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第六届(2016)中国兔业发展大会

作者：宋艳华魏后军范志宇左园园胡波仇汝龙陈萌萌李明勇薛家宾徐为中王芳江苏省农业科学院兽医研究所·农业部动物疫病诊断与免疫重点开放实验室·国家兽用生物制品工程技术研究中心南京 210014 山东青岛康大欧洲兔业育种有限公司青岛 266400

本研究旨在建立鉴别兔出血症病毒经典毒株和变异毒株的RT-PCR检测方法,根据GenBank中经典RHDV和RHDV2的VP60基因序列,设计两对分别结合两种基因的特异性引物.利用两对引物,以人工合成RHDV2VP60基因构建的pMD19-T-VP60-2和本实验室保存... 详细信息

本研究旨在建立鉴别兔出血症病毒经典毒株和变异毒株的RT-PCR检测方法,根据GenBank中经典RHDV和RHDV2的VP60基因序列,设计两对分别结合两种基因的特异性引物.利用两对引物,以人工合成RHDV2VP60基因构建的pMD19-T-VP60-2和本实验室保存含经典RHDVVP60基因的pMD19-T-VP60为模板,进行反应条件的优化、敏感性试验、特异性试验以及RHDV人工感染样品和疑似临床样品的检测.结果显示,该方法具有良好的特异性和敏感性;经典RHDV和RHDV2的检测限度分别为95和76个拷贝的靶基因片段,且支气管败血波氏杆菌、多杀性巴氏杆菌、产气荚膜梭菌、大肠杆菌等病原以及重组质粒pMD19-T-EBHSV的检测结果均为阴性;RHDV人工感染的组织样品检出率为100％;检测临床样品15份,其中3份为经典RHDV阳性,其他样品均为经典RHDV及RHDV2阴性.该方法的建立能够实现快速、特异及敏感地检测RHDV和RHDV2,为监测RHDV变异株的流行情况提供技术支撑.

关键词：兔出血症经典毒株变异毒株鉴别诊断 RT-PCR检测

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断奶仔猪多系统衰竭综合征相关病原混合感染的流行病学调查

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中国畜牧兽医 2015年第12期42卷 3383-3391页

作者：曹东阳王小敏茅爱华何孔旺钱爱东江苏省农业科学院兽医研究所农业部兽用生物制品工程技术重点实验室国家兽用生物制品工程技术研究中心南京210014 吉林农业大学动物科学技术学院长春130118

为了解中国江苏省及周边地区猪场断奶仔猪多系统衰竭综合征(PMWS)相关病原的流行情况,本研究采用PCR方法,对2014年1月至2015年5月采自江苏、安徽及浙江等地猪场的125份健康猪样品和261份发病猪样品分别进行猪圆环病毒2型(PCV2)、猪繁殖... 详细信息

为了解中国江苏省及周边地区猪场断奶仔猪多系统衰竭综合征(PMWS)相关病原的流行情况,本研究采用PCR方法,对2014年1月至2015年5月采自江苏、安徽及浙江等地猪场的125份健康猪样品和261份发病猪样品分别进行猪圆环病毒2型(PCV2)、猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)、猪细小病毒(PPV)、输血性传播病毒(TTV)和类猪圆环病毒P1的检测。结果显示,所有样品PCV2、PRRSV、PPV、TTV1、TTV2和P1的阳性率分别为39.38%、21.76%、3.11%、15.80%、16.32%和10.10%,其中混合感染主要存在于PMWS的发病猪群,以PCV2与TTV2(15.32%)和PCV2与PRRSV(11.87%)的混合感染为主。结果表明,江苏省及周边地区猪场普遍存在PMWS相关病原的混合感染现象,加大了PMWS相关病原的防控难度。

关键词：断奶仔猪多系统衰竭综合征多病原混合感染流行病学调查

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类猪圆环病毒 P1 VP1蛋白在昆虫细胞中的表达及特性分析

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华北农学报 2015年第4期30卷 90-94页

作者：王凤芝温立斌何孔旺姚火春王小敏江苏省农业科学院兽医研究所农业部兽用生物制品工程技术重点实验室国家兽用生物制品工程技术研究中心江苏南京210014 南京农业大学动物医学院江苏南京210095

为了鉴定类猪圆环病毒P1 VP1蛋白能否在体外自组装成病毒样颗粒(VLPs),首先PCR扩增P1 ORF1基因,利用p Fast BacTM1载体构建重组质粒,通过脂质体转染在Sf9细胞中表达P1 ORF1基因。然后通过RT-PCR技术及Western Blot分别从转录和蛋白质水... 详细信息

为了鉴定类猪圆环病毒P1 VP1蛋白能否在体外自组装成病毒样颗粒(VLPs),首先PCR扩增P1 ORF1基因,利用p Fast BacTM1载体构建重组质粒,通过脂质体转染在Sf9细胞中表达P1 ORF1基因。然后通过RT-PCR技术及Western Blot分别从转录和蛋白质水平上鉴定该基因的表达,应用透射电镜观察该蛋白质是否形成了VLPs。结果显示,转染Sf9细胞后,第5天开始出现细胞病变;从接毒细胞中提取总RNA,经Recombinant DNaseⅠ处理除去基因组DNA后,RT-PCR能够扩增出362 bp的目的片段;收获接毒后72 h的细胞,Western Blot分析显示,P1 ORF1重组病毒样品能够与抗P1 VP1单抗发生特异性反应;电镜观察发现,该蛋白在Sf9细胞中形成了近椭圆形的包涵体。利用杆状病毒表达载体系统成功地在Sf9细胞中表达了类猪圆环病毒P1的ORF1基因,并证实在本试验条件下P1 VP1蛋白不能自组装成VLPs,为进一步研究P1 VP1蛋白的免疫学特性奠定基础。

关键词： P1 VP1 昆虫杆状病毒表达载体系统 RT-PCR Western Blot 电镜

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边界病病毒E2蛋白质的原核表达及间接ELISA检测方法的建立

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江苏农业学报 2015年第1期31卷 93-99页

作者：毛立刘霞李文良杨蕾蕾张纹纹魏建忠江杰元江苏省农业科学院兽医研究所/农业部兽用生物制品工程技术重点实验室/国家兽用生物制品工程技术研究中心江苏南京210014 安徽农业大学动物科技学院安徽合肥230036

边界病病毒(Border disease virus,BDV)是导致绵羊和山羊繁殖障碍的重要病原。为了建立检测BDV特异抗体的ELISA方法,本研究将BDV基因克隆入原核表达载体p ET-32a(+),并构建重组表达菌,经SDS-PAGE和Western blot鉴定目的蛋白质。以纯化... 详细信息

边界病病毒(Border disease virus,BDV)是导致绵羊和山羊繁殖障碍的重要病原。为了建立检测BDV特异抗体的ELISA方法,本研究将BDV基因克隆入原核表达载体p ET-32a(+),并构建重组表达菌,经SDS-PAGE和Western blot鉴定目的蛋白质。以纯化的重组表达蛋白质为抗原,建立间接ELISA(r E2-ELISA)检测方法。通过反应条件优化,确定抗原包被浓度4.0μg/ml;封闭液为20 g/L BSA;血清最佳稀释度为1∶50,孵育1 h;二抗最佳稀释倍数为1∶30 000,作用45 min;以TMB为底物显色10 min。用该ELISA方法检测瘟病毒属的CSFV、BVDV阳性血清,结果均为阴性。对187份山羊血清样品进行临床检测,与Svanova试剂盒检测结果阳性符合率为76.25%,总符合率为74.87%;上述检测方法同时与Western blot鉴定结果进行比较,结果显示,Western blot结果与r E2-ELISA检测结果的符合率为79.55%,高于与Svanova试剂盒检测的符合率(72.73%)。表明建立的间接ELISA检测方法可适用于临床BDV血清样品的抗体检测。

关键词：边界病病毒 E2蛋白质间接ELISA

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RHDV VLPs对口蹄疫病毒B细胞表位的展示效果

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江苏农业学报 2015年第6期31卷 1362-1370页

作者：胡波盛蓉宋艳华范志宇魏后军薛家宾王芳江苏省农业科学院兽医研究所/农业部兽用生物制品工程技术重点实验室/国家兽用生物制品工程技术研究中心江苏南京210014 南京农业大学动物医学院江苏南京210095

为研究兔出血症病毒(RHDV)病毒样颗粒(VLPs)携带外源表位的能力及其免疫原性,以兔出血症病毒(RHDV)衣壳蛋白VP60为载体,分别在RHDV VP60蛋白质的C端、N端和306位插入FMDV VP1双串联B细胞表位[GS-(200~213 aa)-GS-(141~160 aa)],得到嵌... 详细信息

为研究兔出血症病毒(RHDV)病毒样颗粒(VLPs)携带外源表位的能力及其免疫原性,以兔出血症病毒(RHDV)衣壳蛋白VP60为载体,分别在RHDV VP60蛋白质的C端、N端和306位插入FMDV VP1双串联B细胞表位[GS-(200~213 aa)-GS-(141~160 aa)],得到嵌合蛋白质,分别命名为VP60-2FB、VP60-306FB和VP60-578FB。经IFA、SDS-PAGE和Western blot鉴定,嵌合VP60蛋白质在杆状病毒表达系统中均得到有效表达;通过电镜观察发现嵌合蛋白质可自聚成病毒样颗粒。将嵌合蛋白质免疫小鼠,检测产生的免疫应答情况,结果显示,嵌合蛋白质可以产生针对VP60特异的免疫应答,且在插入长度为42 aa外源氨基酸片段的情况下,嵌合蛋白质免疫的小鼠仍能诱导产生较高水平的针对外源表位的特异性应答。在进一步扩展了载体的容纳性后,序列的增加不影响VLPs的形成以及对外源表位的递呈效果,说明VP60-VLPs作为外源B细胞表位展示载体是可行性的。

关键词：兔出血症病毒病毒样颗粒口蹄疫病毒 B细胞表位载体

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山羊源副流感病毒3型的分离与分子鉴定

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畜牧兽医学报 2015年第2期46卷 344-348页

作者：李文良毛立程素平王秋生黄加春张纹纹杨蕾蕾江杰元江苏省农业科学院兽医研究所农业部兽用生物制品工程技术重点实验室国家兽用生物制品工程技术研究中心南京210014 海安县畜牧兽医站海安226600 南通点石生物科技有限公司南通226000

2013年下半年至2014年3月,江苏多地育肥羊出现呼吸道症状为主的疾病。采集不同发病场鼻拭子和血清样品,检测呼吸道相关病原,在大部分样品中检测到副流感病毒3型。将阳性病料接种于MDBK细胞,连续传代5代,经RT-PCR和血凝试验检测证实分离... 详细信息

2013年下半年至2014年3月,江苏多地育肥羊出现呼吸道症状为主的疾病。采集不同发病场鼻拭子和血清样品,检测呼吸道相关病原,在大部分样品中检测到副流感病毒3型。将阳性病料接种于MDBK细胞,连续传代5代,经RT-PCR和血凝试验检测证实分离到病毒,命名为JS2013。扩增完整的M基因,进行进化分析表明该毒株不同于牛和人副流感病毒3型,具有独特的基因特征。这是国内外首次报道山羊源副流感病毒3型的分离鉴定。

关键词：副流感病毒3型山羊呼吸道疾病 M基因进化分析

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副猪嗜血杆菌病疫苗新制苗菌株FS0307的毒力和OMP P5基因研究

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中国兽医学报 2015年第4期35卷 565-568页

作者：王占伟周勇岐王丽刘茂军邵国青江苏省农业科学院兽医研究所/农业部兽用生物制品工程技术重点实验室/国家兽用生物制品工程技术研究中心江苏南京210014 南京天邦生物科技有限公司江苏南京210012

为了进一步研究副猪嗜血杆菌FS0307株的特性,本研究对该菌株的外膜蛋白P5基因进行测序分析,并进行其对豚鼠的致病力研究。结果显示,Hps FS0307株的序列与相同血清型的国际标准株SW124的同源性为98.3%,与多数国内分离株的同源性在98%以上... 详细信息

为了进一步研究副猪嗜血杆菌FS0307株的特性,本研究对该菌株的外膜蛋白P5基因进行测序分析,并进行其对豚鼠的致病力研究。结果显示,Hps FS0307株的序列与相同血清型的国际标准株SW124的同源性为98.3%,与多数国内分离株的同源性在98%以上,与美国分离株2170B的同源性为95.6%,而与3株其他血清型国际标准株的同源性在89.5%~95.1%之间;遗传系统进化树显示与4型国内分离株SC085(HM747106)在同一分支上。且能引起豚鼠100%发病,100%死亡。说明Hps FS0307株与国内流行菌株更相似,是1株优良的副猪嗜血杆菌病疫苗的制苗菌株。

关键词：副猪嗜血杆菌 FS0307株外膜蛋白P5基因毒力

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某规模猪场猪瘟抗体水平的监测与分析

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江苏农业科学 2015年第11期43卷 299-300页

作者：赵永前左建新孙华伟茅爱华蒋晨慧张敬峰江苏省农业科学院兽医研究所/农业部兽用生物制品工程技术重点实验室/国家兽用生物制品工程技术研究中心江苏南京210014 江苏省涟水县畜牧兽医站江苏涟水223400

为监测分析生产母猪群的猪瘟抗体水平,合理制定猪瘟疫苗免疫方案,对某规模猪场1栋29头断奶母猪在猪瘟疫苗免疫前、免疫后30 d的血清样品进行检测。结果表明:免疫前、后的抗体阳性率分别为75.9%、93.1%,大部分生产母猪在疫苗免疫30 d后... 详细信息

为监测分析生产母猪群的猪瘟抗体水平,合理制定猪瘟疫苗免疫方案,对某规模猪场1栋29头断奶母猪在猪瘟疫苗免疫前、免疫后30 d的血清样品进行检测。结果表明:免疫前、后的抗体阳性率分别为75.9%、93.1%,大部分生产母猪在疫苗免疫30 d后抗体水平有所提升,但仍有6.9%的生产母猪在加强免疫后,抗体水平仍为阴性;对采样血清进行猪瘟病原检测,PCR检测结果表明:加强免疫后抗体为阴性的2份血清为阳性,其余血清全部为阴性。

关键词：猪瘟抗体免疫监测

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猪Viperin主要抗原区的原核表达及多克隆抗体的制备

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畜牧与兽医 2015年第10期47卷 82-85页

作者：李文良韩林晓毛立杨蕾蕾张纹纹江杰元江苏省农业科学院兽医研究所/农业部兽用生物制品工程技术重点实验室/国家兽用生物制品工程技术研究中心江苏南京210014 南京农业大学动物医学院江苏南京210095

采用PCR方法扩增猪Viperin蛋白主要抗原区基因,克隆入原核表达载体p ET32a,转化大肠杆菌BL21构建重组表达菌,经IPTG诱导表达重组蛋白,SDS-PAGE鉴定蛋白得到表达,分子质量约为40 ku。进一步优化蛋白表达条件为:IPTG终浓度为0.6 mmol/L,诱... 详细信息

采用PCR方法扩增猪Viperin蛋白主要抗原区基因,克隆入原核表达载体p ET32a,转化大肠杆菌BL21构建重组表达菌,经IPTG诱导表达重组蛋白,SDS-PAGE鉴定蛋白得到表达,分子质量约为40 ku。进一步优化蛋白表达条件为:IPTG终浓度为0.6 mmol/L,诱导5 h。采用His标签单抗对重组蛋白进行Western blot鉴定表明蛋白具有良好的抗原性。将蛋白质纯化后免疫新西兰大白兔,间隔14 d免疫4次,并采集血清。用间接ELISA方法测定血清抗体效价,结果表明,经过4次免疫血清抗体效价达到1∶409600,间接免疫荧光检测出现特异荧光,表明其能与Viperin蛋白发生反应。本试验为研究Viperin的功能、建立特异的检测方法奠定了基础。

关键词： Viperin 原核表达多克隆抗体猪

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自动测温技术用于猪瘟活疫苗兔体热型判定研究

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中国兽医学报 2015年第10期35卷 1668-1673页

作者：王丰冯志新还红华张渊魁张元鹏郝飞林志坤蒋松邵国青江苏省农业科学院兽医研究所/农业部兽用生物制品工程技术重点实验室/国家兽用生物制品工程技术研究中心江苏南京210014 福州大北农生物技术有限公司福建福州350014 南京天邦生物科技有限公司江苏南京211102

比较无线自动测温技术与常规水银体温计对兔子体温检测的符合率合格后,将无线自动测温技术用于猪瘟活疫苗兔体热型反应的测定。研究结果表明,无线自动测温技术与常规水银体温计对兔子体温检测的符合率高达98.81%,温差≤0.5℃,且不受环... 详细信息

比较无线自动测温技术与常规水银体温计对兔子体温检测的符合率合格后,将无线自动测温技术用于猪瘟活疫苗兔体热型反应的测定。研究结果表明,无线自动测温技术与常规水银体温计对兔子体温检测的符合率高达98.81%,温差≤0.5℃,且不受环境温度、湿度的影响,对被检动物安全。临床上分别用TOSHONGTM体温连续远程监测平台与常规水银体温计对96只伊拉兔接种猪瘟兔化弱毒疫苗进行兔体热型反应鉴定,2种测温方法对热型判定结果符合率为87.5%(84/96)。对存在鉴定差异的12只兔子的体温数据进一步分析表明,体温连续远程监测平台因高频率的实时监测,其鉴定结果的准确性与可靠性优于人工监测中的常规水银体温计。

关键词：无线测温技术猪瘟兔体热

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