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中国药理学通报 2018年第8期34卷 1083-1088页

作者：朱瑶丹韩锡萍陈震张鹏马鑫江南大学药学院和医学院江苏无锡214122

目的探究Wnt通路抑制剂XAV939对结肠癌耐药细胞迁移能力的影响。方法 XAV939处理HCT-8/5-Fu细胞,MTT检测HCT-8/WT、HCT-8/5-Fu和HCT-8/5-Fu+XAV939细胞对5-氟尿嘧啶(5-fluorouracil,5-Fu)的敏感性;Transwell和划痕实验检测细胞迁移能力;Western blot检测β-catenin、c-Myc和cyclin D1蛋白的表达水平。结果 MTT、Transwell和划痕实验结果显示,HCT-8/5-Fu细胞对5-Fu的敏感性低于HCT-8/WT细胞,迁移能力高于HCT-8/WT细胞;Western blot结果显示,与HCT-8/WT细胞相比,HCT-8/5-Fu细胞核中β-catenin明显高表达,且c-Myc和cyclin D1也呈现高表达;XAV939处理HCT-8/5-Fu细胞后,其对5-Fu的耐受性和迁移能力均降低,细胞核中β-catenin表达下降,并且c-Myc和cyclin D1的表达也明显减少。结论 Wnt/β-catenin通路可能参与了HCT-8/5-Fu细胞的耐药,其小分子抑制剂XAV939通过影响HCT-8/5-Fu细胞对5-Fu的耐受性,进而影响细胞的迁移能力。

关键词： Wnt/β-catenin通路结肠癌耐药 XAV939 5-氟尿嘧啶迁移

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定点突变提高菜豆环氧水解酶的对映选择性

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化工学报 2018年第10期69卷 4335-4341页

作者：宗迅成胡蝶阚婷婷王婷婷邬敏辰江南大学生物工程学院江苏无锡214122 江南大学无锡医学院江苏无锡214122 江南大学药学院江苏无锡214122

为了提高菜豆环氧水解酶(PvEH1)催化对氯环氧苯乙烷(pCSO)的对映选择性,利用定点突变构建了PvEH1^(W102L)、PvEH1^(P137K)及PvEH1^(I151V)三种突变体,分别研究了突变体全细胞动力学拆分rac-pCSO的催化特性,优化了PvEH1W102L动力学拆分ra... 详细信息

为了提高菜豆环氧水解酶(PvEH1)催化对氯环氧苯乙烷(pCSO)的对映选择性,利用定点突变构建了PvEH1^(W102L)、PvEH1^(P137K)及PvEH1^(I151V)三种突变体,分别研究了突变体全细胞动力学拆分rac-pCSO的催化特性,优化了PvEH1W102L动力学拆分rac-pCSO的初始底物浓度及反应时间,通过分子模拟分析了PvEH1^(W102L)对映选择性提高的机理。结果表明,最优突变体PvEH1^(W102L)的E值为25.5,相对酶活为212.6%,分别是PvEH1的11.6倍与2.1倍;PvEH1^(W102L)动力学拆分150 mmol·L^(-1) rac-pCSO,反应4 h后,可获得(R)-pCSO(产率为45.62%,ees为96.30%)和(R)-对氯苯基乙二醇(产率为50.91%,eep为90.26%)。分子模拟结果分析表明,PvEH1的102位色氨酸(W)突变为亮氨酸(L)降低了酶与(R)-pCSO的结合能力,从而提高了PvEH1^(W102L)对pCSO的对映选择性。

关键词：生物催化定点突变环氧水解酶对氯环氧苯乙烷对氯苯基乙二醇分子模拟

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高盐抑制胸主动脉内皮细胞一氧化氮生成及其机制

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中国药理学通报 2019年第9期35卷 1251-1256页

作者：韩锡萍张鹏于凡冯磊马鑫江南大学药学院江苏无锡214122 江南大学无锡医学院江苏无锡214122

目的探究小鼠胸主动脉内皮细胞高盐模型对一氧化氮(nitric oxide,NO)生成的影响。方法使用瞬时受体电位香草素4(transient receptor potential vanilloid 4,TRPV4)抑制剂HC067047对胸主动脉内皮细胞预孵育后,通过钙离子荧光探针Fluo-4... 详细信息

目的探究小鼠胸主动脉内皮细胞高盐模型对一氧化氮(nitric oxide,NO)生成的影响。方法使用瞬时受体电位香草素4(transient receptor potential vanilloid 4,TRPV4)抑制剂HC067047对胸主动脉内皮细胞预孵育后,通过钙离子荧光探针Fluo-4和NO荧光探针DAF-FM DA进行Ca^2+以及NO标记,研究TRPV4对NO产生的影响。以60 mmol·L^-1高盐刺激胸主动脉内皮细胞,检测Ca^2+内流以及NO的生成情况。结果与对照组相比,抑制TRPV4减少胸主动脉内皮细胞Ca 2+内流及NO的生成;与同渗透压的甘露醇相比,高盐抑制胸主动脉内皮细胞中TRPV4介导的Ca 2+内流及NO的生成。结论高盐状态下,通过抑制TRPV4通道导致Ca^2+内流减少,NO的生成下降。

关键词：内皮细胞高盐 TRPV4 一氧化氮 HC067047 Ca^2+内流

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圣路易斯脑炎病毒NS2B-NS3蛋白酶的原核表达及其抑制剂的筛选

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微生物学报 2019年第4期59卷 668-677页

作者：周婷婷高梦茹杜梦繁于凡冯磊江南大学无锡医学院江苏无锡214122 江南大学药学院江苏无锡214122

【目的】圣路易斯脑炎病毒(St. Louis encephalitis virus,SLEV)属于黄病毒科,是一种单股正链RNA病毒。黄病毒编码的非结构蛋白NS3在病毒复制以及多聚蛋白加工过程中起着重要作用,NS2B是其发挥作用的重要辅助因子。因此,NS2B-NS3蛋白酶... 详细信息

【目的】圣路易斯脑炎病毒(St. Louis encephalitis virus,SLEV)属于黄病毒科,是一种单股正链RNA病毒。黄病毒编码的非结构蛋白NS3在病毒复制以及多聚蛋白加工过程中起着重要作用,NS2B是其发挥作用的重要辅助因子。因此,NS2B-NS3蛋白酶复合物是抗病毒药物的重要靶标。本研究旨在构建SLEV NS2B-NS3蛋白酶的原核表达系统并建立其抑制剂的高通量筛选方法,从而发现其小分子抑制剂。【方法】通过PCR扩增SLEVNS2B-NS3蛋白的编码区,构建原核表达质粒;在大肠杆菌BL21(DE3)中,经异丙基硫代半乳糖苷(Isopropyl β-D-thiogalactoside)诱导得到可溶性的NS2B-NS3蛋白,并用镍亲和层析方法进行纯化;基于荧光共振能量转移(Fluorescence resonance energy transfer)技术检测NS2B-NS3蛋白酶活性,建立其抑制剂的高通量筛选平台。【结果】SLEV NS2B-NS3蛋白酶纯化程度高达95%以上,基于酶活测定的抑制剂筛选平台准确可行。对700多个上市药物进行筛选后,发现原花青素对SLEVNS2B-NS3蛋白酶具有明显的抑制活性。【结论】本研究为SLEVNS2B-NS3蛋白酶抑制剂提供了一种操作方便、高通量的筛选方法,并首次发现了原花青素具有抑制SLEV NS2B-NS3蛋白酶活性的功能,可以作为治疗SLEV感染的潜在靶向药物。

关键词：圣路易斯脑炎病毒 NS2B-NS3蛋白酶丝氨酸蛋白酶活性抑制剂筛选

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金耳发酵液多糖的制备、分析及生物活性研究

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食品与生物技术学报 2017年第1期36卷 67-73页

作者：邓超付海田尚京迎乔祉琦赵楚陈敬华江南大学无锡医学院江苏无锡214122 江南大学药学院江苏无锡214122

探讨了金耳发酵液多糖的化学成分和生物活性。通过液体发酵法获得了金耳发酵液多糖,分别采用苯酚硫酸法、气相色谱-质谱联用技术(GC-MS)、凝胶渗透色谱(GPC)、红外光谱对其总糖含量、单糖组成、相对分子质量、糖苷键类型进行测定。此外... 详细信息

探讨了金耳发酵液多糖的化学成分和生物活性。通过液体发酵法获得了金耳发酵液多糖,分别采用苯酚硫酸法、气相色谱-质谱联用技术(GC-MS)、凝胶渗透色谱(GPC)、红外光谱对其总糖含量、单糖组成、相对分子质量、糖苷键类型进行测定。此外,对金耳发酵液多糖的体外抗氧化和体内降血糖活性进行了研究。结果表明,金耳发酵液多糖总糖质量分数为85.85%,主要的单糖组成为甘露糖、葡萄糖和半乳糖,相对分子质量为14 000,主链以β糖苷键相连。具有一定的还原能力以及较强的清除DPPH和羟基自由基活性,可显著降低四氧嘧啶诱导的糖尿病小鼠血糖含量。

关键词：金耳发酵多糖制备化学分析生物活性

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木聚糖酶EvXyn11^(TS)耐热性与其N端二硫键的相关性分析

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微生物学报 2013年第4期53卷 346-353页

作者：闵柔李剑芳高树娟张慧敏吴静邬敏辰江南大学药学院无锡214122 江南大学食品学院无锡214122 江南大学无锡医学院无锡214122

【目的】以糖苷水解酶11家族耐热木聚糖酶EvXyn11TS为研究对象,定点突变其编码基因Syxyn11,揭示EvXyn11TS耐热性与其N端二硫键的相关性。【方法】对不同来源的、与EvXyn11TS一级结构相似度较高的若干11家族木聚糖酶进行多序列同源比对,... 详细信息

【目的】以糖苷水解酶11家族耐热木聚糖酶EvXyn11TS为研究对象,定点突变其编码基因Syxyn11,揭示EvXyn11TS耐热性与其N端二硫键的相关性。【方法】对不同来源的、与EvXyn11TS一级结构相似度较高的若干11家族木聚糖酶进行多序列同源比对,发现只有耐热的EvXyn11TS在其N端存在一个二硫键(Cys5-Cys32);运用分子动力学模拟预测该N端二硫键存在与否对木聚糖酶热稳定性的影响。以人工合成的Syxyn11为母本,采用PCR技术将其编码Cys5的密码子TGT突变为编码Thr5的ACT,构建去除了N端二硫键的突变酶(EvXyn11M)的编码基因Syxyn11M;分别将Syxyn11和Syxyn11M在毕赤酵母GS115中进行表达,并分析表达产物EvXyn11TS和EvXyn11M的温度和pH特性。【结果】酶学性质研究结果表明:EvXyn11M的最适温度Topt由突变前的85℃降至70℃;EvXyn11TS在90℃的半衰期t1/290为32 min,而EvXyn11M在70℃的半衰期t1/270仅为8.0 min。【结论】运用分子动力学模拟预测了N端二硫键对EvXyn11TS耐热性的重要作用,并通过定点突变验证之,为其它与耐热EvXyn11TS一级结构相似的、11家族常温高比活性木聚糖酶的耐热性改造提供了新的技术策略。

关键词：木聚糖酶耐热性 N端二硫键分子动力学模拟定点突变

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TRPV4-Nox2复合体对肥胖小鼠主动脉舒张功能影响

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中国药理学通报 2022年第5期38卷 719-725页

作者：高梦茹韩婧马鑫江南大学药学院江苏无锡214122 江南大学医学院江苏无锡214122

目的探究TRPV4-Nox2复合体对高脂饮食诱导的肥胖小鼠主动脉中ROS的产生及其舒张功能的影响。方法雄性C57 BL/6J小鼠与TRPV4基因敲除小鼠,随机分为7组,每组各10只:正常饮食组(normal diet,ND)、高脂饮食组(high fat diet,HFD)、敲除喂高... 详细信息

目的探究TRPV4-Nox2复合体对高脂饮食诱导的肥胖小鼠主动脉中ROS的产生及其舒张功能的影响。方法雄性C57 BL/6J小鼠与TRPV4基因敲除小鼠,随机分为7组,每组各10只:正常饮食组(normal diet,ND)、高脂饮食组(high fat diet,HFD)、敲除喂高脂饮食组(TRPV4 KO-HFD)、高脂饮食并给予腺相关病毒组(HFD-AAV-Flt1-Vector/Nox2△3)、敲除喂高脂饮食并给予腺相关病毒组(TRPV4 KO-HFD-AAV-Flt1-Vector/Nox2△3),每周记录体质量,14周后分离内皮细胞进行ROS检测和免疫共振能量转移实验,分离主动脉进行血管张力实验。结果①肥胖明显增加ROS产生,引发血管舒张功能障碍,并增加TRPV4-Nox2复合体之间物理耦联强度;②减弱TRPV4-Nox2物理耦联强度可减少肥胖引发的ROS产生增加,改善血管舒张功能;③恩曲替尼不改变TRPV4与Nox2的表达与功能,而仅减弱TRPV4-Nox2的物理相互作用,进而改善肥胖引发的氧化应激,恢复血管舒张功能。结论恩曲替尼通过减弱TRPV4-Nox2复合体耦联强度,可减少肥胖引发的ROS产生增加,改善血管舒张功能。

关键词：肥胖 TRPV4-Nox2复合体主动脉血管舒张氧化应激恩曲替尼

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王不留行黄酮苷的分离纯化及对细胞增殖活性的影响

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天然产物研究与开发 2017年第2期29卷 316-321页

作者：王旭侯豹蔡维维邱丽颖江南大学无锡医学院江南大学药学院无锡214122

本文以炒王不留行中王不留行黄酮苷含量为考察指标,采用动静态吸附试验相结合的方式,从大孔树脂型号、吸附时间、最大上样量和洗脱剂浓度等方面考察大孔吸附树脂对炒王不留行中王不留行黄酮苷的分离纯化工艺,得到了稳定可行的工艺路线... 详细信息

本文以炒王不留行中王不留行黄酮苷含量为考察指标,采用动静态吸附试验相结合的方式,从大孔树脂型号、吸附时间、最大上样量和洗脱剂浓度等方面考察大孔吸附树脂对炒王不留行中王不留行黄酮苷的分离纯化工艺,得到了稳定可行的工艺路线和吸附参数。同时利用SRB法测定皂苷对内皮细胞增殖的影响。本研究可为炒王不留行中王不留行黄酮苷的大孔树脂分离纯化精制工艺的确定提供参考,同时进一步研究发现王不留行黄酮苷可显著促进内皮细胞增殖。

关键词：炒王不留行王不留行黄酮苷大孔吸附树脂静态吸附动态吸附细胞增殖

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王不留行刺桐碱提取工艺的比较研究

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天然产物研究与开发 2016年第5期28卷 728-734页

作者：刘艳玲王旭侯豹蔡维维冯磊邱丽颖江南大学药学院江南大学无锡医学院无锡214122

本实验采用高效液相色谱(HPLC)法检测王不留行刺桐碱含量为评价指标,分别采用单因素试验法和正交试验法对水浴回流提取和超声提取对王不留行刺桐碱的提取工艺进行比较。结果表明:超声提取王不留行刺桐碱的最佳工艺参数为液固比10∶1 mL/... 详细信息

本实验采用高效液相色谱(HPLC)法检测王不留行刺桐碱含量为评价指标,分别采用单因素试验法和正交试验法对水浴回流提取和超声提取对王不留行刺桐碱的提取工艺进行比较。结果表明:超声提取王不留行刺桐碱的最佳工艺参数为液固比10∶1 mL/g,60%乙醇在350 W功率、80℃下提取40 min,在该工艺条件下王不留行刺桐碱含量为0.395 mg/g;水浴回流提取王不留行刺桐碱的最佳工艺参数为乙醇浓度75%,提取温度95℃,提取时间2 h,液固比12∶1 mL/g时,王不留行刺桐碱含量为0.345 mg/g。超声提取王不留行刺桐碱的提取效率、稳定性和重复性都优于水浴回流提取法。

关键词：王不留行刺桐碱水浴回流提取超声提取提取工艺

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饱和突变改善米曲霉11家族木聚糖酶AEx11A的催化特性

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食品与生物技术学报 2020年第5期39卷 31-37页

作者：刘艳张婷阚婷婷李剑芳邬敏辰江南大学食品学院江苏无锡214122 江南大学药学院江苏无锡214122 江南大学无锡医学院江苏无锡214122

为改善米曲霉(Aspergillus oryzae)11家族木聚糖酶AEx11A的催化特性,作者采用全质粒PCR方法对AEx11A基因(AEx11A)中编码Thr98、Asn100、Val124、Pro129和Ile132的密码子实施饱和突变,构建饱和突变文库。以木聚糖酶的酶活性为指标,采用DN... 详细信息

为改善米曲霉(Aspergillus oryzae)11家族木聚糖酶AEx11A的催化特性,作者采用全质粒PCR方法对AEx11A基因(AEx11A)中编码Thr98、Asn100、Val124、Pro129和Ile132的密码子实施饱和突变,构建饱和突变文库。以木聚糖酶的酶活性为指标,采用DNS法从文库中筛选出酶活性提高30%以上的转化子。对其中酶活性提高最明显的两个位点Thr98和Val124实施迭代饱和突变,筛选出最优突变子AEx11AT98D-V124Q,其纯化后的比活性及催化效率分别为AEx11A的3.04和2.74倍。此外,突变酶AEx11AV124T的热稳定性较AEx11A有一定的提高,其余2个突变酶的温度特性与AEx11A差异不大。

关键词：饱和突变米曲霉木聚糖酶催化特性

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