目的 :克隆小鼠内皮抑素 (m Endostatin)编码区 c DNA序列并构建含 Egr- 1启动子的 IFNγ和 m Endo-statin双基因表达载体。方法 :利用逆转录多聚酶链反应法 (RT- PCR) ,以小鼠肝细胞 m RNA为模板 ,扩增获得全长 m Endostatin,与 p MD1...
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目的 :克隆小鼠内皮抑素 (m Endostatin)编码区 c DNA序列并构建含 Egr- 1启动子的 IFNγ和 m Endo-statin双基因表达载体。方法 :利用逆转录多聚酶链反应法 (RT- PCR) ,以小鼠肝细胞 m RNA为模板 ,扩增获得全长 m Endostatin,与 p MD1 8T载体连接作全自动测序 ,并利用基因重组技术构建含 Egr- 1启动子的 IFNγ和m Endostatin双基因表达质粒。结果 :经测序证实获得的 m Endostatin序列与文献报道完全一致 ,并构建了含 Egr-1启动子的 IFNγ和 m Endostatin双基因表达质粒 p Egr- IFNγ- m Endostatin。结论 :利用 RT- PCR法成功克隆了m Endostatin的 c DNA序列 ,构建了 p Egr- IFNγ- m Endostatin重组双基因表达质粒。
来源于肿瘤组织或体外重组的gp96-肽复合物疫苗能刺激机体产生肿瘤特异性CTL反应,具有预防和治疗肿瘤的双重作用。我们前期研究表明:食管鳞癌(Esophageal squamous cell carcinoma,ESCC)组织中gp96表达明显升高,并与淋巴结转移、TNM分期、5年总生存率下降呈显著正相关,提示gp96-肽复合物可能是食管癌生物预防和治疗的重要分子靶点之一。本实验采用温和裂解法从10例ESCC及癌旁正常食管黏膜上皮(N)组织中提取蛋白,Bradford法测定蛋白浓度,从各例蛋白样本取等量蛋白制备ESCC及N组织混合蛋白;采用Pierce免疫沉淀偶联试剂盒将抗gp96抗体偶联至protein G琼脂糖凝胶,预清除混合蛋白与protein G琼脂糖凝胶非特异性结合;预清除后的混合蛋白采用免疫亲和层析法分离纯化ESCC及N中gp96-肽复合物,0.1%TFA解离gp96结合的抗原肽,超虑法分离分子量小于3 k Da肽段,C18反相层析柱脱盐、纯化gp96结合肽段,真空离心干燥肽段;电喷雾串联质谱法及生物信息学法检测分析gp96结合的抗原肽,鉴定出食管鳞癌中与gp96结合的三个抗原肽分别来自核酸酶敏感性结合蛋白-1(Y-box-binding protein 1/Nuclease-sensitive element-binding protein 1,YBX1)、S钙结合蛋白A2(S100 calcium binding protein A2,S100A2)和血红蛋白β(Hemo-globin subunit beta,HBB)等三种蛋白质分子。该结果为体外构建重组食管癌gp96-肽复合物疫苗奠定了基础,对于食管肿瘤的预防和特异性免疫治疗,将具有十分重要的理论意义和广阔的临床应用前景。
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