检索结果-内蒙古大学图书馆

动物营养学报 2021年第6期33卷 3250-3258页

作者：黄翠翠周若钰沈媛媛张瑞强杨彩梅浙江农林大学动物科技学院·动物医学院浙江省畜禽绿色生态健康养殖应用技术研究重点实验室动物健康互联网检测技术浙江省工程实验室临安311300

本试验旨在研究丁酸梭菌对肉鸡屠宰性能、肌肉品质和抗氧化功能的影响。选取360只健康的1日龄爱拔益加雄性肉仔鸡,随机分为3组,分别为对照组、抗生素组和丁酸梭菌组,每组8个重复,每个重复15只鸡。对照组饲喂无抗生素基础饲粮,抗生素组... 详细信息

本试验旨在研究丁酸梭菌对肉鸡屠宰性能、肌肉品质和抗氧化功能的影响。选取360只健康的1日龄爱拔益加雄性肉仔鸡,随机分为3组,分别为对照组、抗生素组和丁酸梭菌组,每组8个重复,每个重复15只鸡。对照组饲喂无抗生素基础饲粮,抗生素组饲喂基础饲粮+75 mg/kg金霉素,丁酸梭菌组饲喂基础饲粮+500 mg/kg丁酸梭菌(活菌数1×109 CFU/g)。试验期为42 d。结果表明:1)与对照组相比,丁酸梭菌组肉鸡末重、屠宰率和全净膛率显著提高(P<0.05),胸肌24 h的红度值和pH显著提高(P<0.05),胸肌粗蛋白质和粗脂肪含量显著提高(P<0.05),胸肌24 h的亮度值和蒸煮损失显著降低(P<0.05),胸肌总抗氧化能力以及总超氧化物歧化酶和谷胱甘肽过氧化物酶活性显著提高(P<0.05),胸肌丙二醛含量显著降低(P<0.05),胸肌核因子E2相关因子2(Nrf2)、谷胱甘肽过氧化物酶1、超氧化物歧化酶1和血红素氧合酶1的mRNA相对表达量显著提高(P<0.05)。2)与抗生素组相比,丁酸梭菌组肉鸡胸肌肉蒸煮损失显著降低(P<0.05)。综上所述,饲粮添加丁酸梭菌可提高肉鸡末重,改善屠宰性能和胸肌肉品质,激活Nrf2信号通路相关基因的表达,增强肌肉抗氧化功能,表明丁酸梭菌可作为抗生素替代物应用于肉鸡饲粮。

关键词：肉鸡丁酸梭菌屠宰性能肉品质抗氧化功能核因子E2相关因子2

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江浙皖部分地区副鸡禽杆菌分离鉴定及生物学特性研究

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动物医学进展 2024年第5期45卷 39-45页

作者：吴娴毕海洋张燕茹李向臣何玉龙舒建洪武永淑浙江理工大学生命科学与医药学院浙江杭州310018 浙江理工大学绍兴生物医药研究院浙江绍兴312366 浙江农林大学动物科技学院动物医学院浙江省畜禽绿色生态健康养殖应用技术研究重点实验室动物健康互联网检测技术浙江省工程实验室动物医学与健康管理浙江省国际科技合作基地中澳动物健康大数据分析联合实验室浙江杭州311300

为了解江浙皖地区鸡传染性鼻炎流行状况,对浙江、江苏和安徽部分地区疑似鸡传染性鼻炎的8个鸡场进行样品采集,对122份样品进行病原菌分离,对10株分离株进行形态学、卫星试验、PCR鉴定、生化鉴定和血清型鉴定等检测;利用分离株人工感染SP... 详细信息

为了解江浙皖地区鸡传染性鼻炎流行状况,对浙江、江苏和安徽部分地区疑似鸡传染性鼻炎的8个鸡场进行样品采集,对122份样品进行病原菌分离,对10株分离株进行形态学、卫星试验、PCR鉴定、生化鉴定和血清型鉴定等检测;利用分离株人工感染SPF鸡的动物回归试验,对攻毒后7 d和14 d的鸡只进行病理剖检和病理组织切片观察。结果表明,122份样品中副鸡禽杆菌阳性数为48个,阳性率为39.3%,8个养殖场的阳性率为36.8%~50.0%。10株副鸡禽杆菌分离菌,其中A型3株、B型4株、C型3株,致病率为60%~80%。表明不同血清型副鸡禽杆菌在江浙皖地区均有流行,具有一定的致病性,这为鸡传染性鼻炎三价疫苗研发和防控提供参考。

关键词：鸡传染性鼻炎副鸡禽杆菌分离鉴定

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2015年~2021年我国东部地区猪流行性腹泻病毒S1蛋白关键表位的变异分析

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中国预防兽医学报 2023年第9期45卷 968-972页

作者：程亚豪胡灵子刘雅琦周莹珊杜静周兴东王晓杜吴瑗董婉玉浙江农林大学动物科技学院/动物医学院浙江省畜禽绿色生态健康养殖应用技术研究重点实验室/动物健康互联网检测技术浙江省工程实验室/动物医学与健康管理浙江省国际科技合作基地/中澳动物健康大数据分析联合实验室浙江杭州311300 金华职业技术学院农学院浙江金华321007

为了解2015年~2021年我国东部地区猪流行性腹泻病毒(PEDV)的流行特征和遗传变异规律,本研究利用RT-PCR扩增2015年~2017年11株分离自浙江地区PEDV流行株的S1基因序列,并与GenBank中我国东部地区(上海、江苏、山东、河南和安徽)的86株PED... 详细信息

为了解2015年~2021年我国东部地区猪流行性腹泻病毒(PEDV)的流行特征和遗传变异规律,本研究利用RT-PCR扩增2015年~2017年11株分离自浙江地区PEDV流行株的S1基因序列,并与GenBank中我国东部地区(上海、江苏、山东、河南和安徽)的86株PEDV流行株的S1基因序列通过MEGA 7.0软件比较分析S1基因的遗传进化关系,采用CLC Sequence Viewer 8软件分析比对S1蛋白氨基酸序列的变异。PEDV S1基因遗传进化分析结果显示,97株PEDV中有92%的流行株属于G2型,与疫苗株CV777同源性较低(90.4%~96.1%),山东地区2017年~2018年间的部分流行株与疫苗株CV777等属于G1型;G2型中,33%的流行株属于G2a型,67%的流行株属于G2b亚型,其中2019年~2021年的流行株有15%流行株属于G2a亚型,85%的流行株属于G2b亚型。S1蛋白关键表位的变异分析结果显示,与经典株CV777相比,中和表位COE(CO-26K equivalent epitope)发生8个氨基酸位点(A^(517)S、S^(523)G、V^(527)I、T^(549)S、G^(594)S、A^(605)E/D、L^(612)F/Y、I^(635)V)的突变,SS2区域无氨基酸变异,SS6发生1个氨基酸位点(Y^(766)S)的突变,2018年后出现新的突变位点(T^(636)I和S^(749)G)。不同地区S1蛋白关键表位的变异分析结果显示,aa501变异在河南地区(L^(501)P)和江苏地区(L^(501)W)存在明显的差异;aa536突变(F^(536)L)多集中于河南、山东地区的流行株,aa542突变(D^(542)E)集中于江苏、上海地区。本研究首次系统分析了我国东部地区PEDV流行株S1基因及其氨基酸的遗传变异规律,为我国该地区PEDV变异株疫苗选择、生物安全防控方案制定提供了参考依据。

关键词：猪流行性腹泻病毒 S1基因遗传变异序列分析

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单增李斯特菌DegU直接调控CtsR介导的温度适应

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中国兽医学报 2023年第5期43卷 986-992页

作者：金浩博徐加利郑晨煦邓思敏程昌勇江玲丽宋厚辉浙江农林大学动物科技学院/动物医学院浙江省畜禽绿色生态健康养殖应用技术研究重点实验室/动物健康互联网检测技术浙江省工程研究中心/浙江省动物医学与健康管理国际科技合作基地/中澳动物健康大数据分析联合实验室浙江杭州311300 宁波卫生职业技术学院浙江宁波315100

在食品加工过程中温和的热处理方式难以完全消灭耐热性强的食源性单增李斯特菌,该菌对食品安全构成显著风险。团队前期发现李斯特菌孤儿反应调节因子DegU与细菌的耐热应激密切相关,为进一步探索DegU参与温度适应调控的分子机制,本研究... 详细信息

在食品加工过程中温和的热处理方式难以完全消灭耐热性强的食源性单增李斯特菌,该菌对食品安全构成显著风险。团队前期发现李斯特菌孤儿反应调节因子DegU与细菌的耐热应激密切相关,为进一步探索DegU参与温度适应调控的分子机制,本研究以单增李斯特菌EGD-e为参考菌株,利用同源重组方法构建单增李斯特菌基因缺失株ΔdegU和回补株CΔdegU,在前期基础上挖掘DegU调控单增李斯特菌适应环境温度的相关分子机制。研究结果显示:荧光定量PCR试验发现单增李斯特菌缺失degU后导致基因ctsR(编码应激调节因子CtsR)的转录水平显著降低;凝胶迁移阻滞试验首次证明DegU能与基因ctsR的启动子区结合,表明DegU以直接方式调控ctsR。综上,本研究发现DegU通过直接调控应激调节因子CtsR的表达适应环境温度变化,为进一步深入理解单增李斯特菌等重要人兽共患病原菌适应环境应激过程中的调控机制奠定了研究基础,具有重要的公共卫生学意义。

关键词：单增李斯特菌 DegU 应激调节因子CtsR 温度适应

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单增李斯特菌感染并调控宿主丙酰辅酶A羧化酶α(PCCA)的研究

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中国预防兽医学报 2023年第8期45卷 787-793页

作者：魏思雨陈绵绵刘郁匆章先江玲丽孙静宋厚辉程昌勇浙江农林大学动物科技学院/动物医学院/浙江省畜禽绿色生态健康养殖应用技术研究重点实验室/动物健康互联网检测技术浙江省工程研究中心/浙江省动物医学与健康管理国际科技合作基地/中澳动物健康大数据分析联合实验室浙江杭州311300 宁波卫生职业技术学院浙江宁波315100

为探究单增李斯特菌感染与宿主丙酰辅酶A羧化酶α(PCCA)表达的相互影响机制,本研究将单增李斯特菌野生株(LM-EGD-e)以MOI 200感染HeLa细胞5 h后,利用qRT-PCR检测感染LM-EGD-e后HeLa细胞中Pcca基因的转录水平变化,结果显示LM-EGD-e感染H... 详细信息

为探究单增李斯特菌感染与宿主丙酰辅酶A羧化酶α(PCCA)表达的相互影响机制,本研究将单增李斯特菌野生株(LM-EGD-e)以MOI 200感染HeLa细胞5 h后,利用qRT-PCR检测感染LM-EGD-e后HeLa细胞中Pcca基因的转录水平变化,结果显示LM-EGD-e感染HeLa细胞中Pcca基因的转录水平无明显变化(log2FC=-0.305);采用相应试剂盒分别提取感染后的HeLa细胞蛋白和线粒体蛋白,采用western blot检测PCCA蛋白表达变化,结果显示,LM-EGD-e感染后的HeLa细胞中,以及线粒体中PCCA蛋白表达水平均无显著变化(P>0.05)。PCR扩增Pcca基因后构建pCMV-N-HA-PCCA重组质粒,并经PCR和测序鉴定正确后转染HeLa细胞中过表达PCCA蛋白后,利用qRT-PCR检测HeLa细胞中Pcca基因的转录水平,收集细胞总蛋白采用western blot检测PCCA蛋白表达水平,结果显示,与转染空载体的细胞相比,转染重组质粒的HeLa细胞中Pcca基因的转录水平上调(log2FC=8.454),且细胞内PCCA蛋白表达量显著增加(P<0.001)。利用LM-EGD-e以MOI 200感染过表达PCCA蛋白的HeLa细胞,在感染后2 h、5 h和8 h分别收集感染细胞进行点样计数,结果显示,感染后各时间点PCCA蛋白过表达显著或极显著抑制LM-EGD-e的感染及其在胞内增殖的能力(P<0.05、P<0.001、P<0.001)。综上所述,单增李斯特菌感染对宿主细胞内PCCA蛋白的表达无显著影响,但在宿主细胞中过表达PCCA会降低单增李斯特菌的胞内增殖能力。本研究首次探究了单增李斯特菌与宿主PCCA蛋白的调控关系,为深入探究单增李斯特菌等重要胞内菌的感染与宿主的内在联系机制,以及防控该病原感染奠定了基础。

关键词：单增李斯特菌丙酰辅酶A羧化酶α(PCCA) 病原宿主调控关系

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大肠杆菌P88噬菌体gp52和gp53基因对其裂解活性和宿主谱形成影响的研究

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中国预防兽医学报 2023年第10期45卷 994-1000页

作者：费定润吴柔霖程丽丽鲁珂蓥庄楠茜孙静程昌勇陈绵绵宋厚辉浙江农林大学动物科技学院/动物医学院/浙江省畜禽绿色生态健康养殖应用技术研究重点实验室/动物健康互联网检测技术浙江省工程研究中心/浙江省动物医学与健康管理国际科技合作基地/中澳动物健康大数据分析联合实验室浙江杭州311300 台州市椒江区农业农村和水利局浙江台州318000

为探究大肠杆菌溶原性噬菌体P88中非结构与功能基因gp52和gp53对其裂解活性和宿主谱形成的影响,本研究在P88宿主细菌K88基因组中对其进行基因工程操作,然后诱导出相应噬菌体进行功能研究。首先在大肠杆菌Red同源重组质粒p KD46基础上,融... 详细信息

为探究大肠杆菌溶原性噬菌体P88中非结构与功能基因gp52和gp53对其裂解活性和宿主谱形成的影响,本研究在P88宿主细菌K88基因组中对其进行基因工程操作,然后诱导出相应噬菌体进行功能研究。首先在大肠杆菌Red同源重组质粒p KD46基础上,融合p ST98-AS质粒的四环素抗性基因和I-Sce I核酸内切酶基因,构建缺失质粒p WRG99。利用质粒p WRG99分别构建大肠杆菌K88的gp52和gp53基因缺失突变株(Δgp52和Δgp53)并经PCR和测序鉴定。利用丝裂霉素C诱导Δgp52和Δgp53,采用双层平板法检测噬菌体的裂解活性,结果显示,Δgp52和Δgp53的诱导液可以在大肠杆菌DE048为宿主菌的平皿上形成清晰的噬菌斑,表明Δgp52和Δgp53能诱导出可以感染DE048的噬菌体(将该噬菌体命名为P88-52和P88-53),并且gp52和gp53基因缺失均不影响噬菌体P88的形成和裂解活性。将P88-52和P88-53纯化并经电镜观察,结果显示,P88-52和P88-53与野生株P88形态相似,具有P2-like噬菌体典型的肌尾和短尾丝特征,表明gp52和gp53基因缺失均不影响P88噬菌体颗粒的形态。利用P88的宿主菌对P88-52和P88-53进行宿主谱分析,结果显示,P88-52和P88-53在DE048为宿主菌的平皿上均可以形成清晰的噬菌斑,在MC1061、DH5α和BL21为宿主菌的平皿上均不能形成噬菌斑,与噬菌体P88宿主谱相同,表明gp52和gp53基因缺失均不影响P88噬菌体的宿主谱。综上所述,在宿主菌K88基因组的基础上缺失gp52和gp53基因后,诱导出的P88突变噬菌体的裂解活性和宿主谱均不受影响。本研究通过在宿主菌中对前噬菌体基因编辑来研究溶原性噬菌体的基因功能,为其他溶原性噬菌体基因功能的研究提供了参考依据。

关键词：大肠杆菌前噬菌体裂解活性宿主谱

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BVDV感染对小鼠巨噬细胞IFN-β相关信号分子的影响

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中国兽医学报 2023年第9期43卷 1828-1836页

作者：段明媚曹唱唱赵心怡陈斐周彬姜胜邵春艳周莹珊董婉玉杨杨王晓杜宋厚辉宋泉江浙江农林大学动物科技学院/动物医学学院、浙江省畜禽绿色生态健康养殖应用技术研究重点实验室/动物健康互联网检测技术浙江省工程实验室/动物医学与健康管理浙江省国际科技合作基地/中澳动物健康大数据分析联合实验室浙江杭州311300 山东省烟台市招远市辛庄畜牧兽医站山东烟台265400

为了探究致细胞病变型牛病毒性腹泻病毒(bovine viral diarrhealvirus,BVDV)对小鼠巨噬细胞IFN-β相关信号分子的影响,以0.1和3 MOI感染小鼠巨噬细胞RAW264.7,通过RT-qPCR、Western blot、ELISA等方法检测小鼠巨噬细胞中TLR37/TLR7、IRF3/IRF7、STAT1、IFN-β、ISG15/OAS1和USP18/SOCS1等因子的转录和表达水平差异,并对巨噬细胞中BVDV拷贝数进行检测。结果显示BVDV可以进入巨噬细胞细胞内,但病毒拷贝数不能随时间而增长。BVDV进入小鼠巨噬细胞先后上调TLR3和下调TLR7的转录水平,继而显著上调IRF3和IRF7转录水平,并呈现一定的剂量依赖性。STAT1和IFN-β的转录和表达也随BVDV感染而显著升高,而且IFN-β表达量随BVDV的病毒量和感染时间而增加。发挥抗病毒活性的ISG15和OAS1转录水平在BVDV感染前期出现显著升高,感染后期恢复正常,同时在感染后期干扰素负性调节因子USP18和SOCS1转录水平显著升高。所以致细胞病变型BVDV可以感染小鼠巨噬细胞,但不能复制,但可以通过TLR3/7-IRF3/7激活IFN相关信号通路,并接受负性调节因子的调控。

关键词：牛病毒性腹泻病毒小鼠巨噬细胞复制干扰素

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华南虎子宫内膜炎摩氏摩根菌分离鉴定及生物学特性研究

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中国畜牧兽医 2023年第3期50卷 1271-1278页

作者：胡依凡马敬华白思琦翟祎梦刘建勋宋厚辉杨永春浙江农林大学动物科技学院·动物医学院浙江省畜禽绿色生态健康养殖应用技术研究重点实验室动物健康互联网检测技术浙江省工程研究中心浙江省动物医学与健康管理国际科技合作基地中澳动物健康大数据分析联合实验室杭州311300 杭州野生动物世界杭州311400 山东畜牧兽医职业学院潍坊261000

【目的】对杭州野生动物世界1例成年雌性华南虎(Panthera tigris amoyensis)子宫内膜炎病例的病原进行分离鉴定及生物学特性研究。【方法】无菌采集患虎子宫分泌物进行细菌分离培养、形态观察、梅里埃Vitek 2 COMPACT系统的生化鉴定以及... 详细信息

【目的】对杭州野生动物世界1例成年雌性华南虎(Panthera tigris amoyensis)子宫内膜炎病例的病原进行分离鉴定及生物学特性研究。【方法】无菌采集患虎子宫分泌物进行细菌分离培养、形态观察、梅里埃Vitek 2 COMPACT系统的生化鉴定以及16S rDNA序列分析,采用小鼠腹腔接种模型检测临床分离株致病性,并通过药敏纸片扩散法K-B鉴定该菌对50种药物的敏感性,采用筛选的敏感药物联合对症治疗,持续观察疾病是否复发及其产仔情况。【结果】从患虎子宫分泌物中获得1株革兰阴性短棒状杆菌;梅里埃Vitek 2 COMPACT系统革兰阴性卡鉴定结果显示,该临床分离株为摩氏摩根菌,菌株可发酵葡萄糖,分解甘露糖、D-葡萄糖,且尿素酶、磷酸酶、鸟氨酸脱羧酶、γ-谷氨酰转移酶反应呈阳性;序列比对分析发现,16S rDNA序列与摩氏摩根菌的相似性最高,达99%以上,进一步表明该菌为摩氏摩根菌,并命名为HNH2019;药敏结果显示,该菌多重耐药,对多黏菌素B、丁胺卡那、复方新诺明、麦迪霉素、四环素、头孢哌酮等33种药物呈不同程度的耐药,对头孢噻肟、头孢曲松和头孢西丁等6种药物中度敏感,对妥布霉素、洛美沙星、依诺沙星和氟苯尼考等11种药物敏感;小鼠致病性分析结果显示,该分离株腹腔接种ICR小鼠的半数致死量为1×107.5 CFU;采用敏感药物治疗后,该虎痊愈且连续3年未复发,截至2022年9月,该母虎已经多次怀孕并合计生产了5仔。【结论】本研究分离鉴定到1株华南虎源多重耐药致病性摩氏摩根菌,经筛选的敏感药物治疗,该虎子宫内膜炎痊愈未复发,研究结果为同类疫病防治提供了病例参考和数据支持,提示应重视摩氏摩根菌对动物的潜在危害。

关键词：华南虎摩氏摩根菌子宫内膜炎耐药

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基于基因缺失减毒单增李斯特菌的小鼠宫颈癌治疗性疫苗效果评估

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农业生物技术学报 2022年第10期30卷 1987-1996页

作者：汪枫婷孙静刘晨程茵蒋昕祝艺然卫芳芳章先宋厚辉程昌勇浙江农林大学动物科技学院.动物医学院/浙江省畜禽绿色生态健康养殖应用技术研究重点实验室/动物健康互联网检测技术浙江省工程研究中心/浙江省动物医学与健康管理国际科技合作基地/中澳动物健康大数据分析联合实验室

减毒单增李斯特菌(Listeria monocytogenes)作为一种安全高效的异源抗原递呈载体可用于肿瘤免疫治疗。缺失重要毒力基因是目前较为成熟的李斯特菌减毒策略。基因缺失减毒菌株ΔactAΔinlB (简称ΔAB)是其中一种较为成熟、安全的李斯特... 详细信息

减毒单增李斯特菌(Listeria monocytogenes)作为一种安全高效的异源抗原递呈载体可用于肿瘤免疫治疗。缺失重要毒力基因是目前较为成熟的李斯特菌减毒策略。基因缺失减毒菌株ΔactAΔinlB (简称ΔAB)是其中一种较为成熟、安全的李斯特菌肿瘤免疫治疗疫苗载体。本研究旨在ΔAB基础上，利用肿瘤相关抗原与重要毒力因子融合表达的创新手段，构建一种能高效表达和递呈宫颈癌相关抗原E7的肿瘤疫苗载体(ΔAB-E7)，以肿瘤生物学方法评估ΔAB-E7在小鼠(Mus musculus)宫颈癌模型中的免疫治疗效果。本研究利用细菌分子遗传操作技术构建ΔAB，在ΔAB基础上构建李斯特菌溶血素O (Listeriolysin O,LLO)和肿瘤抗原E7融合表达的ΔAB-E7；通过Western blot验证ΔAB-E7菌株中的E7抗原能否与LLO融合表达；利用细菌体外培养以及吞噬细胞内增殖实验研究体外生长能力，细胞内复制和增殖能力；通过小鼠脏器内细菌增殖实验评估ΔAB及ΔAB-E7在小鼠体内的增殖能力；构建小鼠宫颈癌模型，通过记录肿瘤模型在小鼠体内的生长趋势评价ΔAB-E7的免疫治疗效果。结果显示，ΔAB-E7菌株的E7抗原能与LLO融合表达并正常分泌；ΔAB及ΔAB-E7菌株在体外生长能力与野生型无显著差异，并且在吞噬细胞中保持稳定的增殖能力；ΔAB及ΔAB-E7感染小鼠后致病力显著下降，在小鼠脏器中的增殖能力显著降低，表明其毒力减弱，在小鼠感染模型中具有安全性；在小鼠宫颈癌模型中，ΔAB-E7免疫治疗组小鼠肿瘤的生长趋势明显较对照组更慢，表明ΔAB-E7抑制肿瘤生长，展现了良好的免疫治疗效果。本研究制备了一种基于减毒李斯特菌的小鼠宫颈癌治疗载体疫苗，为人类宫颈癌及其他恶性肿瘤的免疫治疗提供技术支持。

关键词：减毒单增李斯特菌宫颈癌免疫疗法疫苗载体 ΔAB-E7

来源：评论

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单增李斯特菌PTS系统转运蛋白IIB^(man)介导运动性和感染的功能研究

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中国预防兽医学报 2023年第11期45卷 1179-1187页

作者：张佳雪陈绵绵程丽丽任耿佳徐像文鲁珂蓥庄楠茜孙静宋厚辉程昌勇浙江农林大学动物科技学院动物医学院/浙江省畜禽绿色生态健康养殖应用技术研究重点实验室/动物健康互联网检测技术浙江省工程研究中心/浙江省动物医学与健康管理国际科技合作基地/中澳动物健康大数据分析联合实验室浙江杭州311300 台州市椒江区农业农村和水利局浙江台州318000

为探究单增李斯特菌(LM)磷酸转移酶系统(PTS)转运蛋白IIB^(man)在LM生长、运动性及其生物学功能,本研究以LM EGD-e株基因组为模板,经PCR扩增iiB^(man)基因的上下游基因片段(不包含iiB^(man)基因),插入质粒pKSV7以构建缺失质粒;以LM EGD-... 详细信息

为探究单增李斯特菌(LM)磷酸转移酶系统(PTS)转运蛋白IIB^(man)在LM生长、运动性及其生物学功能,本研究以LM EGD-e株基因组为模板,经PCR扩增iiB^(man)基因的上下游基因片段(不包含iiB^(man)基因),插入质粒pKSV7以构建缺失质粒;以LM EGD-e基因组为模板,采用PCR扩增iiB^(man)基因与启动子片段,插入质粒pIMK2以构建回补质粒,经PCR和测序鉴定后,将缺失质粒转化LM EGD-e感受态细胞,通过氯霉素抗性及42℃压力下使重组质粒与LM EGD-e株的同源片段发生同源重组单交换获得一代同源重组菌株,然后在无抗性培养基中30℃培养使质粒丢失,获得缺失株ΔiiB^(man)。将回补质粒转化ΔiiB^(man)感受态细胞中,通过卡那霉素抗性筛选获得回补株CΔiiB^(man),缺失株和回补株均经PCR和测序鉴定。37℃培养EGD-e、ΔiiB^(man)、CΔiiB^(man)12 h,期间每隔1 h测定OD_(600nm)并绘制生长曲线,分析各菌株生长特性,结果显示,各菌株体外生长趋势相似。将各菌株菌液接种于TSA半固体培养基,培养至24 h和48 h时检测细菌运动圈大小,结果显示ΔiiB^(man)的运动圈直径分别是EGD-e的1.5及1.6倍(P<0.05、P<0.01),CΔiiB^(man)与EGD-e运动圈直径均基本一致。在各菌株培养上清中加入绵羊血,检测各菌株溶血能力,结果显示,ΔiiB^(man)的溶血能力较EGD-e及CΔiiB^(man)增强。将各菌株以MOI 20感染RAW264.7细胞,在感染后2 h、5 h和8 h收集细胞进行点样计数,结果显示,在感染后2 h和5 h时ΔiiB^(man)的胞内增殖能力较EGD-e及CΔiiB^(man)显著增强(P<0.05)。将各菌株以2×10^(5)cfu/只经腹腔注射感染小鼠48 h后剖杀,取肝脏和脾脏研磨并点样计数,结果显示,ΔiiB^(man)在小鼠脏器载菌量较EGD-e及CΔiiB^(man)极显著增多(P<0.001)。上述结果首次表明IIB^(man)不影响LM的生长,但影响LM的运动性及提高LM的体外溶血活性;IIB^(man)参与LM的胞内增殖和宿主脏器定植。本研究为了解LM PTS系统所介导的细菌体外环境适应及宿主感染的分子机制,以及LM感染的防控奠定了基础。

关键词：单增李斯特菌磷酸转移酶系统 IIB^(man)转运蛋白运动性感染

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