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中国人兽共患病学报 2017年第11期33卷 962-966页

作者：田瑞雨熊祺琰倪博王佳韦艳娜冯志新邵国青江苏省农业科学院兽医研究所.农业部兽用生物制品工程技术重点实验室.国家兽用生物制品工程技术研究中心南京210014 南京农业大学动物医学院南京210095 省部共建国家重点实验室培育基地 -江苏省食品质量安全重点实验室南京210014 江苏省肉类生产与加工质量安全控制协同创新中心南京210095

目的制备与鉴定猪鼻支原体单克隆抗体,用于猪鼻支原体诊断及致病机理的研究。方法将猪鼻支原体全菌蛋白免疫小鼠,利用杂交瘤技术制备单克隆抗体。鉴定其抗体亚型并对纯化单抗的效价、特异性进行鉴定。将该单抗用于菌落免疫杂交试验、间... 详细信息

目的制备与鉴定猪鼻支原体单克隆抗体,用于猪鼻支原体诊断及致病机理的研究。方法将猪鼻支原体全菌蛋白免疫小鼠,利用杂交瘤技术制备单克隆抗体。鉴定其抗体亚型并对纯化单抗的效价、特异性进行鉴定。将该单抗用于菌落免疫杂交试验、间接免疫荧光试验。结果获得了1株猪鼻支原体单抗,命名为Mhr-08。该单抗的亚型属于IgG1,轻链为κ型。ELISA测定该纯化单抗效价为1∶102 400,Western-blot检测结果表明,该单抗与猪鼻支原体全菌蛋白在43kDa处出现特异性反应条带,与猪其他支原体、大肠杆菌及KM2培养基无交叉反应;该单抗为猪鼻支原体表面膜蛋白抗体,可成功应用于菌落免疫杂交试验;将其用于间接免疫荧光试验可成功检测出黏附于猪气管上皮细胞上的猪鼻支原体。结论成功制备和鉴定出1株猪鼻支原体单克隆抗体,该特异性单抗的获得为猪鼻支原体的诊断及致病机理的研究提供了工具。

关键词：猪鼻支原体单克隆抗体特异性

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鸭抗病毒基因Viperin的克隆、表达及其抗原性研究

鸭抗病毒基因Viperin的克隆、表达及其抗原性研究

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第五届全国禽病分子生物技术青年工作者会议

作者：韩凯凯李银毕可然刘宇卓刘青涛赵冬敏杨婧黄欣梅江苏省农业科学院兽医研究所农业部兽用生物制品工程技术重点实验室国家兽用生物制品工程技术研究中心江苏南京210014

Viperin是一种由Ⅰ型和Ⅱ型干扰素诱导的宿主蛋白,广泛存在于低等生物到哺乳动物体内,在进化上高度保守.本研究以鸭外周血淋巴细胞为原材料,通过RT-PCR扩增得到完整开放阅读框的基因序列,成功亚克隆并构建了真核表达载体pEGFP-N1-viper... 详细信息

Viperin是一种由Ⅰ型和Ⅱ型干扰素诱导的宿主蛋白,广泛存在于低等生物到哺乳动物体内,在进化上高度保守.本研究以鸭外周血淋巴细胞为原材料,通过RT-PCR扩增得到完整开放阅读框的基因序列,成功亚克隆并构建了真核表达载体pEGFP-N1-viperin,并转染至DF-1细胞,用坦布苏病毒攻击后,比较转染pEGFP-N1-viperin质粒与转染空载体组,病毒在细胞中的增殖情况.结果表明:鸭Viperin基因开放阅读框有1092bp,编码蛋白由363个氨基酸构成.转染结果显示,构建的pEGFP-N1-viperin真核表达质粒在DF-1细胞中成功表达.坦布苏病毒攻击后,与转染空载体组相比,转染pEGFP-N1-vi-perin可以显著抑制坦布苏病毒在DF-1细胞上的增殖.这表明鸭viperin作为抗病毒蛋白,具有良好的抑制坦布苏病毒增殖的作用.综上,本试验为进一步研究鸭viperin的抗病毒生物学功能奠定了良好的基础.

关键词：鸭坦布苏病毒病毒感染抗病毒基因基因克隆基因表达抗原性

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H9N2亚型禽流感病毒感染对鸡的免疫抑制机理研究

H9N2亚型禽流感病毒感染对鸡的免疫抑制机理研究

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第五届全国禽病分子生物技术青年工作者会议

作者：刘青涛李银韩凯凯赵冬敏刘宇卓黄欣梅杨婧刘娜江苏省农业科学院兽医研究所农业部兽用生物制品工程技术重点实验室国家兽用生物制品工程技术研究中心江苏南京210014

H9N2亚型禽流感病毒感染可导致鸡的疫苗免疫失败,但该病毒对鸡的免疫抑制机理目前仍不清楚.本研究的结果显示,H9N2病毒感染可降低鸡对鸡新城疫、传染性支气管病毒活疫苗的抗体应答,但与对照组相比差异并不显著;而对外周血淋巴细胞的亚... 详细信息

H9N2亚型禽流感病毒感染可导致鸡的疫苗免疫失败,但该病毒对鸡的免疫抑制机理目前仍不清楚.本研究的结果显示,H9N2病毒感染可降低鸡对鸡新城疫、传染性支气管病毒活疫苗的抗体应答,但与对照组相比差异并不显著;而对外周血淋巴细胞的亚群分析显示,与对照组相比H9N2病毒感染可显著降低鸡外周血中CD4+和CD8+T淋巴细胞的比率;并且,H9N2病毒感染鸡外周血T淋巴细胞的增殖活性与对照鸡相比显著下降(P＜0.05);另外,H9N2病毒感染还导致了鸡血清中的IFN-γ和IL-4应答水平的下降,其中IFN-γ的应答水平与对照组相比差异显著(P＜0.05).以上结果说明,H9N2病毒感染可抑制鸡对疫苗的免疫应答,并且对细胞免疫应答的抑制更为明显.

关键词：鸡禽流感病毒病毒感染免疫抑制机理

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肝片吸虫Fh8明显增强STEC的Stx1可溶性表达及Stx1单克隆抗体制备

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华北农学报 2016年第5期31卷 44-49页

作者：张雪寒张碧成张强汪伟何孔旺江苏省农业科学院兽医研究所农业部兽用生物制品工程技术重点实验室国家兽用生物制品工程技术研究中心江苏南京210014

志贺毒素1（Shiga toxin 1,Stx1）,系五聚体蛋白,是产志贺毒素性大肠杆菌（Shiga Toxin-producing Escherichia coli,STEC）主要的毒素因子,但Stx1体外极不易可溶性表达,旨在克隆和表达志贺毒素1（Shiga toxin 1,Stx1）A亚基,体外获得... 详细信息

志贺毒素1（Shiga toxin 1,Stx1）,系五聚体蛋白,是产志贺毒素性大肠杆菌（Shiga Toxin-producing Escherichia coli,STEC）主要的毒素因子,但Stx1体外极不易可溶性表达,旨在克隆和表达志贺毒素1（Shiga toxin 1,Stx1）A亚基,体外获得可溶性表达的Stx1,以研制单克隆抗体。生物信息学软件分析Stx1A亚基氨基酸序列,Stx1A1亚基N端为信号肽段,其C端高疏水性和低免疫原性。PCR扩增stx1A亚基73~759的687个核苷酸,与肝片吸虫Fh8基因串联,克隆到低温表达载体p ColdⅠ以构建重组菌,诱导表达重组毒素His-Fh8-Stx1A,SDS-PAGE分析蛋白表达形式。重组毒素His-Fh8-Stx1A免疫Balb/c小鼠,Sp2/0细胞融合筛选、制备阳性杂交瘤和单克隆抗体。PCR扩增Fh8和stx1a亚基并构建重组质粒p ColdⅠ-His-Fh8-stx1,重组蛋白在原核细胞中得到高效表达,且以可溶性形式存在于菌体胞浆中。以重组His-Fh8-Stx1A为免疫原,成功制备3株能稳定传代并分泌Stx1的单克隆抗体（Mc Ab）的杂交瘤细胞株,取其中1株成功制备高ELISA效价的腹水。Western Blot显示,纯化的单克隆抗体可与重组免疫原His-Stx1A和天然志贺毒素1发生特异性反应。本试验成功可溶性表达志贺毒素1A亚基,并获得多株单克隆抗体,为研制用于检测STEC的夹心ELISA和胶体金试纸条奠定理论基础。

关键词：产志贺毒素大肠杆菌志贺毒素1 肝片吸虫 Fh8 可溶性表达单克隆抗体

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11株H9N2亚型禽流感病毒神经氨酸酶基因遗传分析

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南京农业大学学报 2016年第1期39卷 150-155页

作者：黄欣梅李银赵冬敏刘宇卓杨婧韩凯凯江苏省农业科学院兽医研究所/农业部兽用生物制品工程技术重点实验室/国家兽用生物制品工程技术研究中心江苏南京210014

[目的]本文旨在了解H9N2亚型禽流感病毒神经氨酸酶（NA）基因的遗传特点和变异情况。[方法]选择2008—2013年从江苏、安徽和浙江省家禽中分离的11株H9N2亚型禽流感病毒,用RT-PCR方法对NA基因片段进行扩增、克隆和序列测定,并对其核苷酸... 详细信息

[目的]本文旨在了解H9N2亚型禽流感病毒神经氨酸酶（NA）基因的遗传特点和变异情况。[方法]选择2008—2013年从江苏、安徽和浙江省家禽中分离的11株H9N2亚型禽流感病毒,用RT-PCR方法对NA基因片段进行扩增、克隆和序列测定,并对其核苷酸序列及推导的氨基酸序列进行同源性及遗传进化分析。[结果]11株毒株的NA基因核苷酸和推导的氨基酸同源性分别为86.2%~99.5%和86.9%~99.1%,均属于欧亚分支。其中9株鸡源毒株属于Y280-like亚系,在NA蛋白颈部63~65位点缺失了3个氨基酸;2株鸭源毒株属于G1-like亚系,在颈部39~40位点缺失了2个氨基酸。11株分离株除了69、146、200、234位点处潜在的N-糖基化位点比较保守以外,其余的糖基化位点都出现了变异情况。红细胞结合位点（HB）在431~433位点区域比较保守,但在366~373和399~404位点区域的氨基酸发生了明显的变异。抗原决定簇中部分氨基酸序列变异也较为活跃,推测与使用疫苗后的抗体选择有关。NA蛋白酶活性位点处的氨基酸非常保守,没有发生与抗神经氨酸酶抑制剂相关的氨基酸突变。[结论]江苏、安徽、浙江等省养殖鸡群中的H9N2亚型禽流感病毒仍以Y280-like分支较为常见,鸭群中出现G1-like分支应引起人们的注意。NA基因存在一定的变异,应加强对该类病毒的分子流行病学监测。

关键词： H9N2亚型禽流感病毒神经氨酸酶基因遗传分析

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猪肺炎支原体P65蛋白的脂酶活性分析

猪肺炎支原体P65蛋白的脂酶活性分析

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江苏省畜牧兽医学会2017年学术年会

作者：刘茂军王宏恩张悦陈熠夕冯志新熊祺琰张映邵国青江苏省农业科学院兽医研究所/农业部兽用生物制品工程技术重点实验室/国家兽用生物制品工程技术研究中心江苏南京 210014 江苏省农业科学院兽医研究所/农业部兽用生物制品工程技术重点实验室/国家兽用生物制品工程技术研究中心江苏南京 210014 山西农业大学动物科技学院山西太谷030801 山西农业大学动物科技学院山西太谷030801

虽然支原体是富含酶类,但是支原体是一种脂肪酸营养缺陷型菌,脂肪酶的存在可能为支原体的生长提供长链脂肪酸.猪肺炎支原体(Mycoplasma hyopneumoniae,Mhp)的P65 脂蛋白是其主要免疫源性的蛋白,P65 蛋白主要通过破坏宿主肺泡细胞的表面... 详细信息

虽然支原体是富含酶类,但是支原体是一种脂肪酸营养缺陷型菌,脂肪酶的存在可能为支原体的生长提供长链脂肪酸.猪肺炎支原体(Mycoplasma hyopneumoniae,Mhp)的P65 脂蛋白是其主要免疫源性的蛋白,P65 蛋白主要通过破坏宿主肺泡细胞的表面张力来降低宿主细胞的稳定性,导致肺脏功能性障碍.同时p65 蛋白具有脂肪酶活性,能够促进脂肪分解,可为猪Mhp 生长提供必需的短链脂肪酸.Mhp 168 强弱毒株具有不同的毒力,推测脂酶在其中其一定作用.因此,我们分析了Mhp 的脂酶活性,并对P65 蛋白的脂酶活性进行了分析.对Mhp 168 强弱毒株培养物进行离心收获,冻融裂解,获得了全菌蛋白.用脂肪酶特异性底物4-硝基苯基棕榈酸酯(4-Nitrophenyl palmitate),通过反应液和底物浓度等优化,建立了脂酶活性测定的酶学方法.应用该方法对Mhp 168 强弱毒株全菌蛋白进行酶学分析,发现Mhp 168 强毒株的脂酶活性高于弱毒株,且呈剂量依赖关系.从猪肺炎支原体基因组中扩增P65 基因,构建了原核表达载体,转化大肠杆菌,结果获得了重组表达的Mhp P65 蛋白.应用酶学测定方法测定了P65 的脂酶活性,pH 和温度对脂酶活性的影响.结果显示,重组表达的Mhp P65 蛋白具有脂酶活性,pH 8.0 和37℃是其最适反应条件.本研究证实Mhp 168 强毒株的脂酶活性高于弱毒株,且Mhp 的重组P65 蛋白也具有脂肪酶活性,提示P65 蛋白在Mhp的致病中具有一定作用,为该病原的致病因子研究提供了基础.

关键词：猪肺炎支原体 P65蛋白脂酶活性

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猪伪狂犬病毒变异株AH02LA单因子发病模型的建立

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中国动物检疫 2017年第4期34卷 86-89页

作者：毛爱民范锋王继春冯志新华利忠刘剑锋无锡市动物疫病预防控制中心江苏无锡214016 江苏省农业科学院兽医研究所农业部兽用生物制品工程技术重点实验室国家兽用生物制品工程技术研究中心江苏南京210014 南京农业大学江苏南京210014

2011年以来,猪伪狂犬病毒(PRV)变异株在我国多地区流行,造成了严重的经济损失。本研究以主要猪病病原为阴性的仔猪为基础,建立了PRV变异株AH02LA单因子发病模型,并研究了其主要病理学变化。研究发现PRV会引起仔猪非化脓性脑炎,这一病理... 详细信息

2011年以来,猪伪狂犬病毒(PRV)变异株在我国多地区流行,造成了严重的经济损失。本研究以主要猪病病原为阴性的仔猪为基础,建立了PRV变异株AH02LA单因子发病模型,并研究了其主要病理学变化。研究发现PRV会引起仔猪非化脓性脑炎,这一病理变化将有助于猪伪狂犬病的临床快速准确诊断。

关键词：猪伪狂犬病毒变异株发病模型病理学猪

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兔出血症病毒衣壳蛋白P区二聚体的表达及其与受体结合能力分析

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畜牧兽医学报 2016年第2期47卷 325-330页

作者：胡波范志宇王芳魏后军宋艳华仇汝龙徐为中薛家宾江苏省农业科学院兽医研究所.农业部兽用生物制品工程技术重点实验室.国家兽用生物制品工程技术研究中心南京210014

为检测兔出血症病毒(RHDV)衣壳蛋白(VP60)P区形成二聚体的能力及其与HBGAs受体结合的能力,作者以pMD19T-VP60为模板扩增包含铰链区H的P区基因(HP)并克隆至原核表达载体pET28a(+)中,转化大肠杆菌BL21(DE3)菌株,经IPTG诱导表达,获得HP蛋... 详细信息

为检测兔出血症病毒(RHDV)衣壳蛋白(VP60)P区形成二聚体的能力及其与HBGAs受体结合的能力,作者以pMD19T-VP60为模板扩增包含铰链区H的P区基因(HP)并克隆至原核表达载体pET28a(+)中,转化大肠杆菌BL21(DE3)菌株,经IPTG诱导表达,获得HP蛋白。经SDS-PAGE和Western blot检测,结果显示,HP蛋白主要以包涵体的形式高效表达,经HisTrap亲和柱纯化后可形成二聚体结构。通过HBGAs受体结合试验表明,P区与完整病毒衣壳相似,能与唾液中的HBGAs受体发生结合。本研究为进一步开展RHDV衣壳蛋白与受体的相互作用研究奠定基础。

关键词：兔出血症病毒衣壳蛋白 P区组织血型抗原受体结合

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猪传染性胃肠炎病毒分离株JS2012全基因组序列分析

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江苏农业学报 2016年第6期32卷 1351-1358页

作者：郭容利李彬范宝超温立斌茅爱华周萍何孔旺江苏省农业科学院兽医研究所/农业部兽用生物制品工程技术重点实验室/国家兽用生物制品工程技术研究中心江苏南京210014

设计32对PCR引物分片段扩增猪传染性胃肠炎病毒（TGEV）江苏分离株JS2012全基因组,扩增产物克隆到p MD19-T载体并测序。用DNAstar软件将JS2012全基因组序列与Gen Bank中其他13株TGEV株和猪呼吸道冠状病毒（PRCV-ISU-1）序列进行比对以... 详细信息

设计32对PCR引物分片段扩增猪传染性胃肠炎病毒（TGEV）江苏分离株JS2012全基因组,扩增产物克隆到p MD19-T载体并测序。用DNAstar软件将JS2012全基因组序列与Gen Bank中其他13株TGEV株和猪呼吸道冠状病毒（PRCV-ISU-1）序列进行比对以及同源性分析,并绘制基因进化树。JS2012基因组序列全长28 542 bp,不包括poly A。基因组的排列为TGEV典型的基因排列序：5＇-ORF1a-ORF1b-S-3a-3b-E-M-N-7-3＇。TGEV JS2012株的ORF3基因和Miller组病毒一样有2个大片段的缺失。JS2012的S基因和Miller M6以及Virulent Purdue 2个强毒株有同样的序列特征。除Virulent Purdue外,其余Purdue株在1 123~1 128 bp处均有6 bp的缺失,JS2012与所有Miller株及Virulent Purdue一样,此处没有缺失。JS2012与其他TGEV毒株之间的碱基序列同源性为98.6%-99.9%,与Miller M6的碱基序列同源性最高,亲缘关系最近,同属于Miller组,与Purdue组相对较远。

关键词：猪传染性胃肠炎病毒(TGEV) 全基因组序列分析

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猪肺炎支原体168株感染诱导差异表达蛋白的筛选及鉴定

猪肺炎支原体168株感染诱导差异表达蛋白的筛选及鉴定

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江苏省畜牧兽医学会2017年学术年会

作者：王宏恩邵国青冯志新熊祺琰于岩飞张映辛九庆刘茂军江苏省农业科学院兽医研究所/农业部兽用生物制品工程技术重点实验室/国家兽用生物制品工程技术研究中心江苏南京210014 山西农业大学动物科技学院山西太谷030801 江苏省农业科学院兽医研究所/农业部兽用生物制品工程技术重点实验室/国家兽用生物制品工程技术研究中心江苏南京210014 山西农业大学动物科技学院山西太谷030801 中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室黑龙江哈尔滨150069

猪肺炎支原体(Mycoplasma hyopneumoniae,Mhp)是引起猪支原体肺炎Mycoplasma pneumoniae of Swine,MPS)的主要致病菌.毒力相关因子在支原体的感染与致病中扮演着十分重要的角色,但目前对毒力因子知之甚少.本研究通过对感染前后猪肺炎支... 详细信息

猪肺炎支原体(Mycoplasma hyopneumoniae,Mhp)是引起猪支原体肺炎Mycoplasma pneumoniae of Swine,MPS)的主要致病菌.毒力相关因子在支原体的感染与致病中扮演着十分重要的角色,但目前对毒力因子知之甚少.本研究通过对感染前后猪肺炎支原体168 强毒株进行差异蛋白质组学分析,筛选出一些可能的毒力因子.试验首先用猪肺炎支原体168 强毒株体外感染猪气管上皮细胞(STEC),根据上清支原体含量来筛选出适宜的感染时间.结果显示,与其他感染条件相比,感染剂量为1×108,感染时间为48h 时上清中支原体含量最多.根据筛选出的感染剂量及感染时间进一步感染,利用双向电泳技术(Two-dimensionalElectrophoresis,2-DE)对感染前后的全菌蛋白进行分离,PDQuest V8.0 软件对扫描所得图像进行分析(T 检验法,差异＞1.5 倍),强毒株感染组与对照组蛋白点进行比对分析后,发现了11 个差异蛋白,经过质谱鉴定7 个为支原体蛋白,其中3 个只出现在感染组中,4 个在感染后表达上调.从这些差异蛋白点中选择了甘油醛-3-磷酸脱氢酶(GAPDH)进行了Western-blot 验证,结果显示,GAPDH 蛋白在强毒株感染后表达上调,与双向电泳结果一致.

关键词：猪肺炎支原体168株双向电泳差异蛋白 Western-blot

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