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Development and Application of a Quantitative Competitive PCR Assay for Detecting Mycoplasma hyopneumoniae

Agricultural Science & Technology 2015年第5期16卷 940-944页

作者：刘茂军李冬梅苏国东周勇岐白方方武昱孜刘蓓蓓邵国青江苏省农业科学院兽医研究所/农业部兽用生物制品工程技术重点实验室/国家兽用生物制品工程技术研究中心江苏南京210014 南京天邦生物科技有限公司江苏南京211102

[Objective] This study aimed to develop a quantitative competitive assay for detecting Mycoplasma hyopneumoniae in culture. [Method] One pair of Mhp-specific primers was designed for detecting Mhp in culture. Another pair of primers was designed based on the conserved gene sequences of Mycoplasma. The competitive template, which carried the same primer binding site with the target fragment, was constructed using enzyme digestion method. [Result] The logarithm of concentration of competitive template was treated as the abscissa（X-axis）, and the logarithm of corrected optical density ratio between amplification products by competitive template and target template was treated as the ordinate（Y-axis）. Thus the standard curve was drawn, and the regression equation was also obtained. When Y was assigned as 0, the concentration of the competitive plate was calculated, and then the concentration of Mhp was deduced. The logarithms of Color change unit（CCU） were treated as the abscissa（X-axis）, and the copy numbers of Mhp were treated as the ordinate（Y-axis）, so the standard curve was generated. It was found that the copy number of Mhp was highly correlated to CCU. [Conclusion] A quantitative competitive PCR assay was successfully established for the rapid detection of Mhp in culture.

关键词： Mycoplasma hyopneumoniae Quantitative competitive PCR

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Establishment and Comparison of Two Taq Man Real-time PCR Methods for PCV2

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Agricultural Science & Technology 2015年第1期16卷 3-8页

作者：周忠涛王小敏汪伟茅爱华温立斌倪艳秀何孔旺江苏省农业科学院兽医研究所农业部兽用生物制品工程技术重点实验室国家兽用生物制品工程技术研究中心江苏南京210014 南京农业大学动物医学院江苏南京210095

[Objective] In this study, the quantitive detection of PCV2 （porcine circovirus type 2） in vitro was achieved. We aimed to establish two kinds of TaqMan real-time PCR methods based on PCV20RF1 and ORF2 respectively and compare them. [Method] According to the relatively＇conserved sequences of PCV20RF1 and ORF2 registered in GenBank, two pairs of specific primers and TaqMan probes were designed and synthesized. Then the recombinant plasmids containing the whole sequences of PCV20RF1 and ORF2 were constructed to draw the standard curves through optimizing the reaction system and conditions. And thus two kinds of TaqMan real-time PCR detection methods based on the whole sequences of ORF1 and ORF2 respectively were constructed for PCV2. [Result] For the two established standard curves, the Ct values showed a good linear relationship with the loga- rithms of copy numbers of templates （F2〉0.99）. The amplification efficiency ranged from 90% to 110%. The amplifications all had a good repeatability with variation coefficients within groups all less than 5%. Moreover, the amplifications all had a good specificity. When the sequences of porcine parvovirus （PPV）, porcine circovirus type 1 （PCV1）, swine pseudorabies virus （PRV）, porcine reproductive and respiratory syndrome virus （PRRSV） were used as templates, the target sequence was not amplified. The amplifications also had a high sensitivity. The ORF1 detection method could reach 1.0x10T copies/;ul, and the ORF2 detection method could reach 1.0×10^2 copies/μl. The two established real-time PCR detection methods were used to detect the 80 clinical samples respectively. The results showed the magnitudes of 72 amplified samples were basically consistent between the 2 detection methods, while the magnitudes of the other 8 amplified samples were inconsistent. Then the 8 samples were detected with SYBR Green I real-time PCR method established based on the sequence of PCV2-1ike factor P1 by Wen et aL The PCV2-1ike factor P1 was ampl

关键词： PCV2 TaaMan real-time PCR ORF1 ORF2 PCV2-1ike factor P1

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猪肺炎支原体强弱毒株感染猪肺上皮细胞损伤差异模型的建立

猪肺炎支原体强弱毒株感染猪肺上皮细胞损伤差异模型的建立

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中国畜牧兽医学会动物传染病学分会第十六次学术研讨会

作者：刘茂军李彦伟武昱孜刘蓓蓓冯志新熊祺琰李桂兰张映邵国青江苏省农业科学院兽医研究所农业部兽用生物制品工程技术重点实验室国家兽用生物制品工程技术研究中心山西农业大学动物科技学院

目的猪肺炎支原体（Mycoplasma hyopneumoniae,Mhp）是引起猪支原体肺炎（Mycoplasma pneumoniae of swine,MPS）的主要病原,其致病机理为特异性的黏附于猪的呼吸道黏膜上皮组织,造成上皮细胞的病变或坏死,引发MPS的发生。本研究利用猪... 详细信息

目的猪肺炎支原体（Mycoplasma hyopneumoniae,Mhp）是引起猪支原体肺炎（Mycoplasma pneumoniae of swine,MPS）的主要病原,其致病机理为特异性的黏附于猪的呼吸道黏膜上皮组织,造成上皮细胞的病变或坏死,引发MPS的发生。本研究利用猪肺炎支原体强弱毒株建立体外感染猪呼吸道上皮细胞差异模型,为分析猪肺炎支原体感染与宿主细胞的应答提供试验模型。材料与方法猪肺炎支原体168株（强毒株）和168L株（弱毒株）由江苏省农业科学院兽医研究所保存。猪肺泡上皮细胞（SJPI）由华中农业大学肖少波教授惠赠。以猪肺炎支原体168株（强毒株）和168L株（弱毒株）体外感染猪肺泡上皮细胞,通过对感染细胞进行NO检测,筛选感染时间和感染剂量,然后利用HO测定、间接免疫荧光（IFA）检测和DAPI染色验证细胞的氧化损伤程度及差异分析。结果与讨论结果显示,在感染时间为36h,感染剂量为5×10～6CCU时,强毒株感染细胞的NO浓度显著高于弱毒株（P<0.05）,同时强弱毒都极显著高于对照组（P<0.01）;HO检测显示强弱毒株感染细胞后HO浓度显著高于对照（P<0.01）,而且强弱毒株之间产生的HO浓度也存在显著性的差异（P<0.05）;IFA拍照可见强毒株在细胞上的黏附量高于弱毒株;DAPI染色表明强毒株对细胞造成的损伤程度也高于弱毒株。结论建立了猪肺炎支原体强弱毒株感染猪肺上皮细胞引起损伤差异模型,为深入探讨猪肺炎支原体致病机理以及以此为基础的早期诊断、疫苗和药物研究提供参考。

关键词：强弱毒株猪肺炎支原体强毒株肺上皮细胞差异模型

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猪肺炎支原体P76蛋白的表达及免疫学特性分析

猪肺炎支原体P76蛋白的表达及免疫学特性分析

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中国畜牧兽医学会动物传染病学分会第十六次学术研讨会

作者：刘茂军王世杰陈熠夕武昱孜熊祺琰冯志新华利忠古少鹏邵国青江苏省农业科学院兽医研究所农业部兽用生物制品工程技术重点实验室国家兽用生物制品工程技术研究中心山西农业大学动物科技学院

目的猪肺炎支原体(Mhp)可引物猪支原体肺炎,危害严重。当前商业疫苗广泛用于控制该病,但只提供部分保护。此外,商品化的ELISA检测试剂盒有特异性高,但灵敏度较低。因此,从病原研究其特异性免疫原性蛋白将为开发更好的血清诊断方法和疫... 详细信息

目的猪肺炎支原体(Mhp)可引物猪支原体肺炎,危害严重。当前商业疫苗广泛用于控制该病,但只提供部分保护。此外,商品化的ELISA检测试剂盒有特异性高,但灵敏度较低。因此,从病原研究其特异性免疫原性蛋白将为开发更好的血清诊断方法和疫苗提供基础。前期研究发现猪肺炎支原体P76蛋白在168强弱毒株中差异表达,因此,本试验表达了P76蛋白,分析其作为免疫检测抗原和疫苗抗原的可能性。材料与方法 Mhp 168、232,NJ,XLW和WX株,猪鼻支原体均由江苏省农业科学院兽医研究所保存。依据Genbank序列设计引物,应用SOE-PCR方法突变了稀有密码子后,克隆入pGEX-4T-1,转化*** BL21(DE3),经IPTG诱导表达重组P76蛋白。用兔抗mhp血清进行Western blot鉴定重组P76蛋白。用重组P76蛋白包被ELISA板建立ELISA抗体检测方法,然后用107份临床猪血清与IDEXX HerdChek的猪肺炎支原体抗体检测试剂盒同时检测,评估其敏感性和特异性。重组P76蛋白皮下注射免疫小鼠,检测抗体评价其免疫原性。结果与讨论成功构建了pGEX-4T-1/P76表达质粒,SDS-PAGE和Western blot结果显示P76重组蛋白得到高效表达,且具有免疫反应性。P76 ELISA结果显示与猪鼻支原体、猪滑液支原体、絮状支原体等没有交叉反应性。P76ELISA与商业化的IDEXX HerdChek同类试剂盒比较结果显示,IDEXX检测阴性的57份血清中,P76ELISA检测阴性42份,IDEXX检测阳性的50份血清中,P76ELISA检测阳性性48份,总符合率84.1%。P76蛋白免疫小鼠后14日即可诱导强烈的免疫反应,ELISA和Western blot检测发现P76免疫小鼠血清可与Mhp 168、232,NJ,XLW和WX株产生反应。结论猪肺炎支原体P76蛋白是一个很好的抗原用,具有用于血清诊断和疫苗的潜能。

关键词：猪肺炎支原体 P76 ELISA 免疫学特性

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双向电泳技术分析猪肺炎支原体168强弱毒株差异蛋白

双向电泳技术分析猪肺炎支原体168强弱毒株差异蛋白

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中国畜牧兽医学会动物传染病学分会第十六次学术研讨会

作者：刘茂军邱明君张映冯志新白方方熊祺琰武昱孜姜俊兵李桂兰邵国青江苏省农业科学院兽医研究所农业部兽用生物制品工程技术重点实验室国家兽用生物制品工程技术研究中心山西农业大学动物科技学院

目的猪肺炎支原体(Mhp)是引起猪支原体肺炎的主要病原,该病是危害世界养猪业的重要疾病之一。目前已发现了Mhp的一些与毒力相关蛋白,但对Mhp强弱毒株中差异蛋白的报道甚少。本试验以Mhp168强弱毒株为材料,利用蛋白组学技术,旨在构建Mhp... 详细信息

目的猪肺炎支原体(Mhp)是引起猪支原体肺炎的主要病原,该病是危害世界养猪业的重要疾病之一。目前已发现了Mhp的一些与毒力相关蛋白,但对Mhp强弱毒株中差异蛋白的报道甚少。本试验以Mhp168强弱毒株为材料,利用蛋白组学技术,旨在构建Mhp168株双向电泳图谱,筛选强弱毒株的差异蛋白,为该病的防控提供理论依据。材料与方法 Mhp168强弱毒株由江苏省农业科学院兽医研究所提供。取Mhp168株强弱毒株新鲜培养物,离心收集菌体,抽提菌体全蛋白,用试剂盒处理样品,测定蛋白质浓度,进行双向电泳(2-DE)。蛋白点进行比对和表达量分析(T检验法,差异>2倍),找出差异蛋白点进行切胶,MALDI-TOF质谱分析。对差异点进行Western-blot验证。结果与讨论采用2-DE技术对来源于同一母本株的猪肺炎支原体168强弱毒株的全菌蛋白进行分离,强毒株凝胶上共检出207±6个蛋白点,弱毒株共检出153±4个蛋白点。强弱毒株的蛋白点进行比对和表达量分析,发现差异点共62个,其中52个仅出现在Mhp168强毒株的图谱上,3个仅出现在Mhp168弱毒株的图谱上;7个蛋白点为强弱毒株图谱所共有,其中3个蛋白点表达上调,4个蛋白点表达下调。在对24个蛋白点进行质谱分析中,成功鉴定比对找到11个,其中4个是血清蛋白,4个为酶类,1个是蛋白前体,1个是假想蛋白,1个是未知蛋白产物(可能未收录于蛋白数据库中)。经Western-blot验证,发现其中的P36蛋白具有较好的免疫原性。结论首次用2-DE技术对同一来源的猪肺炎支原体168强弱毒株的差异蛋白组分析,构建了差异表达图谱,成功鉴定11个差异蛋白,为该病的致病机理和防制奠定了基础。

关键词：强弱毒株强毒株猪肺炎支原体差异蛋白双向电泳技术

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基于物联网监测数据建立动物体温模型

基于物联网监测数据建立动物体温模型

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中国畜牧兽医学会信息技术分会第十届学术研讨会

作者：胡肄农王丰王晨辉江苏省农业科学院兽医研究所农业部兽用生物制品工程技术重点实验室国家兽用生物制品工程技术研究中心南京稻盛弘网络科技有限公司

为探究恒温动物温度变化规律,建立动物体温模型,持续监测动物体表温度,并对温度数据进行分析。首先对原始测量数据进行滤波去噪,其次使用神经网络(NN)和支持向量机回归(SVR)进行温度预测,最后使用SVM分类器进行初步的动物热型曲线探测。

关键词：体温模型物联网监测神经网络支持向量机回归 SVM分类器

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RHDV VLPs对口蹄疫病毒B细胞表位展示效果的研究

RHDV VLPs对口蹄疫病毒B细胞表位展示效果的研究

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中国畜牧兽医学会养兔学分会成立大会暨第一届学术交流大会

作者：胡波盛蓉宋艳华范志宇薛家宾魏后军王芳江苏省农业科学院兽医研究所·农业部兽用生物制品工程技术重点实验室·国家兽用生物制品工程技术研究中心南京农业大学动物医学院

为了研究兔出血症病毒(RHDV)衣壳蛋白VP60作为载体提呈外源表位的能力、分析外源表位的插入对其自身病毒样颗粒形成的影响以及评价VP60作为外源表位展示系统的可行性,本试验以前期构建的含VP60的重组质粒pFastBac1-VP60为模板,分别在VP6... 详细信息

为了研究兔出血症病毒(RHDV)衣壳蛋白VP60作为载体提呈外源表位的能力、分析外源表位的插入对其自身病毒样颗粒形成的影响以及评价VP60作为外源表位展示系统的可行性,本试验以前期构建的含VP60的重组质粒pFastBac1-VP60为模板,分别在VP60氨基酸的C端、N端和306 aa位置插入FMDVVP1双串联B细胞表位[GS-(200～213aa)-GS-(141-160aa)],得到三种重组嵌合VP60杆状病毒质粒。将三种重组质粒传染Sf9昆虫细胞,获得三种嵌合VP60蛋白,分别命名为VP60-2FB、VP60-306FB和VP60-578FB。通过间接免疫荧光(IFA)、蛋白质电泳(SDS-PAGE)和免疫印迹(Western blot)鉴定嵌合VP60蛋白在Sf9细胞中的表达;三种嵌合VP60蛋白经磷钨酸染色后、通过透射电镜观察嵌合蛋白病毒样颗粒(VLPs)的形成情况;三种嵌合VP60蛋白经超滤管纯化浓缩,弗氏佐剂乳化后,各腹腔注射ICR小鼠6只,40μg/只。首免采用弗氏完全佐剂,加强免疫采用弗氏不完全佐剂,同时设立VP60蛋白组、FMDV灭活疫苗组和PBS组对照。采用间接ELISA法检测特异性体液免疫应答水平。结果表明:(1)经IFA、SDSPAGE和Western blot鉴定,三种嵌合蛋白在Sf9细胞中均得到高效表达;(2)通过透射电镜观察,三种嵌合蛋白与VP60一样,均可自聚形成与完整病毒相似的病毒粒子,大小为40nm左右;(3)嵌合蛋白免疫小鼠后可以产生针对VP60特异的免疫应答,且在插入长度为126bp外源基因的情况下,嵌合蛋白免疫的小鼠仍能诱导产生较高水平的针对外源表位(FMDV B细胞表位)的特异性体液免疫应答。综上所述,VP60 VLPs能够有效提呈外源表位,刺激机体对外源B细胞表位产生体液免疫应答,当外源片段大小增加至126bp时,依然不影响VLPs的形成和免疫原性,因此,VP60VLPs可作为异源抗原的展示载体。

关键词：兔出血症病毒病毒样颗粒口蹄疫病毒 B细胞表位载体

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猪支原体肺炎动物发病模型的建立

猪支原体肺炎动物发病模型的建立

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中国畜牧兽医学会动物传染病学分会第十六次学术研讨会

作者：杨若松冯志新华利忠熊祺琰 Hassan Zackaria Ali Ishag 陈财王佳武昱孜刘茂军邵国青江苏省农业科学院兽医研究所农业部兽用生物制品工程技术重点实验室国家兽用生物制品工程技术研究中心张家口市动物疫病预防控制中心

目的猪支原体肺炎是一种由猪肺炎支原体引起的猪的慢性呼吸道传染病,对我国养猪业带来了很大的不良影响,建立可靠的猪肺炎支原体实验动物攻毒模型,是研制新型猪支原体肺炎疫苗和药物的前提,本研究旨在建立一个标准的猪支原体肺炎发病模... 详细信息

目的猪支原体肺炎是一种由猪肺炎支原体引起的猪的慢性呼吸道传染病,对我国养猪业带来了很大的不良影响,建立可靠的猪肺炎支原体实验动物攻毒模型,是研制新型猪支原体肺炎疫苗和药物的前提,本研究旨在建立一个标准的猪支原体肺炎发病模型。材料与方法本研究使用的猪支原体肺炎冻干组织毒保存于江苏省农业科学院,试验猪为没有猪支原体肺炎感染的健康二元猪。首先,通过荧光定量PCR方法确定组织毒中病原的含量。其次,利用小鼠接种试验,确定攻毒材料的安全性。再次,将组织强毒按照1:10,1:100,1:1000,1:10000进行稀释,计算感染支原体病原的拷贝数,经气管内注射途径对试验猪进行感染。最后,攻毒后28天,剖检感染猪,观察肺脏病变情况和临床症状,确定猪肺炎支原体为多少拷贝时,为最佳攻毒剂量,建立猪支原体肺炎人工发病模型,并对该病的人工发病模型标准化。结果与讨论猪肺炎支原体感染剂量为9.5×10～6copies时,肺脏评分均分为17.3;9.5×10～5copies时,均分为10.75;9.5×10～4copies时,均分为10.75;9.5×10～3copies时,均分为6.8。根据28分评分法对肺脏病变组织评分,均分在10以上,达到发病判断标准,本研究建立的猪支原体肺炎发病模型为将猪肺炎支原体含量大于9.5×10～4 copies的组织强毒,经气管内注射途径对健康二元猪感染,可以引起猪支原体肺炎,发病率达到100%。通过本研究发现,肺脏病变的评分和攻毒剂量未见显著的线性相关关系,推断猪支原体肺炎强毒感染动物后,支原体只要达到发病的阈值,即可引起发病。结论本研究建立了一个稳定的猪支原体肺炎发病模型,并对其完成了标准化,为猪支原体肺炎新疫苗、新药物的效力实验提供了良好的技术平台。

关键词：猪支原体肺炎猪肺炎支原体

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传染性法氏囊病病毒感染对鸡细胞模式识别受体及抗病毒基因转录的影响

传染性法氏囊病病毒感染对鸡细胞模式识别受体及抗病毒基因转录的...

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江苏省畜牧兽医学会成立60周年庆典暨2015年学术年会

作者：欧阳伟王永山王晓丽夏兴霞潘群兴毕振威诸玉梅董晨红张海彬江苏省农业科学院兽医研究所/农业部兽用生物制品工程技术重点实验室/国家兽用生物制品工程技术研究中心南京210014 南京农业大学动物医学院南京210095 江苏省动物重要疫病与人兽共患病防控协同创江苏省农业科学院兽医研究所/农业部兽用生物制品工程技术重点实验室/国家兽用生物制品工程技术研究中心南京210014 南京农业大学动物医学院南京210095

为了分析传染性法氏囊病病毒(IBDV)感染对鸡细胞模式识别受体(PRRs)及天然免疫抗病毒基因转录的影响,分别用IBDV 弱毒感染DT40 细胞和强毒感染SPF 鸡,用定量PCR(qRT-PCR)分析感染细胞和法氏囊组织中PRRs(TLR2、TLR3、TLR4、TLR7、MDA5 ... 详细信息

为了分析传染性法氏囊病病毒(IBDV)感染对鸡细胞模式识别受体(PRRs)及天然免疫抗病毒基因转录的影响,分别用IBDV 弱毒感染DT40 细胞和强毒感染SPF 鸡,用定量PCR(qRT-PCR)分析感染细胞和法氏囊组织中PRRs(TLR2、TLR3、TLR4、TLR7、MDA5 和LGP2)及天然免疫抗病毒基因(IPS-1、IRF3、PKR、OAS、Mx)的mRNA 转录变化。在IBDV 感染DT40细胞的2h 到24h 内,chMDA5、chTLR3、chLGP2、IRF3、PKR、OAS、Mx 的转录水平显著上升,分别为324、22、61、29、16、225000 和18700 倍。当用siRNA 分别敲除DT40 细胞中chMDA5、chTLR3 和chLGP2 时,IPS-1、IRF3、PKR、OAS 和Mx 在IBDV 感染后的2h 到24h 差异变化不显著。在IBDV 感染SPF 鸡法氏囊组织细胞中,chMDA5 和chTLR3 的表达显著降低,而chLGP2 表达没有显著差异,IRF3、PKR、OAS 和Mx 的转录水平显著上升。

关键词：传染性法氏囊病病毒(IBDV) 模式识别受体(PRRs) 天然免疫

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6日龄雏鸡混合感染坦布苏病毒和多杀性巴氏杆菌的病原学研究

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江西农业学报 2015年第4期27卷 81-84页

作者：刘宇卓宋子梁李银黄欣梅赵冬敏韩凯凯杨婧江苏省农业科学院兽医研究所农业部动物疫病诊断与免疫重点开放实验室国家兽用生物制品工程技术研究中心江苏南京210014

对一例疑似坦布苏病毒和多杀性巴氏杆菌混合感染的6日龄鸡进行病原的分离鉴定。用套氏RT-PCR方法和常规细菌分离鉴定方法进行病毒、细菌的分离、鉴定,并对其病原的主要生物学特性进行了研究。结果表明:病毒经鉴定为坦布苏病毒,与鹅源坦... 详细信息

对一例疑似坦布苏病毒和多杀性巴氏杆菌混合感染的6日龄鸡进行病原的分离鉴定。用套氏RT-PCR方法和常规细菌分离鉴定方法进行病毒、细菌的分离、鉴定,并对其病原的主要生物学特性进行了研究。结果表明:病毒经鉴定为坦布苏病毒,与鹅源坦布苏病毒JS804株核苷酸同源性达99%;分离到的细菌为多杀性巴氏杆菌。细菌对鸡的回归试验显示,0.1mL的菌液可致20周龄SPF鸡死亡;对6周龄Balb/c小鼠的致病性试验结果表明,含约10 CFU的毒液即可在24h内致其4/4死亡。

关键词：雏鸡坦布苏病毒多杀性巴氏杆菌

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