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华北农学报 2018年第5期33卷 106-110页

作者：刘娜刘青涛李银杨婧李祥瑞江苏省农业科学院兽医研究所农业部动物疫病诊断与免疫重点开放实验室国家兽用生物制品工程技术研究中心江苏南京210014 南京农业大学动物医学院江苏南京210095

通过原核表达的方法得到血清4型禽腺病毒的主要结构蛋白六邻体蛋白;根据GenBank中血清4型禽腺病毒六邻体蛋白的基因序列,设计一对特异性引物,利用普通PCR方法扩增得到hexon基因的全长序列。将PCR扩增得到的血清4型禽腺病毒六邻体基因片... 详细信息

通过原核表达的方法得到血清4型禽腺病毒的主要结构蛋白六邻体蛋白;根据GenBank中血清4型禽腺病毒六邻体蛋白的基因序列,设计一对特异性引物,利用普通PCR方法扩增得到hexon基因的全长序列。将PCR扩增得到的血清4型禽腺病毒六邻体基因片段,在其两端插入酶切位点后克隆至载体pMD18T中,经PCR鉴定和测序分析正确后,与原核表达载体pET-32 a进行连接,构建pET-32 a-hexon原核表达载体,并对其进行双酶切和测序鉴定。将构建成功的表达载体转化至BL21(DE3)中,用1 mmol/L的IPTG进行诱导表达,对得到的重组蛋白进行SDS-PAGE分析和Western Blot鉴定;经双酶切鉴定和测序鉴定,pET-32a-hexon原核表达载体构建成功,插入的六邻体蛋白基因片段大小为2 814 bp,在1 mmol/L浓度IPTG诱导3 h时重组蛋白表达量最高,且重组蛋白主要以包涵体形式存在于沉淀中。SDS-PAGE分析结果显示,融合蛋白分子量为118 ku。免疫印迹分析结果显示,融合蛋白可被抗FAdV-4的血清和HIS标签抗体特异性识别;成功表达了血清4型禽腺病毒的主要结构蛋白六邻体蛋白,且得到的重组蛋白具有良好的反应原性,可用于血清4型禽腺病毒的进一步研究中,为血清4型禽腺病毒病的预防和治疗奠定了良好的基础。

关键词：血清4型禽腺病毒六邻体蛋白原核表达

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H9N2亚型禽流感病毒对鸡的免疫抑制机制

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江苏农业学报 2018年第2期34卷 368-373页

作者：刘青涛李银刘娜杨婧韩凯凯刘宇卓赵冬敏黄欣梅田宇杰江苏省农业科学院兽医研究所/农业部动物疫病诊断与免疫重点开放实验室/国家兽用生物制品工程技术研究中心江苏南京210014 南京农业大学动物医学院江苏南京210095 贵州大学动物科学学院贵州贵阳550025

通过评价H9N2亚型禽流感病毒(AIVs)感染对于鸡新城疫和传染性支气管炎活疫苗免疫效力的影响,研究了H9N2 AIVs的免疫抑制机理。结果显示,H9N2 AIVs感染可降低鸡对鸡新城疫和传染性支气管炎活疫苗的抗体应答,但与对照组相比差异并不显著;... 详细信息

通过评价H9N2亚型禽流感病毒(AIVs)感染对于鸡新城疫和传染性支气管炎活疫苗免疫效力的影响,研究了H9N2 AIVs的免疫抑制机理。结果显示,H9N2 AIVs感染可降低鸡对鸡新城疫和传染性支气管炎活疫苗的抗体应答,但与对照组相比差异并不显著;而流式分析结果显示,与对照组相比H9N2 AIVs感染可显著降低鸡外周血中CD4+T淋巴细胞和CD8+T淋巴细胞的比率(P<0.05);抗原特异性的T淋巴细胞增殖试验结果显示,与对照组相比H9N2 AIVs感染鸡的外周血T淋巴细胞增殖活性显著下降(P<0.05);另外,H9N2 AIV感染还导致鸡血清中细胞因子IFN-γ和IL-4应答水平的下降,其中IFN-γ的应答水平与对照组相比差异显著(P<0.05)。说明H9N2 AIVs感染可抑制鸡的免疫应答,其中对细胞免疫应答的抑制更为明显。

关键词： H9N2亚型禽流感病毒鸡免疫抑制

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稳定表达LamR的RK13细胞系的建立及RHDV感染性的初步研究

稳定表达LamR的RK13细胞系的建立及RHDV感染性的初步研究

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中国畜牧兽医学会养兔学分会第二届学术交流大会

作者：黄萍胡波宋艳华范志宇魏后军仇汝龙薛家宾王芳江苏省农业科学院兽医研究所农业部动物疫病诊断与免疫重点开放实验室·国家兽用生物制品工程技术研究中心

兔出血症(Rabbit hemorrhagic disease,RHD)是由兔出血症病毒(Rabbit hemorrhagic disease virus,RHDV)引起的一种急性、烈性病毒性传染病,具有高发病率和高死亡率等特征,给我国乃至世界养兔业造成了重大威胁。一直以来RHDV难以在体外培... 详细信息

兔出血症(Rabbit hemorrhagic disease,RHD)是由兔出血症病毒(Rabbit hemorrhagic disease virus,RHDV)引起的一种急性、烈性病毒性传染病,具有高发病率和高死亡率等特征,给我国乃至世界养兔业造成了重大威胁。一直以来RHDV难以在体外培养,极大阻碍了对该病毒致病机制的深入研究。病毒受体是病毒侵入宿主细胞的主要门户,病毒与宿主细胞上的受体特异性结合后侵入细胞,进而组装释放新的病毒颗粒感染其他细胞得以增殖。受体研究可揭示病毒与宿主之间的作用机制,因此成为研究者关注的焦点。本实验室前期研究结果显示RHDV农壳蛋白VP60 P2亚区的高变区与层黏连蛋白受体(LamR)蛋白存在直接的相互作用,提示LamR蛋白在病毒吸附入侵宿主细胞过程中可能发挥着重要作用。本研究目的为了探究LamR对RHDV吸附与入侵等的影响,本实验首先将完整的LamR序列通过同源重组法克隆入慢病毒表达质粒pLVX-mCherry-N1。将该质粒与慢病毒包装质粒pLP1、pLP2和pLp-VSV/G共转染到293T细胞,包装成含LamR基因的重组慢病毒。将收获的慢病毒在Polybrene的介导下感染RKl3细胞,采用嘌呤霉素筛选筛选出l株能稳定表达的细胞系,命名为RKl3-LamR。经免疫荧光和Western blotting检测,结果显示该细胞株能够稳定表达LamR蛋白,成功构建了稳定表达LamR蛋白的RK13细胞系。另外,为研究RHDV对RK13-LamR的感染性,本实验用RHDV接种正常RKl3细胞与RKl3-LamR细胞系,采用间接免疫荧光法检测RHDV对细胞的吸附作用;通过对RHDV接种量的优化,选择合适的病毒量接种RKl3细胞和RKl3-LamR细胞,并收集接种RHDV后不同时间点的细胞样品,采用血凝试验(HA)测定病毒的HA效价;通过qRT-PCR反应,进一步检测RHDV在RKl3-LamR细胞中的复制情况。结果表明,LamR蛋白可以促进RHDV对RK13细胞的吸附,但并未检测到病毒在细胞内的复制和增殖,说明层粘连蛋白可能是RHDV感染肝细胞过程中的一个受体,这为进一步研究RHDV对肝细胞的入侵及RHDV的致病机理提供了重要的线索。

关键词： RHDV 慢病毒载体 LamR RK13细胞吸附

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兔出血症病毒杆状病毒载体灭活疫苗临床免疫效力试验

兔出血症病毒杆状病毒载体灭活疫苗临床免疫效力试验

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中国畜牧兽医学会养兔学分会第二届学术交流大会

作者：范志宇胡波魏后军宋艳华薛家宾姜平王芳江苏省农业科学院兽医研究所农业部动物疫病诊断与免疫重点开放实验室.国家兽用生物制品工程技术研究中心南京农业大学

本研究依据农业部兽用生物制品临床试验批件对南京某公司中试生产的3批次兔出血症病毒杆状病毒载体灭活疫苗（BAC-VP60株）在六家养殖场对不同品种、不同日龄家兔进行免疫,通过疫苗注射后的临床观察、攻毒保护试验等开展该疫苗免疫期内... 详细信息

本研究依据农业部兽用生物制品临床试验批件对南京某公司中试生产的3批次兔出血症病毒杆状病毒载体灭活疫苗（BAC-VP60株）在六家养殖场对不同品种、不同日龄家兔进行免疫,通过疫苗注射后的临床观察、攻毒保护试验等开展该疫苗免疫期内免疫效力等相关研究工作。选择35～42日龄幼兔、2月龄健康家兔,使用批号2013002中试产品分别在江苏A兔场、浙江A兔场、江苏C兔场和浙江B兔场进行免疫,使用批号2013003中试产品在山东A兔场进行免疫,使用批号2013004中试产品在江苏B兔场进行免疫;使用批号129083同类疫苗分别在六家兔场进行免疫;同时有一定数量的不同日龄家兔留作对照兔,皮下注射灭菌生理盐水。在注射后第150、210日分别在六家试验兔场随机选择中试产品和同类疫苗免疫家兔及对照兔,5只/组/批/次,采用攻毒法进行效力检验。对六家临床试验兔场家兔,免疫后每隔1个月进行一次血液采集,分离血清,使用血凝抑制（HI）方法和ELISA方法进行抗体检测。结果显示,使用中试产品相继在六家养殖场共免疫家兔26133只,其中幼兔24313只、2月龄兔1820只,家兔在试验期间均未发生兔出血症。攻毒结果显示,中试产品疫苗对不同品种家兔可产生7个月的保护。同类疫苗对不同品种的家兔可产生6个月的保护。抗体检测结果显示,7个月内家兔血清抗体HI效价和OD值均维持在较高水平,不同批次疫苗免疫兔血清抗体水平没有显著差异。结论:兔出血症病毒杆状病毒载体灭活疫苗（BAC-VP60株）中试产品可以保护免疫兔场不发生兔出血症,免疫期为7个月,临床效力检验合格。该疫苗于2017年2月获得国家一类新兽药注册证书（[2017]新兽药证字06号）,该疫苗也必将替代兔病毒性出血症组织灭活疫苗,在兔出血症的免疫防控中起到重要作用。

关键词：兔出血症病毒杆状病毒载体灭活疫苗效力免疫期

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一株新型家兔肠炎沙门氏菌的分离鉴定及其治疗研究

一株新型家兔肠炎沙门氏菌的分离鉴定及其治疗研究

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第七届（2017）中国兔业发展大会

作者：范志宇魏后军仇汝龙胡波宋艳华陈萌萌徐为中王辉薛家宾王芳江苏省农业科学院兽医研究所·农业部动物疫病诊断与免疫重点开放实验室国家兽用生物制品工程技术研究中心

2016年2月至5月期间,山东省某规模化兔场发生以仔兔脾脏肿大,母兔流产为特征的传染病。本研究对发病濒死兔进行细菌的分离,并利用16S rRNA基因扩增技术、特异性PCR方法和生化试验对致病细菌进行鉴定(添加治疗及疫苗相关内容)。结果显示... 详细信息

2016年2月至5月期间,山东省某规模化兔场发生以仔兔脾脏肿大,母兔流产为特征的传染病。本研究对发病濒死兔进行细菌的分离,并利用16S rRNA基因扩增技术、特异性PCR方法和生化试验对致病细菌进行鉴定(添加治疗及疫苗相关内容)。结果显示:分离菌株16S rRNA基因序列与肠炎沙门氏菌相似度均大于99%;分离菌株的培养特性和生化特性符合肠炎沙门氏菌特性;特异性PCR产物序列与肠炎沙门氏菌sefA基因的同源性在99.3%-100%之间,分离菌株命名为:Salmonella SD/2016。动物回归试验成功复制出该病并分离到目的细菌,发病兔场利用敏感药物对该病进行防治,效果明显。(添加疫苗相关内容)。结果表明:本次发病为肠炎沙门氏菌感染。本研究为家兔肠炎沙门氏菌病的诊断与防治奠定了重要基础,提供了有利工具。

关键词：兔肠炎沙门氏菌 16S rRNA基因扩增技术鉴别

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VP60 loop区的突变对RHDV VLP功能的影响

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南京农业大学学报 2016年第2期39卷 297-304页

作者：宋艳华李珊珊王芳胡波范志宇魏后军薛家宾徐为中江苏省农业科学院兽医研究所/农业部动物疫病诊断与免疫重点开放实验室/国家兽用生物制品工程技术研究中心江苏南京210014

[目的]从病毒样颗粒（VLP）的形成、血凝特性以及受体组织血型抗原（HBGA）结合特性方面,分析VP60 loop区在兔出血症病毒（RHDV）VLP功能中的作用。[方法]针对RHDV VP60蛋白的loop区411-417位氨基酸对应的基因设计引物,通过SOE法将411-... 详细信息

[目的]从病毒样颗粒（VLP）的形成、血凝特性以及受体组织血型抗原（HBGA）结合特性方面,分析VP60 loop区在兔出血症病毒（RHDV）VLP功能中的作用。[方法]针对RHDV VP60蛋白的loop区411-417位氨基酸对应的基因设计引物,通过SOE法将411-417位氨基酸等量替换成柔性氨基酸GSGGSGG,获得重组基因VP60-411-417,利用杆状病毒表达系统获得重组病毒r Ac-VP60-411-417。将重组病毒接种Sf9细胞,通过IFA、SDS-PAGE和Western blot等方法证明嵌合蛋白P411-417的表达。通过负染透射电镜观察嵌合蛋白VLP的形成,利用血凝试验分析嵌合蛋白的血凝特性,利用合成多糖结合试验分析嵌合蛋白的受体结合特性。[结果]Western blot、IFA和负染透射电镜试验结果显示,嵌合蛋白P411-417得到有效表达,且能够形成完整的VLP;合成多糖结合试验结果显示,嵌合蛋白能够特异性结合HBGA,但其血凝特性消失。[结论]411-417位氨基酸的突变显著影响RHDV的血凝特性,不影响VLP的形成以及结合HBGA的能力,说明该区域是血凝特性的相关位点,但不是HBGA受体结合的关键位点。

关键词：兔出血症病毒VP60 重叠延伸PCR 嵌合蛋白血凝特性 HBGA受体结合

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坦布苏病毒对小鼠的神经致病力

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江苏农业学报 2016年第3期32卷 619-625页

作者：刘青涛李银黄欣梅韩凯凯赵冬敏刘宇卓杨婧江苏省农业科学院兽医研究所/农业部动物疫病诊断与免疫重点开放实验室/国家兽用生物制品工程技术研究中心江苏南京210014

为评价坦布苏病毒(TMUV)对哺乳动物和人类健康的潜在危害,测定TMUV的增殖能力、神经毒力和神经侵袭力,并对小鼠脑组织进行病理学观察和炎性细胞因子测定,研究TMUV对小鼠的神经致病力。结果显示,TMUV可以在小鼠的脑内进行有效的复制;3日... 详细信息

为评价坦布苏病毒(TMUV)对哺乳动物和人类健康的潜在危害,测定TMUV的增殖能力、神经毒力和神经侵袭力,并对小鼠脑组织进行病理学观察和炎性细胞因子测定,研究TMUV对小鼠的神经致病力。结果显示,TMUV可以在小鼠的脑内进行有效的复制;3日龄和3周龄的小鼠经脑内注射TMUV后,可以导致小鼠的发病和死亡,其半致死剂量分别为1×10^(0.5)ELD_(50)和1×10^(2.5)ELD_(50);3周龄的小鼠经腹腔注射TMUV后,同样可以引起小鼠的死亡,并且可以在脑内检测到病毒;此外,TMUV还在小鼠脑内引起了神经原的变性、炎性细胞的侵润和过度的炎性细胞因子应答。以上结果说明,TMUV可以在小鼠脑内进行有效复制并导致强烈的炎性应答,对小鼠具有较强的神经毒力和侵袭力。因此应该加强TMUV的流行病学监测和防控,防止该病毒的跨种间传播。

关键词：坦布苏病毒小鼠神经致病力

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动物疫病防控与兽医信息技术应用研究进展

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江苏农业学报 2016年第5期32卷 1189-1195页

作者：陆昌华胡肄农何孔旺谭业平郁达威江苏省农业科学院兽医研究所/农业部动物疫病诊断与免疫重点开放实验室/国家兽用生物制品工程技术研究中心江苏南京210014

回顾信息技术在国内外动物疫病防控的应用概况,针对中国兽医信息技术应用的现状及与国外的差距,提出"十三五"期间如何建设具有一定水平,又有中国特色的重大动物疫情应急指挥平台。建议将风险分析与预警预报技术相结合,提高GI... 详细信息

回顾信息技术在国内外动物疫病防控的应用概况,针对中国兽医信息技术应用的现状及与国外的差距,提出"十三五"期间如何建设具有一定水平,又有中国特色的重大动物疫情应急指挥平台。建议将风险分析与预警预报技术相结合,提高GIS系统与风险分析在预警体系中的应用。进一步开展动物疫病综合防控信息化工作,替代传统防疫指挥调度管理方式,给重大动物疫病指挥部门带来一种全新高效的防控指挥模式。利用动物疫病大数据与数据挖掘技术及其模型方法论实现预警决策模型,构建智能化畜产品质量安全管理创新体系。使用大数据处理技术,分析新的数据类型和未充分利用的数据源,为未来智能化远程动物疾病诊断提供技术支撑,有效提高动物疫病防控的信息化管理程度。

关键词：动物疫病防控信息技术

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兔源IL-6基因启动子的克隆及转录调控

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江苏农业科学 2016年第2期44卷 31-34页

作者：刘星宋艳华王芳范志宇胡波魏后军仇汝龙徐为中薛家宾江苏省农业科学院兽医研究所/农业部动物疫病诊断与免疫重点开放实验室/国家兽用生物制品工程技术研究中心江苏南京210014

通过体内感染兔出血症病毒后发现白介素6(Interleukin-6,IL-6)基因表达水平明显升高。为体外研究IL-6启动子的转录调控机制,寻找该基因转录调控的基本转录原件,首先利用染色体步移技术扩增得到兔IL-6基因的启动子区序列,经测序全长为763... 详细信息

通过体内感染兔出血症病毒后发现白介素6(Interleukin-6,IL-6)基因表达水平明显升高。为体外研究IL-6启动子的转录调控机制,寻找该基因转录调控的基本转录原件,首先利用染色体步移技术扩增得到兔IL-6基因的启动子区序列,经测序全长为763 bp;经同源性分析,与人源IL-6基因的启动子高度同源;生物信息学分析发现,该启动子序列含有AP-1、CREB/NF-IL6、NF-κB和TATA-box等转录元件。随后将全长和一系列缺失体的IL-6启动子基因(-400/+58 bp、-250/+58 bp、-170/+58 bp、-100/+58 bp)定向亚克隆至荧光素酶表达载体p GL3-Basic中,构建了含有正确目的基因的报告基因重组体,然后瞬时转录RK-13细胞,利用荧光素酶报告基因检测试剂盒检测。结果显示,本试验所克隆的IL-6基因启动子区具有明显的活性,而且AP-1、CREB/NF-IL6和NF-κB在IL-6基因的转录调控中有着不可或缺的作用。以上结果为进一步研究兔IL-6基因的转录调控机制奠定了基础。

关键词：兔 IL-6基因启动子荧光素酶基因表达载体转录调控

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兔出血症病毒新毒株RHDV2的流行与控制(综述)

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江苏农业科学 2016年第9期44卷 1-3页

作者：王芳陈萌萌宋艳华范志宇胡波魏后军仇汝龙徐为中薛家宾江苏省农业科学院兽医研究所/农业部动物疫病诊断与免疫重点开放实验室/国家兽用生物制品工程技术研究中心江苏南京210014

兔出血症病毒(RHDV)可引起兔病毒性出血症(RHD)。RHD是一种急烈性、高度致死性兔传染病,给家兔养殖业造成巨大经济损失。2010年,研究人员在法国兔场发现一种新型兔出血症病毒RHDV2。与经典RHDV不同,该毒株能够感染幼龄家兔,甚至跨物种... 详细信息

兔出血症病毒(RHDV)可引起兔病毒性出血症(RHD)。RHD是一种急烈性、高度致死性兔传染病,给家兔养殖业造成巨大经济损失。2010年,研究人员在法国兔场发现一种新型兔出血症病毒RHDV2。与经典RHDV不同,该毒株能够感染幼龄家兔,甚至跨物种感染野兔,并突破经典RHDV疫苗的免疫防线,迅速在世界范围内流行。目前我国还未有RHDV2的报道,但随时面临发生该疫情的风险。本文综述RHDV2的病原学、流行病学特征、临床症状、诊断和防控等方面的研究进展,旨在提高对RHDV2的认识,加强对RHDV2的监测,提前做好防控措施。

关键词：兔出血症病毒新毒株跨物种风险防控

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