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畜牧兽医学报 2016年第2期47卷 325-330页

作者：胡波范志宇王芳魏后军宋艳华仇汝龙徐为中薛家宾江苏省农业科学院兽医研究所.农业部兽用生物制品工程技术重点实验室.国家兽用生物制品工程技术研究中心南京210014

为检测兔出血症病毒(RHDV)衣壳蛋白(VP60)P区形成二聚体的能力及其与HBGAs受体结合的能力,作者以pMD19T-VP60为模板扩增包含铰链区H的P区基因(HP)并克隆至原核表达载体pET28a(+)中,转化大肠杆菌BL21(DE3)菌株,经IPTG诱导表达,获得HP蛋... 详细信息

为检测兔出血症病毒(RHDV)衣壳蛋白(VP60)P区形成二聚体的能力及其与HBGAs受体结合的能力,作者以pMD19T-VP60为模板扩增包含铰链区H的P区基因(HP)并克隆至原核表达载体pET28a(+)中,转化大肠杆菌BL21(DE3)菌株,经IPTG诱导表达,获得HP蛋白。经SDS-PAGE和Western blot检测,结果显示,HP蛋白主要以包涵体的形式高效表达,经HisTrap亲和柱纯化后可形成二聚体结构。通过HBGAs受体结合试验表明,P区与完整病毒衣壳相似,能与唾液中的HBGAs受体发生结合。本研究为进一步开展RHDV衣壳蛋白与受体的相互作用研究奠定基础。

关键词：兔出血症病毒衣壳蛋白 P区组织血型抗原受体结合

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肝片吸虫Fh8明显增强STEC的Stx1可溶性表达及Stx1单克隆抗体制备

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华北农学报 2016年第5期31卷 44-49页

作者：张雪寒张碧成张强汪伟何孔旺江苏省农业科学院兽医研究所农业部兽用生物制品工程技术重点实验室国家兽用生物制品工程技术研究中心江苏南京210014

志贺毒素1（Shiga toxin 1,Stx1）,系五聚体蛋白,是产志贺毒素性大肠杆菌（Shiga Toxin-producing Escherichia coli,STEC）主要的毒素因子,但Stx1体外极不易可溶性表达,旨在克隆和表达志贺毒素1（Shiga toxin 1,Stx1）A亚基,体外获得... 详细信息

志贺毒素1（Shiga toxin 1,Stx1）,系五聚体蛋白,是产志贺毒素性大肠杆菌（Shiga Toxin-producing Escherichia coli,STEC）主要的毒素因子,但Stx1体外极不易可溶性表达,旨在克隆和表达志贺毒素1（Shiga toxin 1,Stx1）A亚基,体外获得可溶性表达的Stx1,以研制单克隆抗体。生物信息学软件分析Stx1A亚基氨基酸序列,Stx1A1亚基N端为信号肽段,其C端高疏水性和低免疫原性。PCR扩增stx1A亚基73~759的687个核苷酸,与肝片吸虫Fh8基因串联,克隆到低温表达载体p ColdⅠ以构建重组菌,诱导表达重组毒素His-Fh8-Stx1A,SDS-PAGE分析蛋白表达形式。重组毒素His-Fh8-Stx1A免疫Balb/c小鼠,Sp2/0细胞融合筛选、制备阳性杂交瘤和单克隆抗体。PCR扩增Fh8和stx1a亚基并构建重组质粒p ColdⅠ-His-Fh8-stx1,重组蛋白在原核细胞中得到高效表达,且以可溶性形式存在于菌体胞浆中。以重组His-Fh8-Stx1A为免疫原,成功制备3株能稳定传代并分泌Stx1的单克隆抗体（Mc Ab）的杂交瘤细胞株,取其中1株成功制备高ELISA效价的腹水。Western Blot显示,纯化的单克隆抗体可与重组免疫原His-Stx1A和天然志贺毒素1发生特异性反应。本试验成功可溶性表达志贺毒素1A亚基,并获得多株单克隆抗体,为研制用于检测STEC的夹心ELISA和胶体金试纸条奠定理论基础。

关键词：产志贺毒素大肠杆菌志贺毒素1 肝片吸虫 Fh8 可溶性表达单克隆抗体

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11株H9N2亚型禽流感病毒神经氨酸酶基因遗传分析

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南京农业大学学报 2016年第1期39卷 150-155页

作者：黄欣梅李银赵冬敏刘宇卓杨婧韩凯凯江苏省农业科学院兽医研究所/农业部兽用生物制品工程技术重点实验室/国家兽用生物制品工程技术研究中心江苏南京210014

[目的]本文旨在了解H9N2亚型禽流感病毒神经氨酸酶（NA）基因的遗传特点和变异情况。[方法]选择2008—2013年从江苏、安徽和浙江省家禽中分离的11株H9N2亚型禽流感病毒,用RT-PCR方法对NA基因片段进行扩增、克隆和序列测定,并对其核苷酸... 详细信息

[目的]本文旨在了解H9N2亚型禽流感病毒神经氨酸酶（NA）基因的遗传特点和变异情况。[方法]选择2008—2013年从江苏、安徽和浙江省家禽中分离的11株H9N2亚型禽流感病毒,用RT-PCR方法对NA基因片段进行扩增、克隆和序列测定,并对其核苷酸序列及推导的氨基酸序列进行同源性及遗传进化分析。[结果]11株毒株的NA基因核苷酸和推导的氨基酸同源性分别为86.2%~99.5%和86.9%~99.1%,均属于欧亚分支。其中9株鸡源毒株属于Y280-like亚系,在NA蛋白颈部63~65位点缺失了3个氨基酸;2株鸭源毒株属于G1-like亚系,在颈部39~40位点缺失了2个氨基酸。11株分离株除了69、146、200、234位点处潜在的N-糖基化位点比较保守以外,其余的糖基化位点都出现了变异情况。红细胞结合位点（HB）在431~433位点区域比较保守,但在366~373和399~404位点区域的氨基酸发生了明显的变异。抗原决定簇中部分氨基酸序列变异也较为活跃,推测与使用疫苗后的抗体选择有关。NA蛋白酶活性位点处的氨基酸非常保守,没有发生与抗神经氨酸酶抑制剂相关的氨基酸突变。[结论]江苏、安徽、浙江等省养殖鸡群中的H9N2亚型禽流感病毒仍以Y280-like分支较为常见,鸭群中出现G1-like分支应引起人们的注意。NA基因存在一定的变异,应加强对该类病毒的分子流行病学监测。

关键词： H9N2亚型禽流感病毒神经氨酸酶基因遗传分析

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猪肺炎支原体P65蛋白的脂酶活性分析

猪肺炎支原体P65蛋白的脂酶活性分析

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江苏省畜牧兽医学会2017年学术年会

作者：刘茂军王宏恩张悦陈熠夕冯志新熊祺琰张映邵国青江苏省农业科学院兽医研究所/农业部兽用生物制品工程技术重点实验室/国家兽用生物制品工程技术研究中心江苏南京 210014 江苏省农业科学院兽医研究所/农业部兽用生物制品工程技术重点实验室/国家兽用生物制品工程技术研究中心江苏南京 210014 山西农业大学动物科技学院山西太谷030801 山西农业大学动物科技学院山西太谷030801

虽然支原体是富含酶类,但是支原体是一种脂肪酸营养缺陷型菌,脂肪酶的存在可能为支原体的生长提供长链脂肪酸.猪肺炎支原体(Mycoplasma hyopneumoniae,Mhp)的P65 脂蛋白是其主要免疫源性的蛋白,P65 蛋白主要通过破坏宿主肺泡细胞的表面... 详细信息

虽然支原体是富含酶类,但是支原体是一种脂肪酸营养缺陷型菌,脂肪酶的存在可能为支原体的生长提供长链脂肪酸.猪肺炎支原体(Mycoplasma hyopneumoniae,Mhp)的P65 脂蛋白是其主要免疫源性的蛋白,P65 蛋白主要通过破坏宿主肺泡细胞的表面张力来降低宿主细胞的稳定性,导致肺脏功能性障碍.同时p65 蛋白具有脂肪酶活性,能够促进脂肪分解,可为猪Mhp 生长提供必需的短链脂肪酸.Mhp 168 强弱毒株具有不同的毒力,推测脂酶在其中其一定作用.因此,我们分析了Mhp 的脂酶活性,并对P65 蛋白的脂酶活性进行了分析.对Mhp 168 强弱毒株培养物进行离心收获,冻融裂解,获得了全菌蛋白.用脂肪酶特异性底物4-硝基苯基棕榈酸酯(4-Nitrophenyl palmitate),通过反应液和底物浓度等优化,建立了脂酶活性测定的酶学方法.应用该方法对Mhp 168 强弱毒株全菌蛋白进行酶学分析,发现Mhp 168 强毒株的脂酶活性高于弱毒株,且呈剂量依赖关系.从猪肺炎支原体基因组中扩增P65 基因,构建了原核表达载体,转化大肠杆菌,结果获得了重组表达的Mhp P65 蛋白.应用酶学测定方法测定了P65 的脂酶活性,pH 和温度对脂酶活性的影响.结果显示,重组表达的Mhp P65 蛋白具有脂酶活性,pH 8.0 和37℃是其最适反应条件.本研究证实Mhp 168 强毒株的脂酶活性高于弱毒株,且Mhp 的重组P65 蛋白也具有脂肪酶活性,提示P65 蛋白在Mhp的致病中具有一定作用,为该病原的致病因子研究提供了基础.

关键词：猪肺炎支原体 P65蛋白脂酶活性

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猪肺炎支原体168株感染诱导差异表达蛋白的筛选及鉴定

猪肺炎支原体168株感染诱导差异表达蛋白的筛选及鉴定

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江苏省畜牧兽医学会2017年学术年会

作者：王宏恩邵国青冯志新熊祺琰于岩飞张映辛九庆刘茂军江苏省农业科学院兽医研究所/农业部兽用生物制品工程技术重点实验室/国家兽用生物制品工程技术研究中心江苏南京210014 山西农业大学动物科技学院山西太谷030801 江苏省农业科学院兽医研究所/农业部兽用生物制品工程技术重点实验室/国家兽用生物制品工程技术研究中心江苏南京210014 山西农业大学动物科技学院山西太谷030801 中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室黑龙江哈尔滨150069

猪肺炎支原体(Mycoplasma hyopneumoniae,Mhp)是引起猪支原体肺炎Mycoplasma pneumoniae of Swine,MPS)的主要致病菌.毒力相关因子在支原体的感染与致病中扮演着十分重要的角色,但目前对毒力因子知之甚少.本研究通过对感染前后猪肺炎支... 详细信息

猪肺炎支原体(Mycoplasma hyopneumoniae,Mhp)是引起猪支原体肺炎Mycoplasma pneumoniae of Swine,MPS)的主要致病菌.毒力相关因子在支原体的感染与致病中扮演着十分重要的角色,但目前对毒力因子知之甚少.本研究通过对感染前后猪肺炎支原体168 强毒株进行差异蛋白质组学分析,筛选出一些可能的毒力因子.试验首先用猪肺炎支原体168 强毒株体外感染猪气管上皮细胞(STEC),根据上清支原体含量来筛选出适宜的感染时间.结果显示,与其他感染条件相比,感染剂量为1×108,感染时间为48h 时上清中支原体含量最多.根据筛选出的感染剂量及感染时间进一步感染,利用双向电泳技术(Two-dimensionalElectrophoresis,2-DE)对感染前后的全菌蛋白进行分离,PDQuest V8.0 软件对扫描所得图像进行分析(T 检验法,差异＞1.5 倍),强毒株感染组与对照组蛋白点进行比对分析后,发现了11 个差异蛋白,经过质谱鉴定7 个为支原体蛋白,其中3 个只出现在感染组中,4 个在感染后表达上调.从这些差异蛋白点中选择了甘油醛-3-磷酸脱氢酶(GAPDH)进行了Western-blot 验证,结果显示,GAPDH 蛋白在强毒株感染后表达上调,与双向电泳结果一致.

关键词：猪肺炎支原体168株双向电泳差异蛋白 Western-blot

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猪传染性胃肠炎病毒分离株JS2012全基因组序列分析

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江苏农业学报 2016年第6期32卷 1351-1358页

作者：郭容利李彬范宝超温立斌茅爱华周萍何孔旺江苏省农业科学院兽医研究所/农业部兽用生物制品工程技术重点实验室/国家兽用生物制品工程技术研究中心江苏南京210014

设计32对PCR引物分片段扩增猪传染性胃肠炎病毒（TGEV）江苏分离株JS2012全基因组,扩增产物克隆到p MD19-T载体并测序。用DNAstar软件将JS2012全基因组序列与Gen Bank中其他13株TGEV株和猪呼吸道冠状病毒（PRCV-ISU-1）序列进行比对以... 详细信息

设计32对PCR引物分片段扩增猪传染性胃肠炎病毒（TGEV）江苏分离株JS2012全基因组,扩增产物克隆到p MD19-T载体并测序。用DNAstar软件将JS2012全基因组序列与Gen Bank中其他13株TGEV株和猪呼吸道冠状病毒（PRCV-ISU-1）序列进行比对以及同源性分析,并绘制基因进化树。JS2012基因组序列全长28 542 bp,不包括poly A。基因组的排列为TGEV典型的基因排列序：5＇-ORF1a-ORF1b-S-3a-3b-E-M-N-7-3＇。TGEV JS2012株的ORF3基因和Miller组病毒一样有2个大片段的缺失。JS2012的S基因和Miller M6以及Virulent Purdue 2个强毒株有同样的序列特征。除Virulent Purdue外,其余Purdue株在1 123~1 128 bp处均有6 bp的缺失,JS2012与所有Miller株及Virulent Purdue一样,此处没有缺失。JS2012与其他TGEV毒株之间的碱基序列同源性为98.6%-99.9%,与Miller M6的碱基序列同源性最高,亲缘关系最近,同属于Miller组,与Purdue组相对较远。

关键词：猪传染性胃肠炎病毒(TGEV) 全基因组序列分析

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猪伪狂犬病毒变异株AH02LA单因子发病模型的建立

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中国动物检疫 2017年第4期34卷 86-89页

作者：毛爱民范锋王继春冯志新华利忠刘剑锋无锡市动物疫病预防控制中心江苏无锡214016 江苏省农业科学院兽医研究所农业部兽用生物制品工程技术重点实验室国家兽用生物制品工程技术研究中心江苏南京210014 南京农业大学江苏南京210014

2011年以来,猪伪狂犬病毒(PRV)变异株在我国多地区流行,造成了严重的经济损失。本研究以主要猪病病原为阴性的仔猪为基础,建立了PRV变异株AH02LA单因子发病模型,并研究了其主要病理学变化。研究发现PRV会引起仔猪非化脓性脑炎,这一病理... 详细信息

2011年以来,猪伪狂犬病毒(PRV)变异株在我国多地区流行,造成了严重的经济损失。本研究以主要猪病病原为阴性的仔猪为基础,建立了PRV变异株AH02LA单因子发病模型,并研究了其主要病理学变化。研究发现PRV会引起仔猪非化脓性脑炎,这一病理变化将有助于猪伪狂犬病的临床快速准确诊断。

关键词：猪伪狂犬病毒变异株发病模型病理学猪

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检测产志贺毒素大肠杆菌抗体的间接ELISA试剂盒的研制

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西南农业学报 2016年第11期29卷 2738-2745页

作者：张雪寒张强张碧成汪伟倪艳秀温立斌李彬周俊明何孔旺周萍江苏省农业科学院兽医研究所/农业部兽用生物制品工程技术重点实验室/国家兽用生物制品工程技术研究中心江苏南京210014

本研究旨在研制一种以紧密素为检测靶标的间接ELISA技术,检测血清中产志贺毒素大肠杆菌（Shiga toxigenic Escherichia coli,STEC）的抗体水平。根据紧密素27个亚型的N端保守序列,体外表达390-543 aa片段制备包被抗原,通过敏感性、特异... 详细信息

本研究旨在研制一种以紧密素为检测靶标的间接ELISA技术,检测血清中产志贺毒素大肠杆菌（Shiga toxigenic Escherichia coli,STEC）的抗体水平。根据紧密素27个亚型的N端保守序列,体外表达390-543 aa片段制备包被抗原,通过敏感性、特异性、重复性和稳定性实验,建立检测STEC的抗体的间接EIISA方法。经优化筛选的间接ELISA最佳反应条件：抗原包被浓度3 ng/孔,待检血清稀释比例1∶200,HRP-兔抗羊Ig G、HRP-兔抗牛Ig G的工作浓度均为1∶15000,5%脱脂奶封闭l h,底物作用时间10min,用于牛、羊疫苗抗体检测或者STEC大肠杆菌感染的监测。

关键词：致病性大肠杆菌紧密素间接ELISA

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我国畜产品兽药残留的公共经济学分析及对策

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家畜生态学报 2016年第6期37卷 1-7页

作者：陆昌华胡肄农谭业平臧一天郁达威江苏省农业科学院兽医研究所农业部兽用生物制品工程技术重点实验室国家兽用生物制品工程技术研究中心江苏南京210014

阐述我国兽药残留现状,指出养殖业中滥用兽药现象普遍存在,已严重影响我国畜产品安全与出口贸易。为此,作者在己有畜产品安全事件的经济损失评估模型探讨的基础上,从公共经济学的角度去分析畜产品兽药残留问题,思考消除隐患的可能措施,... 详细信息

阐述我国兽药残留现状,指出养殖业中滥用兽药现象普遍存在,已严重影响我国畜产品安全与出口贸易。为此,作者在己有畜产品安全事件的经济损失评估模型探讨的基础上,从公共经济学的角度去分析畜产品兽药残留问题,思考消除隐患的可能措施,提出完善兽药残留与动物源食品安全管理的建议。建立安全生态健康产品生产体系,建议改变我国畜产品危害因素的排序。建立基于网络环境下区域性食品安全风险防控中心,建议我国食品安全必须由单一部门来监管,以推动我国兽药残留与动物源食品安全管理的法制化、科学化与现代化。

关键词：食品安全畜产品兽药残留公共经济学

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丝氨酸/苏氨酸激酶对猪链球菌2型应激和毒力的影响

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江苏农业学报 2016年第3期32卷 593-600页

作者：祝昊丹倪艳秀茅爱华周俊明俞正玉吕立新何孔旺江苏省农业科学院兽医研究所农业部兽用生物制品工程技术重点实验室国家兽用生物制品工程技术研究中心江苏南京210014

为阐明丝氨酸/苏氨酸激酶(STK)对猪链球菌2型强毒株的应激耐受和毒力的影响,比较了亲本株SS2-1及其丝氨酸/苏氨酸激酶基因缺失株Δstk在各种应激环境(热、酸、氧化应激和高渗应激)中的生长能力,利用HEp-2细胞模型比较各菌株的黏附能力,... 详细信息

为阐明丝氨酸/苏氨酸激酶(STK)对猪链球菌2型强毒株的应激耐受和毒力的影响,比较了亲本株SS2-1及其丝氨酸/苏氨酸激酶基因缺失株Δstk在各种应激环境(热、酸、氧化应激和高渗应激)中的生长能力,利用HEp-2细胞模型比较各菌株的黏附能力,比较各菌株在猪全血中的存活能力,利用仔猪模型评价STK基因缺失前后细菌的毒力差异。结果表明,丝氨酸/苏氨酸激酶基因缺失后,细菌在各种应激环境中的生存能力明显减弱,对HEp-2细胞的黏附能力减弱,在猪全血中的存活能力显著降低,对仔猪的致病力明显降低。此外,缺失株Δstk在仔猪体内各器官的定殖能力也显著降低。说明丝氨酸/苏氨酸激酶与猪链球菌的应激和毒力密切相关。

关键词：猪链球菌2型丝氨酸/苏氨酸激酶应激毒力

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