.

关键词：雌激素 GnIH 斜带石斑鱼

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孕激素对斜带石斑鱼kiss基因启动子的调控研究

孕激素对斜带石斑鱼kiss基因启动子的调控研究

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第五届“全国石斑鱼类繁育与养殖产业化”论坛

作者：国晨雨董世丽郭银刘晓春林浩然中山大学生命科学大学院水生经济动物研究所广东省水生经济动物良种繁育重点实验室广州510275

孕激素的功能受孕激素核受体(progesterone nucleareceptor nPR)的调控,即孕激素以自由扩散形式通过质膜,并与nPR紧密结合,通过结合靶基因上的激素应答元件(hormone response element HRE),调节基因表达或与其他核蛋白相互作用改变基因... 详细信息

孕激素的功能受孕激素核受体(progesterone nucleareceptor nPR)的调控,即孕激素以自由扩散形式通过质膜,并与nPR紧密结合,通过结合靶基因上的激素应答元件(hormone response element HRE),调节基因表达或与其他核蛋白相互作用改变基因的转录活性,此种功能被称为孕激素的基因组效应(genomic action of progesterone)。根据已知的斜带石斑鱼nPR,mPRp和mPRγ的cDNA序列, 组织分布结果显示：nPR在嗅球及垂体中表达量最高,可能参与孕激素的反馈调节,mPRβ和mPRγ则在鳃中表现出极高的表达量,推测这两个膜受体对斜带石斑鱼的离子和渗透压调节起着重要的作用。通过用两种孕激素17α,20β-双羟孕酮(DHP)和17α,20β,21-三羟孕酮(20β-S)对斜带石斑鱼的卵巢进行离体孵育实验,当用浓度为1-1000nM的20β-S体外处理6小时,1nM的20β-S就能显著性的降低mPRα的表达,而处理时间增至9小时时,100nM或1000nM的20β-S能显著性的上调mPRα的表达。这一结果的产生可能是因为处理6h时消耗了受体,使得mPRα表达量下降,而当处理时间延长至9小时时,高浓度的20β-S使得受体开始重新合成导致mPRα表达量显著上升。在线软件Transcription Element Search Software(TESS)分析发现斜带石斑鱼kissl和kiss2基因上游启动子上分别有2个和7个孕激素受体结合原件。利用已构建好的kissl启动子,kiss2启动子以及PR表达载体,检测kiss1,kiss2启动子在HEK293cell中的转录活性,进而研究三种孕激素(DHP,20β-S和P4)对两种kiss基因启动子转录活性的影响。对卵巢发育处于EV期的斜带石斑鱼鱼腹腔注射DHP(2ug/g bodyweight),24小时后检测下丘脑两种kiss基因的表达变化。结果显示与对照组相比,无论是kissl还是kiss2基因,mRNA表达水平均有显著的上升。而对于切除卵巢的斜带石斑鱼来说,腹腔注射DHP后血清中E2,T和DHP的水平都有明显的下降。通过研究孕激素对斜带石斑鱼两种kiss基因转录调节的分子机制,为阐明鱼类的生殖内分泌调控机制提供重要的参考资料。

关键词：孕激素斜带石斑鱼孕激素受体 kiss基因启动子

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