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江苏农业学报 2017年第4期33卷 794-801页

作者：冯辉聂国嫒陈曦张金凤周冬梅魏利辉江苏省农业科学院植物保护研究所江苏南京210014 江苏省农业科学院食品质量安全与检测研究所/省部共建国家重点实验室培育基地--江苏省食品质量安全重点实验室江苏南京210014

从江苏省泰州地区水稻根结组织中分离获得单一种群的寄生线虫,其雌虫、雄虫和二龄幼虫的de-Man形态学特征与已报道的拟禾谷根结线虫(Meloidogyne graminicola)基本一致。应用ITS-rRNA和28S rRNA D2-D3扩展区分子标记PCR扩增分别获得579... 详细信息

从江苏省泰州地区水稻根结组织中分离获得单一种群的寄生线虫,其雌虫、雄虫和二龄幼虫的de-Man形态学特征与已报道的拟禾谷根结线虫(Meloidogyne graminicola)基本一致。应用ITS-rRNA和28S rRNA D2-D3扩展区分子标记PCR扩增分别获得579 bp和766 bp条带,其序列与***台湾、福建、广东、海南等地区部分分离群体的相似度均达99%。贝叶斯系统发育树显示,***江苏分离群体与供试的其他种群均位于同一进化分支。***江苏分离群体的鉴定结果表明,该线虫从南至北开始向中国其他稻区扩展蔓延,因此亟待采取相关措施以防止水稻根结线虫病的大发生。

关键词：拟禾谷根结线虫形态学特征 ITS-RNA 28 rRNA 进化树分析

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基于Bt毒素的杀虫蛋白理性设计与创新应用策略

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中国农业科学 2024年第1期57卷 96-125页

作者：徐重新金嘉凤孙晓明沈成张霄陈澄宇刘贤金刘媛江苏省农业科学院农产品质量安全与营养研究所/省部共建国家重点实验室培育基地-江苏省食品质量安全重点实验室江苏大学食品与生物工程学院南京农业大学植物保护学院

Bt毒素是源于苏云金芽孢杆菌（Bacillus thuringiensis）的具有特殊杀虫功能的大分子蛋白，其制剂和转基因作物已广泛用于害虫防治，产生了巨大的经济和社会生态效益。围绕Bt毒素挖掘和提升其应用价值是持续研究的热点，特别是随着Bt毒... 详细信息

Bt毒素是源于苏云金芽孢杆菌（Bacillus thuringiensis）的具有特殊杀虫功能的大分子蛋白，其制剂和转基因作物已广泛用于害虫防治，产生了巨大的经济和社会生态效益。围绕Bt毒素挖掘和提升其应用价值是持续研究的热点，特别是随着Bt毒素结构功能和作用机制日趋明晰，为其功能修饰和创新应用创造了条件，相关研究蓬勃发展，成效显著。大量研究表明，采用定点突变、结构域替换或融合以及抗独特型抗体模拟等策略，是理性设计活性更高、稳定性更强、杀虫谱更广、非靶标生物安全性更高甚至是可用于害虫抗药性治理的有别于母体Bt毒素的突变体、结构杂合体乃至功能效应物抗体等新型杀虫蛋白的有效手段；此外，采用催化毒素活化、驱动毒素靶向受体结合、促进毒素表达以及同源或异源杀虫材料复配或共表达的协同促效等创新增效策略，也是助推Bt毒素应用价值的重要手段。本文总结了Bt毒素结构功能和作用机制，梳理了基于Bt毒素功能修饰的突变体、结构杂合体以及功能效应物抗体等新型杀虫蛋白理性设计和基于Bt毒素功能增效的创新应用策略等相关研究进展，并结合作者团队在模拟Bt毒素杀虫功能效应物抗体靶向设计研发方面的最新成果，探讨了基于Bt毒素的杀虫蛋白理性设计与创新应用策略未来发展动向及潜在可行捷径，为相关研究提供较为全面的最新有价值的文献资料和启发思路。

关键词： Bt毒素苏云金芽孢杆菌杀虫蛋白定点突变抗独特型抗体蛋白融合表达杀虫增效物

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二化螟Halloween家族基因Cyp302a1和Cyp315a1的克隆与时空表达谱分析

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南京农业大学学报 2022年第2期45卷 287-296页

作者：张志凌王凯张茹徐晴玉罗光华方继朝南京农业大学植物保护学院江苏南京210095 江苏省农业科学院植物保护研究所/江苏省食品质量安全重点实验室(省部共建国家重点实验室培育基地) 江苏南京210014 扬州大学园艺与植物保护学院江苏扬州225009

[目的]Halloween家族基因参与合成蜕皮激素,调控昆虫发育、繁殖等重要生命过程。二化螟(Chilo suppressalis)是水稻的重要害虫,明确二化螟Halloween家族基因完整序列及表达谱特征,对后续开展二化螟生长发育等调控机制研究具有重要作用。... 详细信息

[目的]Halloween家族基因参与合成蜕皮激素,调控昆虫发育、繁殖等重要生命过程。二化螟(Chilo suppressalis)是水稻的重要害虫,明确二化螟Halloween家族基因完整序列及表达谱特征,对后续开展二化螟生长发育等调控机制研究具有重要作用。[方法]利用反转录PCR(RT-PCR)和快速扩增cDNA末端(RACE)技术克隆二化螟Halloween家族基因成员Cyp302a1和Cyp315a1的完整转录本序列;通过多重比对分析序列保守结构特征;利用MEGA 7.0软件构建了分子系统进化树;利用实时荧光定量PCR(RT-qPCR)分析基因的时空表达谱。[结果]克隆获得二化螟Halloween家族2个基因CsCyp302a1和CsCyp315a1的全长cDNA序列。各基因均含有5个序列保守结构域:WxxxR(Helix-C)、GxE/DTT/S(Helix-I)、ExxR(Helix-K)、PxxFxPE/DRF(PERF motif)和PFxxGxRxCxG/A(heme-binding domain),并且与各自的基因家族成员聚为一支。各基因在不同发育时期和不同组织内的表达水平存在差异,其表达模式在不同基因间也存在差异。二化螟Cyp307a1相对表达量最高,Cyp315a1相对表达量最低。Cyp307a1在头部表达量高;Cyp306a1在中肠表达量高;Cyp302a1和Cyp315a1在头部和表皮中表达量高;Cyp314a1在脂肪体和表皮中表达量高。[结论]明确了二化螟Halloween家族2个基因序列特征和全部5个主要基因的时空表达谱特征。

关键词：二化螟 Halloween家族基因基因克隆时空表达谱

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单链抗体对Cry1A类毒素的检测方法建立及识别差异初步研究

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农业生物技术学报 2019年第3期27卷 516-525页

作者：曲婷婷张霄董飒刘贝贝李盼王耘张存政刘贤金南京农业大学植物保护学院江苏省农业科学院食品质量安全与检测研究所/江苏省食品质量安全重点实验室-省部共建国家重点实验室培育基地/农业部农产品量安全控制技术与标准重点实验室

为建立一种针对Cry1类毒素的经济高效的检测方法,本研究以杂交瘤细胞株2D10 cDNA为模板,通过重叠延伸PCR(gene splicing by overlap extension PCR, SOE-PCR)技术构建单链抗体(single-chain variable fragment, scFv)基因,转入大肠杆菌(Escherichia coli) BL21 (DE3)表达并建立双抗体夹心酶联免疫吸附测定(double antibody sandwich ELISA, DAS-ELISA)检测方法,通过分子对接模拟分析影响scFv与Cry1A类毒素结合的关键因素。结果成功构建了scFv基因,表达纯化出具有较高识别活性的scFv抗体(约28 kD),所建立的DAS-ELISA方法对Cry1Ab/Cry1Ac毒素的最低检测限(limits of determination, LOD)为20 ng/mL,分子对接结果显示,毒素的三维结构决定了其结合活性,氢键和疏水作用力在scFv与毒素结合过程中起重要作用。本研究利用基因工程抗体技术构建并表达获得了scFv抗体,建立了针对Cry1Ab/Cry1Ac毒素的双抗夹心ELISA检测方法,初步分析研究了scFv与Cry1Ac/Cry1Ab和Cry1Aa的识别差异机制,为进一步改造、研究开发新型广谱scFv提供了理论依据。

关键词： Cry1Ab Cry1Ac scFv DAS-ELISA 分子对接

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青海省大麦黄矮病毒GPV株系小麦分离物基因组克隆及序列特征分析

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植物保护学报 2022年第4期49卷 1032-1038页

作者：乔世英罗海林季英华侯璐姚强闫佳会郭青云青海大学农林科学院青海省农业有害生物综合治理重点实验室农业农村部西宁作物有害生物科学观测实验站西宁810016 江苏省农业科学院植物保护研究所江苏省食品质量安全重点实验室-省部共建国家重点实验室培养基地南京210014

为有效防控大麦黄矮病毒(barley yellow dwarf virus,BYDV)病,于2019年自青海省循化县小麦田采集疑似感病病叶,并对其进行反转录PCR(reverse transcription PCR,RT-PCR)检测,并克隆得到BYDV-GPV株系全基因组序列,对克隆的全基因组序列... 详细信息

为有效防控大麦黄矮病毒(barley yellow dwarf virus,BYDV)病,于2019年自青海省循化县小麦田采集疑似感病病叶,并对其进行反转录PCR(reverse transcription PCR,RT-PCR)检测,并克隆得到BYDV-GPV株系全基因组序列,对克隆的全基因组序列进行系统发育树分析和碱基突变分析。结果显示,在采集样品中检测到BYDV-GPV株系,克隆得到了BYDV-GPV小麦分离物基因组,其序列全长为5676 bp,包含3个非编码区和6个开放阅读框,编码6个蛋白,与BYDV-GPV核苷酸序列的一致性高达98.17%,并聚在一个分支上,表明该分离物为BYDV-GPV。获得的青海BYDV-GPV序列在3′UTR出现碱基突变,多了4个碱基。

关键词：青海省小麦 BYDV-GPV 全基因组

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水稻白叶枯病抗性相关基因的研究进展

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江苏农业学报 2022年第5期38卷 1402-1410页

作者：陈贤赵延存明亮杨勇刘凤权江苏省农业科学院植物保护研究所江苏省食品质量安全重点实验室-省部共建国家重点实验室培育基地江苏南京210014 浙江省农业科学院病毒学与生物技术研究所浙江杭州310021

水稻白叶枯病是一种由革兰氏阴性黄单胞菌稻致病变种(Xanthomonas oryzae ***,Xoo)引起的细菌性病害,是中国南方稻区常年发生的流行性病害。长期的生产实践证明,挖掘新型抗病基因以及合理利用新的广谱持久抗病品种是防控水稻白叶枯病最... 详细信息

水稻白叶枯病是一种由革兰氏阴性黄单胞菌稻致病变种(Xanthomonas oryzae ***,Xoo)引起的细菌性病害,是中国南方稻区常年发生的流行性病害。长期的生产实践证明,挖掘新型抗病基因以及合理利用新的广谱持久抗病品种是防控水稻白叶枯病最为经济、有效和环境友好的途径。阐明水稻对白叶枯病菌的防御机制能为水稻抗病育种奠定理论基础。本文简要概述了水稻白叶枯病的发生和现状,归纳了水稻主效抗病基因、抗病相关基因和感病基因的类型,总结了水稻抵御水稻白叶枯病病原细菌的主要途径,为水稻白叶枯病的绿色防控提供理论依据。

关键词：水稻白叶枯病主效抗病基因抗病相关基因感病基因防御机制

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山东寿光黄瓜上瓜类褪绿黄化病毒的分子鉴定

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江苏农业学报 2019年第5期35卷 1047-1053页

作者：干射香涂丽琴吴淑华范小燕吴瑞雪赵文浩程兆榜周益军竺晓平季英华章松柏长江大学农学院湖北荆州434025 江苏省农业科学院植物保护研究所/省部共建国家重点实验室培养基地——江苏省食品质量安全重点实验室江苏南京210014 山东农业大学植物保护学院山东泰安271018

2016年,本研究在对山东黄瓜病毒病调查时发现当地黄瓜上出现一种叶片表现黄化植株伴有轻微矮缩的病害,为明确其中伴随的病毒种类,我们对田间病样进行了采集,提取总RNA后利用瓜类病毒引物进行RT-PCR检测,结果发现在利用瓜类褪绿黄化病毒(... 详细信息

2016年,本研究在对山东黄瓜病毒病调查时发现当地黄瓜上出现一种叶片表现黄化植株伴有轻微矮缩的病害,为明确其中伴随的病毒种类,我们对田间病样进行了采集,提取总RNA后利用瓜类病毒引物进行RT-PCR检测,结果发现在利用瓜类褪绿黄化病毒(Cucurbit chlorotic yellows virus,CCYV)引物检测样品时,田间采集的25份疑似病样中13份能扩增到400 bp左右的目的条带。为进一步确认,我们又针对CCYV的外壳蛋白基因(CP)设计了特异性引物,对13份阳性样品进行检测,结果均能扩增到目的片段,对获得的CP基因片段进行克隆并测定序列,序列分析结果显示其CP基因序列全长753bp,编码1个由250个氨基酸组成的分子量28700的蛋白质。进一步序列分析结果显示其与CCYV已报道分离物有很高的同源性,并聚类到同一个大的分支,其中与日本分离物、希腊分离物及中国其他地区分离物相对近缘,聚类到一支,而与伊朗分离物近缘关系相对较远。这些结果说明山东黄瓜黄化病样上检测到的病毒为瓜类褪绿黄化病毒,这也是该病毒在山东侵染黄瓜的首次报道。

关键词：黄瓜瓜类褪绿黄化病毒分子鉴定

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Bt Cry1类毒素共性结构域的分析、表达及鉴定

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中国农业科学 2016年第16期49卷 3130-3139页

作者：刘贝贝张霄谢雅晶焦凌霞刘媛张存政赵岩岩武爱华刘贤金南京农业大学植物保护学院江苏省农业科学院食品质量安全与检测研究所/江苏省食品质量安全重点实验室-省部共建国家重点实验室培育基地/农业部农产品量安全控制技术与标准重点实验室河南科技学院食品学院

【目的】分析定位Bt Cry1类毒素Cry1Ab、Cry1Ac、Cry1B、Cry1C、Cry1F的共性结构域,克隆并表达共性结构域蛋白,为筛选Bt毒素广谱抗体及建立广谱检测方法打下基础。【方法】利用生物信息学和分子模拟技术,通过SWISS-MODEL同源建模分别对5... 详细信息

【目的】分析定位Bt Cry1类毒素Cry1Ab、Cry1Ac、Cry1B、Cry1C、Cry1F的共性结构域,克隆并表达共性结构域蛋白,为筛选Bt毒素广谱抗体及建立广谱检测方法打下基础。【方法】利用生物信息学和分子模拟技术,通过SWISS-MODEL同源建模分别对5种Cry1类毒素进行三维建模,并结合Ramachandran plot、ERRAT和Verify3D方法评价模型构象的合理性。通过分析比对5种Cry1类毒素的三维结构,确定DomainⅠ区域作为5种Cry1毒素的共性结构域。以含Cry1Ac基因的苏云金芽孢杆菌库斯塔克亚种为模板设计引物,PCR扩增获得共性结构域DomainⅠ基因,将其经NcoⅠ和NotⅠ双酶切连接至原核表达载体pET-26b(+),构建原核表达载体pET-26b-DomainⅠ。重组质粒经菌液PCR、双酶切以及测序鉴定验证正确后,转化至*** BL21(DE3),经终浓度为1 mmol·L-1的IPTG在20℃下诱导表达16h后检测共性结构域蛋白的表达情况。离心收集诱导表达的大肠杆菌菌液,进行超声波破碎处理,收集上清及沉淀,采用SDS-PAGE分析融合蛋白的表达。利用His-Trap HP镍亲和柱纯化上清中的可溶性融合蛋白,经SDS-PAGE电泳、Western blot和ELISA试验验证纯化的共性结构域蛋白的生物活性。【结果】基于氨基酸序列及三维空间比对分析,发现5种Cry1类毒素的DomainⅠ的序列一致性最高,而且它们的DomainⅠ三维结构几乎完全重合,确定DomainⅠ区域作为5种Cry1毒素的共性结构域,通过PCR、双酶切及测序鉴定成功构建原核表达载体pET-26b-DomainⅠ,经IPTG诱导表达、His-Trap HP镍亲和柱纯化获得了可溶性的DomainⅠ共性结构域蛋白,SDS-PAGE和Western blot证实表达的共性结构域蛋白的分子量约为33.4 kD,且能与抗His标签鼠单克隆抗体发生特异性反应,ELISA试验证实共性结构域蛋白与5种Cry1类毒素特异性抗体均具有很强的结合能力,抗原表位分析结果显示共性结构域蛋白具有和完整的Cry蛋白存在多个潜在抗原表位位点的特征,抗原表位区域所占的比例分别为48.4%和63.6%,表明共性结构域蛋白具有良好的免疫原性和免疫反应性。【结论】基于分子模拟与分子克隆技术,成功定位及表达纯化获得共性结构域蛋白,为下一步利用共性结构域为靶标分子制备广谱特异性识别Cry1类毒素抗体打下基础。

关键词： Bt Cry1类毒素共性结构域原核表达纯化

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转Gbve1基因棉对棉田动物群落结构及稳定性影响

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新疆农业科学 2020年第11期57卷 2034-2043页

作者：姜义平肖留斌陈天子张保龙赵静谭永安江苏省农业科学院植物保护研究所/江苏省食品质量安全重点实验室-省部共建国家重点实验室培育基地南京210014 江苏省农业科学院种质资源与生物技术研究所南京210014

【目的】以亲本棉为对照,研究5组转Gbve1基因棉花株系对棉田生物群落分布以及环境的影响。【方法】以棉花3叶期为起始日期,采用随机调查法,查看整株棉花所有器官,记录棉株上所见节肢动物的种类及数量。【结果】转Gbve1基因棉田主要害虫... 详细信息

【目的】以亲本棉为对照,研究5组转Gbve1基因棉花株系对棉田生物群落分布以及环境的影响。【方法】以棉花3叶期为起始日期,采用随机调查法,查看整株棉花所有器官,记录棉株上所见节肢动物的种类及数量。【结果】转Gbve1基因棉田主要害虫的相对多度除朱砂叶螨、烟粉虱和棉叶蝉与对照棉田间有显著差异外,其余主要害虫均无显著差异(P>0.05)。不同品系棉田中刺吸式害虫和咀嚼式害虫之间均无显著差异(P>0.05);而转Gbve1基因棉田中物种多样性指数、均匀度指数和优势集中性指数与对照相比均差异不显著(P>0.05);且转基因棉田与对照棉田节肢动物群落存在较高的相似性(0.6814~0.8209)。【结论】不同品系棉田中主要昆虫群落消长动态显示,除个别品系在个别生育时期、个别昆虫之间存在显著差异,其余与对照相比消长动态均无显著差异,表明转抗黄萎病基因棉花并不影响棉田动物群落的结构和稳定性。

关键词： Gbve1 群落结构相对多度多样性指数

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江苏省蚕豆上菜豆黄花叶病毒的分子鉴定

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江苏农业学报 2019年第4期35卷 804-810页

作者：涂丽琴吴淑华干射香崔晓艳赵文浩程兆榜陈新周益军季英华朱月林南京农业大学园艺学院江苏南京210095 江苏省农业科学院植物保护研究所/省部共建国家重点实验室培养基地--江苏省食品质量安全重点实验室江苏南京210014 江苏省农业科学院经济作物研究所江苏南京210014

为掌握江苏省豆类作物上的病毒病种类,本研究于2018年对江苏省蚕豆作物病毒进行了调查,累计采集田间疑似病样55份,为明确其中伴随的病毒种类,我们对田间采集的疑似病样提取总RNA后进行了分子检测,结果发现,在用菜豆黄花叶病毒(Bean yell... 详细信息

为掌握江苏省豆类作物上的病毒病种类,本研究于2018年对江苏省蚕豆作物病毒进行了调查,累计采集田间疑似病样55份,为明确其中伴随的病毒种类,我们对田间采集的疑似病样提取总RNA后进行了分子检测,结果发现,在用菜豆黄花叶病毒(Bean yellow mosaic virus,BYMV)检测引物进行RT?PCR扩增时有16份样品扩增到1条525 bp左右的条带,与目的片段大小一致,说明其中可能伴随有菜豆黄花叶病毒的感染。为进一步确定这一结果,我们针对BYMV CP基因设计了引物,以阳性样品RNA为模板进行RT?PCR,结果发现均扩增到预期大小的目的条带,对该片段回收、克隆并测定碱基序列,结果发现其CP基因碱基序列全长819 bp,编码1个由273个氨基酸组成大小约20 800的蛋白质。BLAST分析结果显示其与BYMV同源性最高(AB439731,99%),表明其属于BYMV的一个分离物。利用MEGA软件对其进行系统进化分析,结果发现这些分离物与日本的蚕豆分离物(AB439731)同源性最高,其次是澳大利亚的蚕豆分离物(HG970867)和中国青海的菜豆分离物(9?16)。这些结果表明江苏蚕豆上检测到的病毒是菜豆黄花叶病毒的一个分离物,这是该病毒在江苏侵染蚕豆的首次分子鉴定报道。

关键词：菜豆黄花叶病毒蚕豆分子鉴定

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