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西北农业学报 2025年第1期34卷 133-139页

作者：胡骁飞杨继飞邢云瑞庞杏豪孙亚宁魏凤仙河南省农业科学院动物免疫学重点实验室郑州450002 河南省农业科学院畜牧研究所郑州450002

为建立灵敏、特异的大豆凝集素(soybean agglutinin,SBA)酶联免疫吸附(enzyme-linked immuno sorbent assay,ELISA)检测方法。试验以SBA鼠源单克隆抗体为捕获抗体,SBA兔源多克隆抗血清为检测抗体,羊抗兔酶标抗体为二抗,通过对抗体的工... 详细信息

为建立灵敏、特异的大豆凝集素(soybean agglutinin,SBA)酶联免疫吸附(enzyme-linked immuno sorbent assay,ELISA)检测方法。试验以SBA鼠源单克隆抗体为捕获抗体,SBA兔源多克隆抗血清为检测抗体,羊抗兔酶标抗体为二抗,通过对抗体的工作浓度及反应时间优化,建立SBA的双抗体夹心ELISA检测方法,并用建立的方法检测大豆、大豆粕、膨化大豆粕及酶解大豆粕中SBA含量。结果表明:建立SBA双抗夹心ELISA检测方法的检测范围为39.06~1250 ng/mL,检出限为3.00 ng/mL,样品添加回收率为77.96%~116.15%,变异系数为6.11%~18.34%,与大豆中胰蛋白酶抑制因子BBI、KTI,大豆球蛋白glycinin及大豆伴球蛋白-conglycinin等其他抗营养因子均无交叉反应。大豆中SBA含量显著高于大豆粕、膨化大豆粕及酶解大豆粕(P<0.05);大豆粕中SBA含量显著高于膨化大豆粕及酶解大豆粕(P<0.05);膨化大豆粕显著高于酶解大豆粕中SBA含量(P<0.05)。综上,本研究建立了灵敏度高、特异性好的SBA双抗夹心ELISA检测方法,该方法可用于饲料中大豆凝集素的监控检测。

关键词：大豆凝集素抗营养因子多克隆抗体单克隆抗体夹心ELISA

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花生致敏蛋白Ara h 2夹心ELISA检测方法的建立

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核农学报 2025年第4期39卷 810-816页

作者：郭开通王耀邢云瑞孙亚宁宋乾召葛梦鋆蔡文锦胡骁飞河南省农业科学院动物疫病防控研究所(河南省农业科学院动物免疫学重点实验室) 河南郑州450002 河南科技大学食品与生物工程学院河南洛阳471023

为建立花生致敏蛋白Ara h 2双抗夹心酶联免疫吸附试验(ELISA)检测方法,本研究基于所制备的抗体,采用双抗体夹心检测模式,以Ara h 2鼠源单克隆抗体作为捕获抗体、兔源多克隆抗体作为检测抗体,并通过棋盘法优化抗体工作浓度,对该方法的灵... 详细信息

为建立花生致敏蛋白Ara h 2双抗夹心酶联免疫吸附试验(ELISA)检测方法,本研究基于所制备的抗体,采用双抗体夹心检测模式,以Ara h 2鼠源单克隆抗体作为捕获抗体、兔源多克隆抗体作为检测抗体,并通过棋盘法优化抗体工作浓度,对该方法的灵敏度、准确度、精密度和特异性进行鉴定。结果表明,建立的双抗夹心ELISA检测方法对Ara h 2的检出限为5.04 ng·mL^(-1),线性范围为15.63~1 000 ng·mL^(-1),添加回收率为80.12%~96.03%,批内和批间变异系数均小于10%,且特异性良好、与其他常见食物过敏原无交叉反应。本研究可为致敏蛋白Ara h 2检测提供一种快速高效的方法。

关键词：酶免疫分析花生致敏蛋白 Ara h 2 过敏反应检测

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猪流行性腹泻病毒COE蛋白在TP309水稻细胞中的表达及纯化

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动物医学进展 2025年第4期46卷 1-5页

作者：陈金炫史倩倩潘世源陈恒耀寇少康楚红燕张磊张二芹张改平河南农业大学动物医学院国家动物免疫学国际联合研究中心河南郑州450046 河南省农业科学院动物免疫学重点实验室河南郑州450002

为获得TP309水稻细胞表达的猪流行性腹泻病毒(PEDV)COE蛋白,根据水稻密码子偏爱性优化并合成COE基因,构建植物重组质粒pCAMBIA1300-COE,通过根癌农杆菌EHA105介导法将pCAMBIA1300-COE转入水稻愈伤组织。经过暗培养和潮霉素B筛选新愈伤;... 详细信息

为获得TP309水稻细胞表达的猪流行性腹泻病毒(PEDV)COE蛋白,根据水稻密码子偏爱性优化并合成COE基因,构建植物重组质粒pCAMBIA1300-COE,通过根癌农杆菌EHA105介导法将pCAMBIA1300-COE转入水稻愈伤组织。经过暗培养和潮霉素B筛选新愈伤;PCR鉴定阳性愈伤;阳性愈伤研磨后制成细胞并进行培养,阳性细胞经无糖诱导培养10 d后,Western blot鉴定表达COE蛋白;并利用Q阴离子层析和MMC阳离子层析纯化COE蛋白。结果显示,经潮霉素筛选获得73个新愈伤,PCR检测有50个阳性愈伤,阳性率约为68.49%,Western blot检测有15个水稻细胞株表达COE蛋白,COE蛋白经Q和MMC纯化后,其纯度达到50%左右。这些研究结果对制备猪流行性腹泻亚单位疫苗具有重要意义。

关键词：猪流行性腹泻 COE蛋白水稻愈伤水稻植株纯化

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新城疫病毒基因Ⅶ型血凝素-神经氨酸酶蛋白在水稻细胞中的表达及免疫原性

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农业生物技术学报 2025年第4期 879-887页

作者：史倩倩陈金炫陈恒耀寇少康楚红燕张磊潘世源张二芹张改平河南农业大学动物医学院/国家动物免疫学国际联合研究中心龙湖现代免疫实验室北京大学现代农学院河南省农业科学院动物免疫学重点实验室

新城疫是新城疫病毒（Newcastle disease virus, NDV）引起的一种急性、热性、高度接触性传染病，其中基因Ⅶ型病毒流行广泛。血凝素-神经氨酸酶蛋白（hemagglutinin-neuraminidase protein, HN）是病毒的结构蛋白，也是宿主细胞受体识... 详细信息

新城疫是新城疫病毒（Newcastle disease virus, NDV）引起的一种急性、热性、高度接触性传染病，其中基因Ⅶ型病毒流行广泛。血凝素-神经氨酸酶蛋白（hemagglutinin-neuraminidase protein, HN）是病毒的结构蛋白，也是宿主细胞受体识别和促进细胞膜融合的重要免疫原性蛋白。水稻（Oryza sativa）细胞是生产生物药物的一个有前景的经济有效的生物反应器平台，水稻α-淀粉酶3D系统包含一个诱导启动子，在糖饥饿条件下具有很强的激活活性，可以高效、高水平地表达外源蛋白。本研究从NCBI上筛选NDV基因Ⅶ型HN氨基酸序列，根据水稻密码子偏爱性对HN基因进行优化，构建了重组植物表达载体pCAMBIA1300-HN；利用根癌农杆菌（Agrobacterium tumefaciens）介导法将HN基因转入到水稻愈伤组织中，经潮霉素筛选和PCR鉴定阳性愈伤，在阳性愈伤中诱导表达HN蛋白，通过Western blot鉴定。利用SP阳离子层析和Hiloard 75 pg凝胶层析纯化HN蛋白,并以5和10μg剂量分别与Al（OH）3和50V佐剂乳化，免疫6周龄BALB/c雌鼠（Mus musculus），通过血凝抑制（hemagglutination inhibition, HI）实验和中和实验（neutralizing test, NT）检测抗体的效价，并检测二次免疫6周后白细胞介素-2 （interleukin-2, IL-2）水平。结果显示，成功构建了重组植物表达载体pCAMBIA1300-HN，并鉴定出85个阳性愈伤，HN蛋白在水稻细胞中成功表达和纯化。免疫小鼠后，除PBS组，每组产生的抗体水平达到免疫保护效果（HI≥24），能够产生中和抗体，具有病毒中和作用。本研究在水稻细胞中表达了新城疫HN蛋白，建立了HN蛋白纯化方法，低剂量HN蛋白免疫动物后，具有良好的免疫效果，为今后新城疫亚单位疫苗的研究提供了参考依据。

关键词：新城疫病毒(NDV) 血凝素-神经氨酸酶蛋白(HN) 水稻细胞纯化免疫试验

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两种司帕沙星完全抗原的合成鉴定及免疫效果研究

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中国食品学报 2014年第4期14卷 191-197页

作者：贾国超张改平职爱民宋春美张静李梦琴河南农业大学食品科学技术学院郑州450002 河南省农业科学院农业部动物免疫学重点开放实验室河南省动物免疫学重点实验室郑州450002

目的:用两种方法合成司帕沙星人工抗原,并制备相应的鼠源多克隆抗体。方法:用混合酸酐法和DCC法将半抗原SPFX与BSA偶联制备免疫原SPFX-BSA,通过DCC法制备人工包被原SPFX-OVA,采用紫外光扫描和聚丙烯酰胺凝胶电泳进行鉴定与分析。免疫小... 详细信息

目的:用两种方法合成司帕沙星人工抗原,并制备相应的鼠源多克隆抗体。方法:用混合酸酐法和DCC法将半抗原SPFX与BSA偶联制备免疫原SPFX-BSA,通过DCC法制备人工包被原SPFX-OVA,采用紫外光扫描和聚丙烯酰胺凝胶电泳进行鉴定与分析。免疫小鼠后,采用间接ELISA法测定多抗血清效价,阻断ELISA,鉴定其抑制价和特异性。结果:UV和SDS-PAGE鉴定结果初步表明SPFX人工抗原成功合成;动物试验表明,4只小鼠多抗血清效价均在3.2×104以上,其中1号小鼠IC50值为163.87 ng/mL,与其他竞争物无明显交叉反应,抗体特异性良好。结论:两种偶联方法均能成功合成人工抗原,制备出鼠源抗SPFX多克隆抗体,其中混合酸酐法能明显提高完全抗原的合成和免疫效果。

关键词：司帕沙星人工抗原合成多抗血清酶联免疫吸附

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酶联免疫法检测猪肉中的司帕沙星

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现代食品科技 2022年第2期38卷 266-271页

作者：邢广旭赵东孙雪峰温留丁张颖硕张改平河南省农业科学院动物免疫学重点实验室河南郑州450003

为了建立一种检测猪肉中司帕沙星(SPFX)残留的方法,并且在检测时具有特异性高,背景低和无需样品预处理的特点。该研究制备了间接竞争性酶联免疫吸附剂和特异性抗司帕沙星单克隆抗体。结果表明,该抗体与氟甲喹(11.99%)、氟罗沙星(11.14%... 详细信息

为了建立一种检测猪肉中司帕沙星(SPFX)残留的方法,并且在检测时具有特异性高,背景低和无需样品预处理的特点。该研究制备了间接竞争性酶联免疫吸附剂和特异性抗司帕沙星单克隆抗体。结果表明,该抗体与氟甲喹(11.99%)、氟罗沙星(11.14%)、恩诺沙星(4.60%)、环丙沙星(0.31%)几乎没有交叉反应。该方法测定了添加SPFX的猪肉中的药物残留,检测内变异系数小于5.68%,检测间变异系数小于5.51%。检测间和检测内的平均回收率分别为102%~106%和101%~104%。该抗体对SPFX的IC_(50)为31μg/L,没有抗体具有四种结构相关化合物和其他化合物。高效液相色谱(HPLC)和酶联免疫吸附试验(ELISA)的结果进一步证实了icELISA快速检测猪肉中SPFX的可靠性和准确性。该研究表明icELISA法检测猪肉中SPFX残留分析是一种可靠、简便、低成本的方法。

关键词：司帕沙星单克隆抗体酶联免疫吸附试验猪肉

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伏马菌素B1兔源多克隆抗血清的制备与鉴定

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中国食品学报 2014年第4期14卷 216-221页

作者：王耀胡骁飞刘胜男裴亚峰张改平李志西邓瑞广河南省农业科学院农业部动物免疫学重点实验室河南省动物免疫学重点实验室郑州450002 西北农林科技大学食品科学与工程学院陕西杨凌712100 河南省农业科学院农业部动物免疫学重点实验室河南省动物免疫学重点实验室郑州450002 三门峡出入境检验检疫局河南三门峡472000 河南农业大学牧医工程学院郑州450002

目的:合成伏马菌素B1(FB1)人工抗原,制备敏感性高、特异性强的FB1兔源多克隆抗血清。方法:采用EDC法制备人工抗原,将FB1分别偶联于载体蛋白牛血清蛋白(BSA)和卵清蛋白(OVA)上。通过免疫新西兰兔制备多抗血清,间接ELISA方法测定抗血清效... 详细信息

目的:合成伏马菌素B1(FB1)人工抗原,制备敏感性高、特异性强的FB1兔源多克隆抗血清。方法:采用EDC法制备人工抗原,将FB1分别偶联于载体蛋白牛血清蛋白(BSA)和卵清蛋白(OVA)上。通过免疫新西兰兔制备多抗血清,间接ELISA方法测定抗血清效价,间接竞争ELISA鉴定敏感性和特异性。结果:2只新西兰兔生产的多抗血清效价在1∶1.28×105以上,其中,2号多抗血清敏感性最好,半数抑制浓度IC50为17 ng/mL,且具有良好的特异性。结论:成功制备了敏感性高、特异性强的FB1兔源多克隆抗体血清,为建立FB1免疫学快速检测方法提供了理论基础。

关键词：伏马菌素B1 人工抗原兔源多抗血清酶联免疫吸附

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高灵敏度磁荧光免疫层析试纸模式构建及在呕吐毒素检测中的应用

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食品科学 2022年第18期43卷 310-317页

作者：孙亚宁杨苏珍杨继飞胡骁飞陈鑫鑫张颖硕邓瑞广张改平河南省农业科学院动物免疫学重点实验室河南郑州450002 河南农业大学动物医学院河南郑州450002

构建基于磁荧光纳米材料的免疫层析试纸模式,弥补现在免疫层析技术的不足,为更灵敏的免疫学快速检测提供技术支撑。以呕吐毒素(deoxynivalenol,DON)为靶标,采用溶剂热法制备羧基修饰的超顺磁颗粒,碳二亚胺法将磁颗粒、绿色荧光蛋白及DO... 详细信息

构建基于磁荧光纳米材料的免疫层析试纸模式,弥补现在免疫层析技术的不足,为更灵敏的免疫学快速检测提供技术支撑。以呕吐毒素(deoxynivalenol,DON)为靶标,采用溶剂热法制备羧基修饰的超顺磁颗粒,碳二亚胺法将磁颗粒、绿色荧光蛋白及DON单克隆抗体进行偶联,一步法制备磁荧光抗体探针,以DON人工抗原(DON-BSA)为检测线建立磁荧光免疫层析试纸。同时用胶体金标记DON单克隆抗体,以DON-BSA为检测线建立胶体金免疫层析试纸;制备的磁荧光抗体探针具有很好的磁性、荧光特性及抗体反应性,基于该探针成功制备了DON磁荧光免疫层析试纸,该试纸回归方程为y=-0.562x+0.921,R^(2)=0.990,IC_(50)为5.611 ng/mL,检出限为1.089 ng/mL;制备了DON胶体金免疫层析试纸,该试纸裸眼检测灵敏度为500 ng/mL;定量检测回归方程为y=-0.543x+1.485,R^(2)=0.991,IC_(50)为65.16 ng/mL,检出限为11.94 ng/mL。DON磁荧光免疫层析试纸的灵敏度是胶体金免疫层析试纸的10.96倍。本实验建立的磁荧光免疫层析试纸模式可以同时实现样品的富集及荧光信号检测,提高检测灵敏度,并成功用于DON的检测,为磁荧光纳米颗粒广泛应用于免疫层析领域提供参考。

关键词：磁荧光纳米颗粒免疫学检测呕吐毒素试纸

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西马特罗人工抗原的合成及鼠源多克隆抗血清的制备

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华北农学报 2010年第4期25卷 97-101页

作者：职爱民刘庆堂李青梅杨苏珍胡骁飞柴书军邓瑞广张改平河南省农业科学院农业部动物免疫学重点实验室河南省动物免疫学重点实验室河南郑州450002

拟合成并鉴定西马特罗(Cimaterol,CIM)人工抗原,通过动物免疫生产亲和力高、特异性好的鼠源CIM多克隆抗血清。通过重氮化方法将西马特罗偶联于载体蛋白BSA和OVA上,分别合成免疫抗原BSA-CIM和包被抗原OVA-CIM,并采用紫外分光光度法和SDS-... 详细信息

拟合成并鉴定西马特罗(Cimaterol,CIM)人工抗原,通过动物免疫生产亲和力高、特异性好的鼠源CIM多克隆抗血清。通过重氮化方法将西马特罗偶联于载体蛋白BSA和OVA上,分别合成免疫抗原BSA-CIM和包被抗原OVA-CIM,并采用紫外分光光度法和SDS-PAGE进行了鉴定。结果表明,半抗原CIM和载体蛋白偶联成功。动物免疫试验结果显示,6只小鼠效价均达1×10-3以上,且4号小鼠多抗血清抗CIM的IC50为86.9ng/mL,表明成功获得了高效价、特异性好、亲和力高的的鼠源抗CIM多抗血清。

关键词：西马特罗人工抗原合成多抗血情

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植酸酶鼠源多克隆抗血清的制备

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中国农业科学 2011年第3期44卷 613-619页

作者：胡骁飞魏凤仙邢广旭职爱民柴书军孙亚宁王磊邓瑞广张改平农业部动物免疫学开放实验室/河南省动物免疫学重点实验室河南省农业科学院河南省农业科学院畜牧兽医研究所

【目的】制备灵敏性高、特异性强的植酸酶多克隆抗体。【方法】将初步纯化的麸皮植酸酶蛋白经凝胶电泳鉴定纯度后,按50μg蛋白/只.次免疫Balb/C小鼠,共免疫4次,每次间隔4周,最后一次免疫60 d后,摘眼球取血,制备抗血清。利用间接ELISA方... 详细信息

【目的】制备灵敏性高、特异性强的植酸酶多克隆抗体。【方法】将初步纯化的麸皮植酸酶蛋白经凝胶电泳鉴定纯度后,按50μg蛋白/只.次免疫Balb/C小鼠,共免疫4次,每次间隔4周,最后一次免疫60 d后,摘眼球取血,制备抗血清。利用间接ELISA方法测定抗血清效价,间接竞争ELISA测定敏感性和特异性。【结果】凝胶电泳的麸皮植酸酶只有一个条带;血清植酸酶抗体效价达1×104;半数抑制浓度达148.87 ***-1。此抗血清对市售的普通微生物植酸酶、市售包被微生物植酸酶及浓缩的微生物植酸酶的半数抑制浓度分别达到165.59、163.80和166.51 ***-1,交叉反应率分别为89.85%、90.88%和89.41%。100℃煮沸5 min后的麸皮、市售普通微生物植酸酶、市售包被微生物植酸酶及浓缩酶半数抑制浓度分别为2 871.34、5 208.85、7 914.12和5 804.24 ***-1,交叉反应率分别为5.18%、2.86%、1.88%及2.56%。【结论】制备出了具有高效价、高灵敏度和特异性的鼠源植酸酶多克隆抗体,为植酸酶单克隆抗体制备及植酸酶ELISA检测试剂盒研制奠定了基础。

关键词：植酸酶 Balb/C小鼠 ELISA 多克隆抗血清

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