检索结果-内蒙古大学图书馆

生物化学与生物物理进展 2007年第4期34卷 395-400页

作者：郑斌温进坤韩梅史建红河北医科大学基础医学研究所河北省医学生物技术重点实验室石家庄050017

hhLIM是LIM蛋白家族成员之一,该蛋白质含有两个LIM结构域,在基因表达调节、细胞骨架组构及细胞肥大过程中发挥重要作用.构建hhLIM不同LIM结构域的突变体,探讨其两个LIM结构域在与actin相互结合中的作用及其可能机制.GST-pull down和hhLI... 详细信息

hhLIM是LIM蛋白家族成员之一,该蛋白质含有两个LIM结构域,在基因表达调节、细胞骨架组构及细胞肥大过程中发挥重要作用.构建hhLIM不同LIM结构域的突变体,探讨其两个LIM结构域在与actin相互结合中的作用及其可能机制.GST-pull down和hhLIM及其突变体与actin细胞定位关系的免疫荧光分析结果表明,C端的LIM结构域2是hhLIM与actin结合所必需的,该结构域中的两个Cys置换为Ser后可使hhLIM结合actin的功能完全丧失,N端的LIM结构域1突变使hhLIM结合actin的能力下降.F-actin交联实验结果显示,hhLIM通过LIM结构域2与actin直接结合并起到交联F-actin的作用.结果表明,LIM结构域2在hhLIM与actin相互作用及调节actin细胞骨架组构中起决定性作用.

关键词： hhLIM LIM结构域细胞定位细胞骨架组构

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AP-1在AngⅡ正反馈调节其前体基因表达中的作用

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生物化学与生物物理进展 2006年第8期33卷 775-780页

作者：李爱英温进坤韩梅河北医科大学基础医学研究所河北省医学生物技术重点实验室石家庄050017

血管紧张素Ⅱ(AngⅡ)可诱导其前体基因在血管平滑肌细胞(vascularsmoothmusclecells,VSMC)中进行表达,其作用机制与促进转录激活蛋白-1(activatingprotein-1,AP-1)的基因调控区中存在的AP-1位点结合有关.为进一步明确AngⅡ调节AP-1结合... 详细信息

血管紧张素Ⅱ(AngⅡ)可诱导其前体基因在血管平滑肌细胞(vascularsmoothmusclecells,VSMC)中进行表达,其作用机制与促进转录激活蛋白-1(activatingprotein-1,AP-1)的基因调控区中存在的AP-1位点结合有关.为进一步明确AngⅡ调节AP-1结合活性的分子机制,用放线菌酮(cycloheximide,CHX)作为c-Jun磷酸化抑制剂,经DNA-蛋白质相互作用和蛋白质印迹实验,探讨AngⅡ对AP-1结合活性的影响并探讨其分子机制.结果表明,受AngⅡ刺激的VSMC,其核蛋白中AP-1的组成亚基之一c-Jun水平明显升高.免疫细胞化学染色显示,在被AngⅡ处理的细胞中,c-Jun主要定位于细胞核,胞浆中几乎检测不出该转录激活蛋白的存在.用丝氨酸磷酸化抗体检测证实,AngⅡ可诱导c-Jun磷酸化.电泳迁移率改变分析(electrophoreticmobilityshiftassay,EMSA)显示,c-Jun的磷酸化水平与AP-1结合血管紧张素原基因顺式元件的活性,和对该基因的转录激活作用呈正相关关系,CHX通过阻断c-Jun磷酸化抑制AngⅡ诱导的AP-1结合活性,但是不影响c-Jun的表达水平.上述结果提示,AP-1的磷酸化活化是AngⅡ正反馈调节其前体基因表达的重要机制之一,首次发现CHX是c-Jun磷酸化的抑制剂.

关键词：血管平滑肌细胞血管紧张素原基因 AP-1 c-Jun 转录调节

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骨桥蛋白13肽抑制球囊内皮剥脱术后血管狭窄的实验研究

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中国应用生理学杂志 2007年第4期23卷 495-499,I0014页

作者：卢洁韩梅温进坤李菁菁河北医科大学基础医学研究所河北省医学生物技术重点实验室河北石家庄050017

目的:利用含有骨桥蛋白(OPN)多种功能位点的13肽(Gly158-Lys170),从细胞和整体水平观察其对VSMC和单核巨噬细胞黏附、浸润以及内膜增生的影响,并初步探讨其作用机制。方法:用不同浓度OPN13肽(0,100,200,300mg/L)检测其对体外培养的平滑... 详细信息

目的:利用含有骨桥蛋白(OPN)多种功能位点的13肽(Gly158-Lys170),从细胞和整体水平观察其对VSMC和单核巨噬细胞黏附、浸润以及内膜增生的影响,并初步探讨其作用机制。方法:用不同浓度OPN13肽(0,100,200,300mg/L)检测其对体外培养的平滑肌细胞(VSMC)与OPN黏附的抑制作用;以不含黏附序列的6肽分子为对照组,用以确定13肽抑制黏附特异性。用球囊内皮剥脱法建立大鼠内膜增生模型。实验动物分为4组:治疗组大鼠自术前1h及术后静脉滴注13肽,连续给药7d;对照组大鼠给予非特异性对照6肽分子;模型组大鼠给予相同剂量的生理盐水;正常对照组大鼠施假手术。并利用免疫组织化学染色和Western印迹分析方法,检测血管壁中OPN、FAK、ILK的表达变化。结果:OPN13肽能特异性的及浓度依赖性的抑制VSMC与OPN的相互作用,血管内膜剥脱后给予13肽治疗组血管壁单核/巨噬细胞浸润减少,OPN及其下游信号分子ILK,FAK表达下调,内膜增生被明显抑制。结论:含有OPN多功能位点的13肽可通过阻断OPN与膜受体的相互作用而抑制血管炎症的进展和内膜增生。

关键词：骨桥蛋白细胞黏附血管内膜增生信号分子

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SM22α在细胞骨架组构及血管重塑中的作用

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生理科学进展 2006年第3期37卷 211-215页

作者：史建红温进坤韩梅河北医科大学基础医学研究所河北省医学生物技术实验室石家庄050017

血管平滑肌细胞(VSMC)表型转化是动脉粥样硬化、高血压和血管成形术后再狭窄等血管重塑性疾病的共同病理生理过程。VSMC表型转化过程中平滑肌特异基因的表达变化和细胞骨架的组构是当前研究的热点问题之一。平滑肌22α(SM22α)是近年发... 详细信息

血管平滑肌细胞(VSMC)表型转化是动脉粥样硬化、高血压和血管成形术后再狭窄等血管重塑性疾病的共同病理生理过程。VSMC表型转化过程中平滑肌特异基因的表达变化和细胞骨架的组构是当前研究的热点问题之一。平滑肌22α(SM22α)是近年发现的一种VSMC分化标志物,其表达具有平滑肌组织特异性和细胞表型特异性,该蛋白作为一种肌动蛋白细胞骨架相关蛋白参与VSMC骨架组构和收缩调节。本文就SM22α的结构特征及其在VSMC骨架组构和血管重塑中的作用机制进行综述。

关键词： SM22α 细胞骨架血管重塑平滑肌细胞表型

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SM22α对血管平滑肌细胞肌动蛋白聚合和交联的调节

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中国应用生理学杂志 2008年第4期24卷 393-397,I0009页

作者：温进坤史建红郑斌孟芳韩梅河北医科大学基础医学研究所河北省医学生物技术重点实验室河北石家庄050017

目的:探讨平滑肌22alpha(SM22α)调节血管平滑肌细胞(VSMC)骨架重构的分子机制。方法:血清饥饿法诱导VSMC由合成型转化成收缩型,转染pEGFP-SM22α表达质粒后观察SM22α在细胞中的分布及其与肌动蛋白纤丝(F-actin)的定位关系;应用反义技... 详细信息

目的:探讨平滑肌22alpha(SM22α)调节血管平滑肌细胞(VSMC)骨架重构的分子机制。方法:血清饥饿法诱导VSMC由合成型转化成收缩型,转染pEGFP-SM22α表达质粒后观察SM22α在细胞中的分布及其与肌动蛋白纤丝(F-actin)的定位关系;应用反义技术封闭内源性SM22α表达,蛋白分步提取和Western blot分析检测敲减SM22α基因表达对肌动蛋白单体G-actin聚合的影响;F-actin体外交联实验观察SM22α对F-actin交联成束的影响。结果:SM22α在细胞中的分布与F-actin相一致;抑制内源性SM22α表达后,细胞中的SMα-actin主要以可溶性单体G-actin形式存在;F-actin体外交联实验结果表明,GST-SM22α蛋白纯品可促进F-actin交联形成粗大、束状的应力纤维,而敲减内源性SM22α的细胞裂解液促进F-actin交联的活性明显降低。结论:SM22α是参与VSMC细胞骨架重构的调节蛋白,不仅可促进G-actin聚合形成F-actin,而且还可加速F-actin交联成束,在VSMC骨架重构过程中起着十分重要的作用。

关键词：平滑肌22α 血管平滑肌细胞细胞骨架肌动蛋白

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旋覆花素抑制血管内皮损伤诱导的基质重构酶表达与活化

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中国应用生理学杂志 2008年第2期24卷 156-160页

作者：李娟娟温进坤韩梅河北医科大学基础医学研究所河北省医学生物技术重点实验室河北石家庄050017

目的:观察旋覆花素对大鼠血管球囊损伤后内膜增生和基质金属蛋白酶-2(MMP-2)及组织金属蛋白酶抑制剂-2(TIMP-2)表达的影响,探讨旋覆花素防治血管再狭窄的可能作用和机制。方法:用球囊内皮剥脱法复制血管内膜增生模型;通过HE染色观察血... 详细信息

目的:观察旋覆花素对大鼠血管球囊损伤后内膜增生和基质金属蛋白酶-2(MMP-2)及组织金属蛋白酶抑制剂-2(TIMP-2)表达的影响,探讨旋覆花素防治血管再狭窄的可能作用和机制。方法:用球囊内皮剥脱法复制血管内膜增生模型;通过HE染色观察血管壁形态学变化;明胶酶图分析MMP-2的活性改变;Western blot和免疫组织化学检测MMP-2和TIMP-2的表达变化。结果:旋覆花素显著减轻血管损伤后内膜增生,抑制MMP-2的蛋白水解活性,降低MMP-2和TIMP-2的表达以及MMP-2/TIMP-2比值,并使其接近正常水平。结论:旋覆花素对球囊血管损伤后内膜增生的抑制作用与其对MMP-2/TIMP-2系统平衡调节有关。

关键词：基质金属蛋白酶-2 组织金属蛋白酶抑制剂-2 旋覆花素血管再狭窄

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无胶筛分毛细管电泳法检测微量蛋白质骨桥蛋白

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色谱 2005年第5期23卷 520-523页

作者：赵京山温进坤韩梅河北医科大学基础医学研究所河北省医学生物技术重点实验室河北石家庄050017

采用非涂层毛细管,以150mm o l/L硼酸盐缓冲液为电泳缓冲液,30g/L聚乙二醇(PEG)20000为筛分介质,经对分离条件进行优化,成功地建立了用无胶筛分毛细管电泳检测微量蛋白质的方法。用所建立的方法测定骨桥蛋白,其批内、批间迁移时间的相... 详细信息

采用非涂层毛细管,以150mm o l/L硼酸盐缓冲液为电泳缓冲液,30g/L聚乙二醇(PEG)20000为筛分介质,经对分离条件进行优化,成功地建立了用无胶筛分毛细管电泳检测微量蛋白质的方法。用所建立的方法测定骨桥蛋白,其批内、批间迁移时间的相对标准偏差均小于5%,回收率大于95%,被检测样品中骨桥蛋白的含量与其峰面积呈良好的线性关系(相关系数为0.996),最低检测限为0.079g/L。考察了无血清饥饿培养对血管平滑肌细胞分泌骨桥蛋白的影响,结果表明无血清饥饿培养24h骨桥蛋白的合成与分泌达到高峰,此后随时间延长含量随之降低,此结果与采用W estern b lo t方法检测的结果一致。该方法具有进样量小(nL级)、检测速度快、可自动化等优点,是一种简便、快捷的检测微量蛋白质的好方法。

关键词：毛细管电泳聚乙二醇20000 无胶筛分骨桥蛋白血管平滑肌细胞

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在线推扫富集-胶束电动毛细管色谱检测旋覆花素中和大鼠血浆中的旋覆花内酯

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色谱 2006年第5期24卷 508-512页

作者：赵京山温进坤韩梅河北医科大学基础医学研究所河北省医学生物技术重点实验室河北石家庄050017

采用熔融石英毛细管,以含有50mm o l/L十二烷基硫酸钠的50mm o l/L硼酸盐缓冲液为电极缓冲液,以10mm o l/L硼酸盐缓冲液为上样缓冲液,经过对分离条件的优化,成功地建立了胶束电动毛细管色谱结合在线sw eep ing(推扫)富集技术检测中性脂... 详细信息

采用熔融石英毛细管,以含有50mm o l/L十二烷基硫酸钠的50mm o l/L硼酸盐缓冲液为电极缓冲液,以10mm o l/L硼酸盐缓冲液为上样缓冲液,经过对分离条件的优化,成功地建立了胶束电动毛细管色谱结合在线sw eep ing(推扫)富集技术检测中性脂溶性物质旋覆花内酯(acety lb ritann ilac tone,ABL)的实验方法。所建方法的批内、批间测定值的相对标准偏差均小于5%,灵敏度为0.005g/L,回收率大于92%;被检测样品的含量与峰面积呈良好的线性关系,相关系数为0.997 5。用所建立的方法检测了旋覆花素中ABL的含量及其在体内的动态变化,结果表明胶束电动毛细管色谱结合在线sw eep ing样品富集技术可显著提高检测的灵敏度。该方法具有操作简单、进样量小(nL级)、检测速度快等特点,弥补了毛细管电泳在测定痕量组分方面的不足。

关键词：胶束电动毛细管色谱 sweeping在线富集技术旋覆花内酯旋覆花素大鼠血浆

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重组SM22α C端肽段促进细胞骨架重构

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中国应用生理学杂志 2007年第3期23卷 370-374页

作者：史建红郑斌孟芳温进坤韩梅河北医科大学基础医学研究所河北省医学生物技术重点实验室河北石家庄050017

目的:探讨SM22αC端功能域肽段与细胞骨架F-actin聚合的关系,明确SM22α在血管平滑肌细胞(VSMC)骨架重构中的作用。方法:构建GST-SM22αC端功能域融合蛋白原核表达质粒pGEX3X-SM22α,诱导E coli高效表达可溶性GST-SM22α融合蛋白,制备抗... 详细信息

目的:探讨SM22αC端功能域肽段与细胞骨架F-actin聚合的关系,明确SM22α在血管平滑肌细胞(VSMC)骨架重构中的作用。方法:构建GST-SM22αC端功能域融合蛋白原核表达质粒pGEX3X-SM22α,诱导E coli高效表达可溶性GST-SM22α融合蛋白,制备抗SM22α抗体,VSMC蛋白分步提取及Western blot检测F-actin/G-actin中SM22α的含量变化,GST-pull down分析和免疫共沉淀检测SM22α与actin的相互作用,细胞免疫双荧光染色观察SM22α和actin在VSMC中的定位关系。结果:所构建的pGEX3X-SM22α原核表达质粒,在0.5mmol/LIPTG,30℃诱导6h条件下,表达可溶性GST-SM22α融合蛋白的水平最高,用纯化的融合蛋白免疫新西兰白兔获得的抗血清效价为1∶16。免疫双荧光染色和蛋白分步提取分析结果表明,在VSMC再分析过程中,SM22α与F-actin共定位,GSTpull down分析和免疫共沉淀结果均显示,SM22α通过C端功能域与F-actin相互作用而参与细胞骨架的重构;但是,SM22α与G-actin的结合能力较弱。结论:本研究重组得到的SM22αC端功能域具有与F-actin结合的活性,SM22α通过该区域与actin相互作用而参与细胞骨架重构。

关键词： SM22α 可溶性表达细胞骨架血管平滑肌

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人SM22α在巴斯德毕赤酵母中的表达、纯化及抗体制备

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中国应用生理学杂志 2006年第3期22卷 379-383页

作者：温进坤聂磊李静宜程云会韩梅河北医科大学基础医学研究所河北省医学生物技术重点实验室河北石家庄050017

目的:用酵母表达重组人平滑肌22α(SM22α)蛋白,制备兔抗人SM22α多克隆抗体。方法:利用PCR从pGEM3z-SM22α质粒扩增得到人SM22α基因编码区,重组至pPIC9构建酵母表达载体,转染巴斯德毕赤酵母,进行分泌型表达。表达产物经分步盐析和CM-... 详细信息

目的:用酵母表达重组人平滑肌22α(SM22α)蛋白,制备兔抗人SM22α多克隆抗体。方法:利用PCR从pGEM3z-SM22α质粒扩增得到人SM22α基因编码区,重组至pPIC9构建酵母表达载体,转染巴斯德毕赤酵母,进行分泌型表达。表达产物经分步盐析和CM-纤维素柱层析纯化后,免疫家兔,制备兔抗人SM22α多克隆抗体。结果:所构建的pPIC9-SM22α酵母表达载体转染酵母感受态细胞后,外源性SM22α可整合至酵母染色体中,经甲醇诱导84 h,可实现SM22α的高效表达与分泌。用70%硫酸铵处理上清液,收集沉淀进行离子交换层析纯化后,经变性的聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)可见一分子量为22 kD的单一区带。用该纯化产物免疫家兔制备的兔抗人SM22α抗血清可用于检测人或大鼠血管壁中SM22α的表达水平。结论:重组人SM22α可在巴斯德毕赤酵母中进行高效表达与分泌,纯化蛋白可用于抗体制备,为研究SM22α功能提供了检测工具。

关键词：平滑肌22α 巴斯德毕赤酵母分泌表达抗血清

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