检索结果-内蒙古大学图书馆

微生物学报 2024年第9期64卷 3269-3281页

作者：张嘉雯尹文竹王海燕张金秋邓碧华卢宇周明旭马芳江苏省农业科学院动物免疫工程研究所江苏省食品质量安全重点实验室-省部共建国家重点实验室培育基地国家兽用生物制品工程技术研究中心江苏南京210014 南京农业大学动物医学院江苏南京210095 兽用生物制品(泰州)国泰技术创新中心江苏泰州225300

【目的】外膜囊泡(outer membrane vesicles,OMVs)是由革兰氏阴性菌和某些革兰氏阳性菌生成和分泌的球形双层膜结构,含有丰富的细菌表面抗原,因此在疫苗相关领域具有重要的研究价值。脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)作为OMVs的主要结构... 详细信息

【目的】外膜囊泡(outer membrane vesicles,OMVs)是由革兰氏阴性菌和某些革兰氏阳性菌生成和分泌的球形双层膜结构,含有丰富的细菌表面抗原,因此在疫苗相关领域具有重要的研究价值。脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)作为OMVs的主要结构,在诱导免疫活性的同时,也成为影响OMVs安全性的主要因素。因此,通过基因工程改造细菌LPS以生产安全高效的OMVs,是促进其生产应用的有效途径之一。【方法】以O抗原和大部分核心抗原缺失的明尼苏达沙门氏菌(Salmonella minnesota)Re595为研究对象,通过缺失酰基链编码基因msbB和导入新凶手弗朗西丝氏菌(Francisella novicida)磷酸酶基因lpxE,减少类脂A上的酰基链和磷酸基团,从而获得低毒LPS;提取亲本株与改造株LPS与OMVs,比较其刺激免疫细胞的炎性反应,以OMVs作为免疫增强剂制备口蹄疫灭活疫苗,评价免疫活性。【结果】Re595经LPS低毒改造成功降低该菌OMVs的内毒素活性和炎性反应,进一步评价亲本株Re595与低毒改造株的OMVs免疫活性发现,LPS低毒改造虽降低了OMVs的炎性反应,但其免疫增强活性显著提高。【结论】本研究说明LPS低毒改造后可降低细菌OMVs毒性,并提高其免疫增强活性,该结果将为OMVs作为免疫佐剂的应用提供理论依据。

关键词：外膜囊泡免疫佐剂脂多糖内毒素活性基因编辑

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鞭毛蛋白的表达及其免疫增强效力评价

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中国动物传染病学报 2025年

作者：侯立婷刘昆昆安俊星于晓明秦竹杜露平张元鹏陈瑾郑其升江苏省农业科学院动物免疫工程研究所江苏省农业科学院国家兽用生物制品工程技术研究中心兽用生物制品(泰州)国泰技术创新中心省部共建国家重点实验室培育基地—江苏省食品质量安全重点实验室南京农业大学动物医学院

本研究旨在研制安全高效的兽用疫苗免疫增强剂，为免疫增强剂的开发奠定基础。首先通过参考伤寒沙门氏菌鞭毛蛋白基因序列，设计并构建了全长鞭毛蛋白FliC和删除D2和D3高变区的鞭毛蛋白FliC△D2D3的表达载体。然后利用原核表达系统表达... 详细信息

本研究旨在研制安全高效的兽用疫苗免疫增强剂，为免疫增强剂的开发奠定基础。首先通过参考伤寒沙门氏菌鞭毛蛋白基因序列，设计并构建了全长鞭毛蛋白FliC和删除D2和D3高变区的鞭毛蛋白FliC△D2D3的表达载体。然后利用原核表达系统表达这两种蛋白，并进行纯化与鉴定。获得这两种蛋白后，进一步检测这两种蛋白体外对DC2.4细胞的TLR 5的激活和相关细胞因子的表达情况，并对其在PEDV疫苗上的免疫增强效力进行了评价。结果表明，1)两种蛋白在原核表达系统中均以可溶形式表达；2)添加鞭毛蛋白刺激后，DC 2.4细胞中TLR5及相关细胞因子的表达水平显著提高；3)FliC和FliC△D2D3均能显著提高小鼠和仔猪免疫后的PEDV特异性的IgG抗体水平，其中FliC△D2D3的免疫效果优于全长的FliC。该研究不仅有助于了解鞭毛蛋白FliC在免疫调节中的作用，也为基于鞭毛蛋白的免疫增强剂的开发提供了基础。

关键词：鞭毛蛋白FliC、FliC 免疫增强剂 PEDV

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伪狂犬活/灭活病毒接种小鼠诱导免疫效力及差异因子比较

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南京农业大学学报 2023年第1期46卷 106-111页

作者：章晨昕于晓明侯立婷张元鹏乔绪稳侯继波黄克和郑其升陈瑾南京农业大学动物医学院江苏南京210095 江苏省农业科学院动物免疫工程研究所/国家兽用生物制品工程技术研究中心江苏南京210014 江苏省食品质量安全重点实验室-省部共建国家重点实验室培育基地江苏南京210014

[目的]本研究旨在比较活/灭活病毒进入体内后对免疫系统活化的差异,为免疫增强剂的筛选和评价建立高效动物模型。[方法]本试验利用伪狂犬病毒(PRV)Bartha-K61株建立小鼠伪狂犬人工感染模型,筛选活/灭活病毒接种小鼠后免疫相关差异因子。... 详细信息

[目的]本研究旨在比较活/灭活病毒进入体内后对免疫系统活化的差异,为免疫增强剂的筛选和评价建立高效动物模型。[方法]本试验利用伪狂犬病毒(PRV)Bartha-K61株建立小鼠伪狂犬人工感染模型,筛选活/灭活病毒接种小鼠后免疫相关差异因子。将PRV Bartha-K61活毒以不同剂量、不同方式感染小鼠,通过计算小鼠存活率确定最佳感染剂量与感染方式;将筛选的最佳剂量的伪狂犬病毒活毒与相同剂量下灭活病毒按照前述筛选的最佳感染方式接种小鼠,利用ELISA试剂盒检测免疫7 d后小鼠血清中TNF-α、IL-1β、IFN-β和IL-6水平;利用PRV gB ELISA检测免疫7 d后小鼠血清PRV特异性gB抗体水平;利用灭活PRV作为特异性抗原进行淋巴细胞增殖试验并计算各组淋巴细胞刺激指数(SI)。[结果]在保证小鼠存活的前提下,6~8周龄小鼠的PRV的安全感染剂量为5×104TCID50;同等剂量下,相比于肌肉和腹腔注射,皮下注射为最安全的感染方式;同等剂量的活毒和灭活病毒接种小鼠后,与灭活病毒组相比,活病毒感染7 d后小鼠血清中TNF-α、IL-1β和IFN-β水平显著升高(P<0.001,P<0.01),与灭活病毒组相比,活病毒组小鼠血清PRV gB特异性抗体IgG水平和SI也显著升高(P<0.05,P<0.001);不同灭活方式间各细胞因子和SI差异不显著(P>0.05)。[结论]成功建立小鼠伪狂犬人工感染模型,明确活/灭活伪狂犬病毒接种小鼠后,机体早期存在与免疫相关差异因子,为后续免疫增强剂的评价筛选提供依据。

关键词：伪狂犬病毒小鼠模型免疫效力差异因子

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CVC1302通过小鼠骨髓源树突状细胞对免疫反应的调控

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江苏农业学报 2023年第6期39卷 1380-1385页

作者：侯立婷于晓明杜露平张元鹏程海卫陈瑾郑其升侯继波江苏省农业科学院动物免疫工程研究所江苏南京210014 江苏省农业科学院国家兽用生物制品工程技术研究中心江苏南京210014 兽用生物制品<泰州>国泰技术创新中心江苏泰州225300 省部共建国家重点实验室培育基地——江苏省食品质量安全重点实验室江苏南京210014

为获得C57BL/6小鼠骨髓源树突状细胞(DC)的体外制备方法并探讨免疫增强剂CVC1302对DC免疫调控的影响,取8周龄的C57BL/6小鼠骨髓细胞,在体外经过重组鼠源粒细胞/巨噬细胞集落刺激因子(Recombinant mouse granulocyte-macrophage colony-s... 详细信息

为获得C57BL/6小鼠骨髓源树突状细胞(DC)的体外制备方法并探讨免疫增强剂CVC1302对DC免疫调控的影响,取8周龄的C57BL/6小鼠骨髓细胞,在体外经过重组鼠源粒细胞/巨噬细胞集落刺激因子(Recombinant mouse granulocyte-macrophage colony-stimulating factor, rm GM-CSF)诱导分化为DC。诱导当天与诱导第3 d、第7 d时,用倒置显微镜观察细胞形态;诱导第7 d时,收获细胞,鉴定表型。利用流式细胞术评价CVC1302对DC表面分子表达水平的影响,用超高分辨率显微镜评价CVC1302对DC递呈抗原的影响,采用流式细胞术检测T淋巴细胞的活化数量,利用酶联免疫吸附试验(Enzyme linked immunosorbent assay, ELISA)方法检测T淋巴细胞活化后干扰素γ(IFN-γ)的分泌水平。结果表明,体外诱导的DC在显微镜下具有非常典型的树突状细胞形态,流式细胞术检测结果表明,经典的1型树突状细胞(Conventional type 1 dendritic cell, cDC1)和经典的2型树突状细胞(Conventional type 2 dendritic cell, cDC2)亚群均可检测到。CVC1302能够显著促进DC表面分子活化并且增强DC对鸡卵清白蛋白(OVA)抗原的递呈;CVC1302能够显著活化T淋巴细胞并且提高T淋巴细胞活化后IFN-γ的分泌水平。本研究利用rm GM-CSF成功在体外刺激诱导DC的产生,并证实了CVC1302在体外同样具有促进DC成熟、DC对OVA抗原的递呈及T淋巴细胞活化的能力。

关键词： C57BL/6小鼠树突状细胞 CVC1302 抗原递呈 T淋巴细胞活化

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靶向B细胞的口蹄疫GHloop多肽抗原的制备及免疫效力鉴定

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中国动物传染病学报 2023年第3期31卷 74-81页

作者：侯立婷张媛媛于晓明杜露平张元鹏程海卫乔绪稳李丁郑其升陈瑾江苏省农业科学院动物免疫工程研究所南京210014 江苏省农业科学院国家兽用生物制品工程技术研究中心南京210014 兽用生物制品(泰州)国泰技术创新中心泰州225300 省部共建国家重点实验室培育基地—江苏省食品质量安全重点实验室南京210014

本研究将葡萄球菌A蛋白人工合成类似物的二聚体(DD)与口蹄疫的GHloop串联,按照大肠杆菌偏好性密码子优化合成GHloop-DD,并评价其免疫原性。将GHloop-DD插入到原核表达载体pET-32a中,鉴定阳性后转入*** BL21进行诱导表达。利用SDS-PAGE与... 详细信息

本研究将葡萄球菌A蛋白人工合成类似物的二聚体(DD)与口蹄疫的GHloop串联,按照大肠杆菌偏好性密码子优化合成GHloop-DD,并评价其免疫原性。将GHloop-DD插入到原核表达载体pET-32a中,鉴定阳性后转入*** BL21进行诱导表达。利用SDS-PAGE与Western blot对目的基因表达产物的可溶性进行分析。利用镍亲和层析柱纯化目的蛋白;利用BCA试剂盒测定重组蛋白的浓度,将重组蛋白(2.5μg/只)与206佐剂乳化,制备疫苗,免疫5周龄小鼠,同时设商品化合成肽苗对照与空白对照。免疫后28 d采集试验小鼠血清,利用口蹄疫病毒多肽ELISA抗体检测试剂盒检测免疫小鼠血清的抗体水平;利用流式细胞仪测定淋巴结B细胞的数量及骨髓中长寿浆细胞的数量;利用荧光定量检测相关趋化因子的表达水平;利用细胞因子检测试剂盒检测脾脏淋巴细胞刺激后上清液中的细胞因子的水平。SDS-PAGE结果表明,GHloop-DD基因在大肠杆菌中以可溶形式获得高水平表达;Western blot结果显示,表达的重组蛋白能够与特异性抗体发生反应。免疫试验结果表明,GHloop-DD不但能够刺激免疫小鼠产生高水平的多肽特异性ELISA抗体,而且能够提高淋巴结B细胞的数目及相关趋化因子水平,使骨髓中长寿浆细胞的数量和脾脏淋巴细胞刺激后上清液中细胞因子的水平显著提高。以上结果表明,本研究制备的GHloop-DD具有良好的免疫原性,为口蹄疫多肽疫苗的研制提供了新的方向。

关键词： GHloop-DD 体液免疫 B细胞长寿浆细胞

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一种水溶性佐剂CS-GTA-ML对H7N9亚型禽流感灭活疫苗免疫效果评价

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中国兽医学报 2023年第8期43卷 1618-1626页

作者：尹文竹许泽玉邓碧华马芳周明旭王海燕卢宇张金秋江苏省农业科学院动物免疫工程研究所国家兽用生物制品工程技术研究中心江苏南京210014 江苏省食品质量安全重点实验室-省部共建国家重点实验室培育基地江苏南京210014 南京农业大学动物医学院江苏南京210095

旨在合成一种直接溶解在生理缓冲溶剂中、可注射的功能化修饰的壳聚糖衍生物作为兽用佐剂,用于替代铝盐佐剂。壳聚糖中的氨基与环氧丙基三甲基氯化铵(GTA)中的环氧基团发生加成开环反应,偶联成CS-GTA中间体;再与4-(2-氯乙基)吗啉(ML)发... 详细信息

旨在合成一种直接溶解在生理缓冲溶剂中、可注射的功能化修饰的壳聚糖衍生物作为兽用佐剂,用于替代铝盐佐剂。壳聚糖中的氨基与环氧丙基三甲基氯化铵(GTA)中的环氧基团发生加成开环反应,偶联成CS-GTA中间体;再与4-(2-氯乙基)吗啉(ML)发生氮烷基化反应生成终产物CS-GTA-ML。产物通过FI-IR、1H NMR、Zeta电位等表征手段检测其结构及重要成分的嫁接率;通过溶血试验、细胞活性计数(CCK-8)和组织病理分析(HE)方法评估了CS-GTA-ML的生物安全性,为注射剂型的使用提供了安全保障;配伍H7N9亚型流感灭活病毒,对雌性ICR小鼠和SPF鸡进行皮下免疫,测定对其血凝抑制(HI)效价,并通过流式分析仪初步探索脾淋巴细胞活化能力。结果显示,作为抗原递送系统,CS-GTA-ML在不同pH值的水溶液中均可溶解,其中GTA和ML的嫁接率分别约为53%,15%,且带有15.8 mV的正电荷。当质量浓度在1 g/L以下时,体外脾细胞存活率在88%以上,且对机体重要组成器官无损伤;当质量浓度高达10 g/L时,体外红细胞溶血率仅0.5%左右,具有良好的生物相容性。与单一的H7N9疫苗和ISA206+H7N9疫苗对比,CS-GTA-ML有显著的血凝抑制作用。通过相关细胞因子及流式细胞分析发现CS-GTA-ML倾向于CD4^(+)T细胞分化趋势,具有体液免疫和细胞免疫双重免疫效力。

关键词：壳聚糖吗啉环水溶性 H7N9禽流感病毒佐剂

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功能化氧化石墨烯GCF的制备及其增强OVA的免疫原性评价

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中国兽医学报 2023年第3期43卷 562-570页

作者：宣德春尹文竹王海燕周明旭邓碧华马芳卢宇张金秋江苏大学药学院江苏镇江212013 江苏省农业科学院动物免疫工程研究所国家兽用生物制品工程技术研究中心江苏南京210014 江苏省动物重要疫病与人兽共患病防控协同创新中心江苏扬州225009 江苏省食品质量安全重点实验室/省部共建国家重点实验室培育基地江苏南京210014

为制备高效负载、递送和缓释抗原的新型功能化氧化石墨烯衍生材料(GCF)作为佐剂,探索该纳米佐剂对OVA免疫原性影响。以氧化石墨烯(graphene oxide,GO)为母体,采用EDC/NHS共价嫁接壳聚糖(chitosan,CS),并静电吸附泊洛沙姆407(poloxamer,F... 详细信息

为制备高效负载、递送和缓释抗原的新型功能化氧化石墨烯衍生材料(GCF)作为佐剂,探索该纳米佐剂对OVA免疫原性影响。以氧化石墨烯(graphene oxide,GO)为母体,采用EDC/NHS共价嫁接壳聚糖(chitosan,CS),并静电吸附泊洛沙姆407(poloxamer,F127)制备出亲水性的氧化石墨烯衍生材料GO-CS-F127(简称GCF)。利用XRD、UV-vis、FI-IR、Zeta电位等多种方法对GCF进行理化特性表征,确定材料的形貌、成分及电荷分布。通过BCA法检测GCF对OVA的最大吸附量及释放率,CCK-8法鉴定GCF新材料在体外安全性评价,ELSIA方法评价小鼠血清中特异性抗体水平,并采集小鼠重要组织制备切片以观察病理变化。结果显示,GCF呈片层结构,常温放置30 d仍能稳定存放,带有17.9 mV的正电荷,能快速吸附抗原,其最大吸附量能达到1.9 g/g,且对抗原具有显著的缓释作用。GCF质量浓度在100 mg/L以下,细胞存活率达85%以上,且对心、脾、肾等组织无损伤,具有良好的生物相容性。与单独OVA组及PBS组相比,发现GCF能显著提高小鼠OVA特异性IgG抗体水平。结果表明,以功能化氧化石墨烯GCF作为佐剂,可有效提高抗原的免疫原性。

关键词：氧化石墨烯壳聚糖共价键佐剂疫苗

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CTA1-DD蛋白在枯草芽胞杆菌中的分泌表达

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畜牧与兽医 2023年第9期55卷 42-46页

作者：张元鹏侯立婷杜露平于晓明李兰杨利张浩明王义伟乔绪稳程海卫秦竹陈瑾郑其升江苏省农业科学院动物免疫工程研究所江苏南京210014 江苏省农业科学院国家兽用生物制品工程技术研究中心江苏南京210014 江苏省动物重要疫病与人兽共患病防控协同创新中心江苏扬州225009 江苏省食品质量安全重点实验室-省部共建国家重点实验室培育基地江苏南京210014 兽用生物制品(泰州)国泰技术创新中心江苏泰州1225300

有研究证实,霍乱毒素(CT)A1亚基与葡萄球菌G蛋白的D肽偶联构建的融合蛋白CTA1-DD具有良好的佐剂效果。为了获得重组CTA1-DD蛋白在枯草芽胞杆菌中的表达,将CTA1-DD基因连接到表达载体pHT43中,构建重组枯草杆菌表达载体pHT43-CTA1-DD。将... 详细信息

有研究证实,霍乱毒素(CT)A1亚基与葡萄球菌G蛋白的D肽偶联构建的融合蛋白CTA1-DD具有良好的佐剂效果。为了获得重组CTA1-DD蛋白在枯草芽胞杆菌中的表达,将CTA1-DD基因连接到表达载体pHT43中,构建重组枯草杆菌表达载体pHT43-CTA1-DD。将重组载体转化到枯草芽胞杆菌WB600中,用IPTG诱导重组菌表达,发酵液离心后取上清液,通过SDS-PAGE和Western blot方法分析蛋白表达情况。发酵上清液经Ni-IDA琼脂糖树脂纯化,与流感病毒HA抗原混合后共同滴鼻免疫小鼠后采集小鼠血清和支气管肺泡灌洗液检测IgG和IgA的抗体水平。结果显示:重组CTA1-DD蛋白在枯草芽胞杆菌中能够分泌表达,在发酵罐中发酵36 h情况下蛋白表达量最高,目的蛋白大小在42 kDa左右,蛋白产量最高能到700μg/mL,Western blot检测目的蛋白正确表达。重组蛋白经过Ni-IDA琼脂亲和层析纯化后与HA抗原混和滴鼻免疫小鼠,ELISA结果显示CTA1-DD蛋白组针对HA抗原能够诱导更高的血清IgG和黏膜IgA抗体水平,说明枯草芽胞杆菌表达的CTA1-DD蛋白具有佐剂活性。试验结果为进一步研究CTA1-DD蛋白在黏膜佐剂的大规模生产应用奠定了基础。

关键词： CTA1-DD蛋白枯草芽胞杆菌表达黏膜免疫

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内质网分子伴侣GRP94对伪狂犬病毒增殖的调节作用

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浙江农业学报 2022年第11期34卷 2386-2394页

作者：倪敏舒陈丽鲍熹徐悦庄腾寒冯磊江苏大学药学院江苏镇江212013 江苏省农业科学院动物免疫工程研究所国家兽用生物制品工程技术研究中心江苏南京210014 江苏省动物重要疫病与人兽共患病防控协同创新中心江苏扬州225009 江苏省食品质量安全重点实验室省部共建国家重点实验室培育基地江苏南京210014

为探究葡萄糖调节蛋白94(GRP94)对伪狂犬病毒(Pseudorabies virus,PRV)增殖的影响,以及GRP94与PRV结构蛋白之间的相互作用。利用慢病毒转染构建GRP 94基因过表达的BHK-21细胞,以及CRISPR/Cas9技术构建GRP 94基因敲除的BHK-21细胞,检测PR... 详细信息

为探究葡萄糖调节蛋白94(GRP94)对伪狂犬病毒(Pseudorabies virus,PRV)增殖的影响,以及GRP94与PRV结构蛋白之间的相互作用。利用慢病毒转染构建GRP 94基因过表达的BHK-21细胞,以及CRISPR/Cas9技术构建GRP 94基因敲除的BHK-21细胞,检测PRV感染不同细胞的增殖水平,比较内质网应激相关蛋白表达水平,探索GRP94与PRV结构蛋白之间的互作关系。结果表明,GRP 94基因过表达细胞株显著有利于PRV增殖,而GRP 94基因缺失细胞株对PRV增殖无显著影响。蛋白免疫印迹结果显示,在GRP 94基因缺失细胞株中,GRP78表达水平显著上调。免疫共沉淀结果表明,GRP94与gB、gD、gL具有相互作用。GRP 94基因过表达有利于PRV增殖,检测未折叠蛋白反应(unfolded protein response,UPR)相关蛋白,研究GRP94在病毒增殖过程中的具体作用,可为PRV与内质网应激提供分子方面的研究基础,于对抗PRV病毒的感染具有重要意义。

关键词：葡萄糖调节蛋白94 葡萄糖调节蛋白78 伪狂犬病毒蛋白互作

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苏北地区奶牛场无乳链球菌分离株毒力分析

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江苏农业科学 2021年第5期49卷 142-149页

作者：马芳周明旭张金秋杨世芳卢宇邓碧华江苏省食品质量安全重点实验室-省部共建国家重点实验室培育基地/江苏省农业科学院动物免疫工程研究所/国家兽用生物制品工程技术研究中心江苏南京210014 江苏省动物重要疾病与人畜共患病防控协同创新中心江苏扬州225009 江苏大学食品与生物工程学院江苏镇江212013

奶牛乳腺炎导致奶牛产奶量下降和乳制品质量降低,是奶牛养殖业重要的经济性疾病,在全球范围内造成巨大经济损失。选取苏北奶牛场3株代表性无乳链球菌分离株,SAG-FX17分离自临床型乳腺炎、CM31分离自隐性乳腺炎和CM41b分离自隐性发展为... 详细信息

奶牛乳腺炎导致奶牛产奶量下降和乳制品质量降低,是奶牛养殖业重要的经济性疾病,在全球范围内造成巨大经济损失。选取苏北奶牛场3株代表性无乳链球菌分离株,SAG-FX17分离自临床型乳腺炎、CM31分离自隐性乳腺炎和CM41b分离自隐性发展为临床型乳腺炎奶牛乳汁,研究比较3株细菌生长特性、毒力因子分布、形成生物被膜能力及其对奶牛乳腺上皮细胞的黏附、侵袭和胞内存活能力。试验结果表明,3株分离株血清型均为Ⅰa型,2b型菌毛,gapC基因和cylE基因阳性,但仅SAG-FX17的α相关蛋白家族为Alp1型,其他2株为未定型。研究发现SAG-FX17与奶牛乳腺上皮细胞(Mac-T)共孵育时生成生物被膜能力明显增强,且该菌对Mac-T细胞黏附率为52.5%,显著高于CM31和CM41b。侵袭试验结果表明,3株细菌侵袭到细菌内部的能力很低,但侵袭到细胞内的细菌具有一定存活能力,侵入细胞4h3株分离株SAG-FX17、CM31、CM41b存活率分别为24%、18%、86.7%。综上所述,无乳链球菌在奶牛乳腺上皮细胞表面形成生物被膜及其在胞内存活能力是影响细菌致病性的重要因素。

关键词：无乳链球菌毒力因子:生物被膜黏附胞内存活能力奶牛场苏北地区

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