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中国畜牧兽医学会动物传染病学分会第四次猪病学术研讨会

作者：欧阳伟王永山周宇张海彬唐雨德江苏省农业科学院兽医研究所／农业部动物疫病诊断与免疫重点开放实验室／国家兽用生物制品工程技术研究中心南京 210014 南京农业大学动物医学院南京 210095 江苏省农业科学院兽医研究所／农业部动物疫病诊断与免疫重点开放实验室／国家兽用生物制品工程技术研究中心南京 210014 南京农业大学动物医学院南京 210095 南京军区军事医学研究所南京 210002

将近期引起IBD免疫预防失败的传染性法氏囊病病毒(IBDV)vp2基因，定向克隆入杆状病毒表达系统的供体质粒pFastBacHTA中，构建重组供体质粒pFastBacHTA-vP2，转化Escherichia coli DH10Bac感受态，筛选重组杆状病毒表达质粒pBac-VP2。用p... 详细信息

将近期引起IBD免疫预防失败的传染性法氏囊病病毒(IBDV)vp2基因，定向克隆入杆状病毒表达系统的供体质粒pFastBacHTA中，构建重组供体质粒pFastBacHTA-vP2，转化Escherichia coli DH10Bac感受态，筛选重组杆状病毒表达质粒pBac-VP2。用pBac-VP2转染sf9昆虫细胞，获得重组杆状病毒vBac-VP2。对重组杆状病毒vBac-VP2感染的Sf9细胞，用间接免疫荧光试验(IFA)检测，具有特异性荧光;用IBDV抗体夹心ELISA检测，呈阳性反应，抗原效价达到1.6×103;用Western blotting分析，在53kDa处出现一条特异蛋白条带;电镜观察，重组Vp2蛋白能够自组装成病毒样颗粒，在感染细胞中发现了“包涵体样”结构。用HisTrapHP亲和层析柱纯化的重组Vp2蛋白作为包被抗原，建立的IBDV抗体间接ELISA检测方法具有良好的特异性。用重组杆状病毒感染的Sf9昆虫细胞裂解物，免疫2周龄SPF鸡，一次免疫14d后，ELISA检测抗体效价为8×102，中和抗体效价为1106，攻毒实验的存活率为30％;二次免疫14 d后，ELISA抗体效价为3.2×103，中和抗体效价为2536，存活率为100％.在实验观察7 d内，重组Vp2蛋白免疫保护鸡未显任何临床症状和病理变化，法氏囊/体重比高于对照组(P<0.05)。本实验制备的病毒样颗粒重组Vp2蛋白在研制新型IBD基因工程疫苗和检测试剂方面显示出了应用前景。

关键词：传染性法氏囊病病毒 Vp2基因病毒样颗粒包涵体样结构间接ELISA 免疫实验

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IBDV抗原表位与VP2组合基因的分子构建及其在昆虫细胞中的表达

IBDV抗原表位与VP2组合基因的分子构建及其在昆虫细胞中的表达

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第四届第十次全国学术研讨会暨动物微生态企业发展战略论坛

作者：周宇王永山范红结欧阳伟唐雨德王忠灿江苏省农业科学院兽医研究所/农业部动物疫病诊断与免疫重点开放实验室/国家兽用生物制品工程技术研究中心南京农业大学动物医学院南京军区军事医学研究所

运用PCR重叠延伸技术将传染性法氏囊病病毒(IBDV)多表位5e与VP2基因连接构建组合基因VP2-5e,将其插入到杆状病毒表达系统供体质粒pFastBacHT中,转化*** DH10Bac感受态细胞,经三抗性筛选获得重组杆状病毒表达质粒pBacHT-VP2-5e,用脂质体... 详细信息

运用PCR重叠延伸技术将传染性法氏囊病病毒(IBDV)多表位5e与VP2基因连接构建组合基因VP2-5e,将其插入到杆状病毒表达系统供体质粒pFastBacHT中,转化*** DH10Bac感受态细胞,经三抗性筛选获得重组杆状病毒表达质粒pBacHT-VP2-5e,用脂质体法转染Sf9细胞,获得重组杆状病毒vBacHT-VP2-5e。对vBacHT-VP2-5e感染的Sf9细胞,以间接免疫荧光试验(IFA)检测,具有特异性荧光;电镜检查,重组VP2-5e蛋白能够自组装成病毒样颗粒(VLP);用免疫印迹分析(Western-blotting),在59kD处出现一条特异性蛋白条带。本实验为组合基因型重组IBD多价疫苗的研究奠定了基础。

关键词：传染性法氏囊病病毒 VP2基因抗原表位组合基因表达

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新型鹅星状病毒AHQJ18株的分离鉴定

新型鹅星状病毒AHQJ18株的分离鉴定

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江苏省畜牧兽医学会首届“青年科技论坛”

作者：章丽娇黄欣梅刘飞刘青涛韩凯凯赵冬敏杨婧刘宇卓李银江苏省农业科学院兽医研究所/农业部动物疫病诊断与免疫重点开放实验室/国家兽用生物制品工程技术研究中心江苏南京 210014 山东鲁抗舍里乐药业有限公司山东济宁272000

新型鹅星状病毒是近期我国部分地区养鹅场新暴发的一种可引起雏鹅致死性痛风的新流行病原，给我国的商品鹅养殖业造成了严重的影响.2018 年7 月，安徽全椒某商品鹅场雏鹅出现精神沉郁、消瘦及四肢瘫痪等临床症状，严重的出现死亡，死亡... 详细信息

新型鹅星状病毒是近期我国部分地区养鹅场新暴发的一种可引起雏鹅致死性痛风的新流行病原，给我国的商品鹅养殖业造成了严重的影响.2018 年7 月，安徽全椒某商品鹅场雏鹅出现精神沉郁、消瘦及四肢瘫痪等临床症状，严重的出现死亡，死亡率5％-30％，剖检可见死亡雏鹅内脏表面、翅腿部关节和喙部出现明显的尿酸盐沉积.本研究通过采集患病鹅肝脏、肾脏等病变明显的组织样品，经鹅胚尿囊膜接种，分离到一株能引起鹅胚尿囊膜增厚和胚体肝脏坏死的病毒，经RT-PCR、序列比对及系统进化树分析，确定其为新型鹅星状病毒，命名为AAstV/Goose/CHN/2018/AHQJ(简称AHQJ18).该毒株的分离鉴定为雏鹅痛风流行病学的调查提供依据，同时也为其防控奠定了基础.

关键词：痛风新型鹅星状病毒分离鉴定

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猪肺炎支原体套式PCR检测方法的建立

猪肺炎支原体套式PCR检测方法的建立

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中国畜牧兽医学会动物传染病学分会第十三次学术研讨会

作者：逯晓敏冯志新刘茂军吴叙苏甘源张映邵国青山西农业大学动物科技学院山西太谷 030801 江苏省农业科学院兽医研究所.农业部动物疫病诊断与免疫重点开放实验室.国家兽用生物制品工程技术研究中心.江苏省生物兽药筛选服务中心江苏南京 210014

根据GeneBank中登录的猪肺炎支原体PB6(L-乳酸脱氢酶)全基因序列，设计合成了2对引物，建立了适合猪肺炎支原体检测的套式PCR方法。运用该方法对猪肺炎支原体(168株)培养物进行了检测。结果显示，该培养物能扩增出427bp的目的条带。特... 详细信息

根据GeneBank中登录的猪肺炎支原体PB6(L-乳酸脱氢酶)全基因序列，设计合成了2对引物，建立了适合猪肺炎支原体检测的套式PCR方法。运用该方法对猪肺炎支原体(168株)培养物进行了检测。结果显示，该培养物能扩增出427bp的目的条带。特异性试验结果表明：鸡毒支原体、猪絮状支原体、猪鼻支原体、猪传染性胸膜肺炎放线杆菌、副猪嗜血杆菌、猪链球菌2型和猪流感病毒、猪圆环病毒2型、猪伪狂犬病毒、猪繁殖与呼吸综合征病毒基因组DNA或cDNA扩增结果均为阴性。该方法的敏感性高，最低可以检测出10个猪肺炎支原体。建立的套式PCR方法可以用于猪肺炎支原体的临床诊断检测和分子流行病学调查。

关键词：猪肺炎支原体套式PCR检测临床诊断流行病学分析

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传染性法氏囊病病毒AH1株vp2基因在昆虫细胞中的表达与应用

传染性法氏囊病病毒AH1株vp2基因在昆虫细胞中的表达与应用

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中国畜牧兽医学会畜牧兽医生物技术学分会暨中国免疫学会兽医免疫分会第八次学术研讨会

作者：欧阳伟王永山周宇张海彬唐雨德江苏省农业科学院兽医研究所农业部动物疫病诊断与免疫重点开放实验室/国家兽用生物制品工程技术研究中心南京农业大学动物医学院南京军区军事医学研究所

将引起传染性法氏囊病IBD免疫预防失败的IBD病毒(IBDV)vp2基因,定向克隆入杆状病毒表达系统的供体质粒pFastBacHTA中,构建重组供体质粒pFastBacHTA-VP2,转化Escherichia coli DH10Bac感受态,筛选重组杆状病毒表达质粒pBac-VP2。用pBac-... 详细信息

将引起传染性法氏囊病IBD免疫预防失败的IBD病毒(IBDV)vp2基因,定向克隆入杆状病毒表达系统的供体质粒pFastBacHTA中,构建重组供体质粒pFastBacHTA-VP2,转化Escherichia coli DH10Bac感受态,筛选重组杆状病毒表达质粒pBac-VP2。用pBac-VP2转染Sf9昆虫细胞,获得重组杆状病毒vBac-VP2。对重组杆状病毒vBac-VP2感染的Sf9细胞,用间接免疫荧光试验(IFA)检测,具有特异性荧光;用IBDV抗体夹心ELISA检测,呈阳性反应,抗原效价达到1.6×10～3;用western blot分析,在53 ku处出现一条特异蛋白条带;电镜观察,重组Vp2蛋白能够自组装成病毒样颗粒,在感染细胞中发现了"包涵体样"结构。用HisTrap HP亲和层析柱纯化的重组Vp2蛋白作为包被抗原,建立的IBDV抗体间接ELISA检测方法具有良好的特异性。用重组杆状病毒感染的Sf9昆虫细胞裂解物,免疫2周龄SPF鸡,一次免疫14 d后,ELISA检测抗体效价为8×10～2,中和抗体效价为1106,攻毒实验的存活率为30%;二次免疫14 d后,ELISA抗体效价为3.2×10～3,中和抗体效价为2536,存活率为100%。在实验观察7 d内,重组Vp2蛋白免疫保护鸡未显任何临床症状和病理变化,法氏囊/体重比高于对照组(p<0.05)。本实验制备的病毒样颗粒重组Vp2蛋白在研制新型IBD基因工程疫苗和检测试剂方面显示出了应用前景。

关键词：传染性法氏囊病病毒 Vp2基因病毒样颗粒包涵体样结构间接ELISA 免疫实验

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高致病性蓝耳病继发副猪嗜血杆菌病的诊治

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中国兽医杂志 2011年第7期47卷 75-75页

作者：甘源孔猛韦艳娜李彬刘冬阳刘茂军冯志新邵国青江苏省农业科学院兽医研究所农业部动物疫病诊断与免疫重点开放实验室国家兽用生物制品工程技术研究中心江苏南京210014

高致病性猪蓝耳病是由猪繁殖与呼吸综合征病毒变异株引起的一种急性高致死性传染病。副猪嗜血杆菌病是由副猪嗜血杆菌引起的一种以纤维素浆膜炎和多发性关节炎。

关键词：副猪嗜血杆菌病高致病性猪蓝耳病猪繁殖与呼吸综合征病毒诊治继发传染病致死性

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IBDV抗原表位与HBcAg嵌合基因的分子设计及其表达产物分析

IBDV抗原表位与HBcAg嵌合基因的分子设计及其表达产物分析

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第四届第十次全国学术研讨会暨动物微生态企业发展战略论坛

作者：刘小娟王永山欧阳伟张海彬王晓丽王忠灿唐雨德江苏省农业科学院兽医研究所/农业部动物疫病诊断与免疫重点开放实验室/国家兽用生物制品工程技术研究中心南京农业大学动物医学院南京军区军事医学研究所

为了提高模拟IBDV多表位基因5epis的免疫效力,运用重叠延伸PCR技术,在乙型肝炎病毒核心抗原(Hepatitis B core antigen,HBcAg)基因的231位～232位核苷酸(77位～78位氨基酸残基)之间插入BamH I和EcoR I酶切位点,构建HBcAg修饰基因(Modifi... 详细信息

为了提高模拟IBDV多表位基因5epis的免疫效力,运用重叠延伸PCR技术,在乙型肝炎病毒核心抗原(Hepatitis B core antigen,HBcAg)基因的231位～232位核苷酸(77位～78位氨基酸残基)之间插入BamH I和EcoR I酶切位点,构建HBcAg修饰基因(Modified HBc,mHBc)表达质粒pET-mHBc。然后,将5epis基因定向插入到该表达质粒mHBc基因中,获得嵌合基因mHBc-5epis表达质粒pET-mHBc-5epis,并在大肠杆菌中表达。用SDS-PAGE分析,重组嵌合蛋白的分子量约为29kDa,表达量约占菌体总蛋白的47.6%;在Western-blotting试验中,重组嵌合蛋白与IBDV抗体反应形成1条特异性蛋白带。将重组菌超声破碎后,用电镜观察,可见重组嵌合蛋白呈病毒样颗粒(VLP),直径约60 nm～80 nm;用IBDV抗体夹心ELISA检测,抗原效价达到2.0×10～2。本研究成功构建了5epis与HBcAg嵌合基因,在大肠杆菌中高效表达了具有IBDV抗原反应性的重组嵌合蛋白并形成了VLP,具有成为颗粒化表位型IBD基因工程疫苗的应用前景。

关键词：传染性法氏囊病病毒(IBDV) 乙肝病毒核心抗原(HBcAg) 抗原表位嵌合基因

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传染性法氏囊病病毒AH1株vp2基因在昆虫细胞中的表达与应用

传染性法氏囊病病毒AH1株vp2基因在昆虫细胞中的表达与应用

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中国畜牧兽医学会动物传染病学分会第四次猪病防控学术研讨会

作者：欧阳伟王永山周宇张海彬唐雨德江苏省农业科学院兽医研究所/农业部动物疫病诊断与免疫重点开放实验室/国家兽用生物制品工程技术研究中心南京农业大学动物医学院南京军区军事医学研究所

将近期引起IBD免疫预防失败的传染性法氏囊病病毒(IBDV)vp2基因,定向克隆入杆状病毒表达系统的供体质粒pFastBacHTA中,构建重组供体质粒pFastBacHTA-VP2,转化Escherichia coli DH10Bac感受态,筛选重组杆状病毒表达质粒pBac-VP2。用pBac-... 详细信息

将近期引起IBD免疫预防失败的传染性法氏囊病病毒(IBDV)vp2基因,定向克隆入杆状病毒表达系统的供体质粒pFastBacHTA中,构建重组供体质粒pFastBacHTA-VP2,转化Escherichia coli DH10Bac感受态,筛选重组杆状病毒表达质粒pBac-VP2。用pBac-VP2转染Sf9昆虫细胞,获得重组杆状病毒vBac-VP2。对重组杆状病毒vBac-VP2感染的Sf9细胞,用间接免疫荧光试验(IFA)检测,具有特异性荧光;用IBDV抗体夹心ELISA检测,呈阳性反应,抗原效价达到1.6×103;用Western blotting分析,在53kDa处出现一条特异蛋白条带;电镜观察,重组Vp2蛋白能够自组装成病毒样颗粒,在感染细胞中发现了"包涵体样"结构。用HisTrap HP亲和层析柱纯化的重组Vp2蛋白作为包被抗原,建立的IBDV抗体间接ELISA检测方法具有良好的特异性。用重组杆状病毒感染的Sf9昆虫细胞裂解物,免疫2周龄SPF鸡,一次免疫14d后,ELISA检测抗体效价为8×102,中和抗体效价为1106,攻毒实验的存活率为30%;二次免疫14d后,ELISA抗体效价为3.2×103,中和抗体效价为2536,存活率为100%。在实验观察7d内,重组Vp2蛋白免疫保护鸡未显任何临床症状和病理变化,法氏囊/体重比高于对照组(P<0.05)。本实验制备的病毒样颗粒重组Vp2蛋白在研制新型IBD基因工程疫苗和检测试剂方面显示出了应用前景。

关键词：传染性法氏囊病病毒 Vp2基因病毒样颗粒包涵体样结构间接ELISA 免疫实验

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近期引起免疫失败的传染性法氏囊病病毒VP2基因在大肠杆菌中的表达

近期引起免疫失败的传染性法氏囊病病毒VP2基因在大肠杆菌中的表达

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中国畜牧兽医学会兽医公共卫生学分会第二次学术研讨会

作者：曹冰玉王永山范红结欧阳伟王忠灿唐雨德江苏省农业科学院兽医研究所/农业部动物疫病诊断与免疫重点开放实验室/国家兽用生物制品工程技术研究中心南京农业大学动物医学院南京军区军事医学研究所

为制备近期IBDV毒株的重组VP2蛋白,将近期安徽IBD免疫预防失败的病鸡法氏囊组织中扩增的VP2基因定向克隆入原核表达载体pGEX-4T-1中,构建原核表达质粒pGEX-VP2,转化大肠杆菌Rosetta(DE3);经IPTG诱导后,用IBDV双抗体夹心ELISA检测,呈阳... 详细信息

为制备近期IBDV毒株的重组VP2蛋白,将近期安徽IBD免疫预防失败的病鸡法氏囊组织中扩增的VP2基因定向克隆入原核表达载体pGEX-4T-1中,构建原核表达质粒pGEX-VP2,转化大肠杆菌Rosetta(DE3);经IPTG诱导后,用IBDV双抗体夹心ELISA检测,呈阳性反应;以SDS-PAGE分析,重组VP2融合蛋白的分子量为68ku,表达量约占菌体总蛋白的16.0%,表达产物主要以包涵体形式存在于菌体内;在Western-blotting中,重组VP2蛋白与IBDV抗体反应形成1条特异性蛋白带。本实验为研制针对近期流行IBDV毒株的新型基因工程疫苗和检测试剂奠定了基础。

关键词：传染性法氏囊病病毒 IBDV VP2 原核表达

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应用猪瘟抗原/血清ELISA测定猪瘟兔化弱毒疫苗中的病毒含量

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金陵科技学院学报 2010年第4期26卷 73-78页

作者：唐红慧杜希珍刘大伟王金虎冯志新张道华刘茂军邵国青江苏省农业科学院兽医研究所.农业部动物疫病诊断与免疫重点开放实验室.国家兽用生物制品工程技术研究中心江苏南京210014 扬州大学兽医学院江苏扬州225009 北京爱德士元亨生物技术有限公司北京101300 南京天邦生物科技有限公司江苏南京210012

简单、快速地测定猪瘟病毒的含量是猪瘟兔化弱毒疫苗(HCLV)生产工艺中难以解决的技术之一。本试验通过应用猪瘟抗原/血清ELISA试剂盒(IDEXX HerdCheck Co.),对已知滴度的24份HCLV半成品细胞苗和21份成品疫苗进行抗原含量测定,结果24份H... 详细信息

简单、快速地测定猪瘟病毒的含量是猪瘟兔化弱毒疫苗(HCLV)生产工艺中难以解决的技术之一。本试验通过应用猪瘟抗原/血清ELISA试剂盒(IDEXX HerdCheck Co.),对已知滴度的24份HCLV半成品细胞苗和21份成品疫苗进行抗原含量测定,结果24份HCLV半成品细胞苗95.83%与兔体定型热反应结果相符,检测敏感性可达20头份/瓶(或病毒拷贝数109个/瓶)。但该方法无法区分猪瘟病毒抗原与牛流行性腹泻病毒抗原。试验结果证明,IDEXX猪瘟抗原/血清ELISA试剂盒能够稳定、快速、简单地用于HCLV细胞苗的半成品与成品的病毒含量测定,为疫苗生产的质量控制提供了一种可靠和稳定的方法。

关键词： HCLV ELISA HCLV半成品细胞苗 HCLV成品疫苗

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