检索结果-内蒙古大学图书馆

畜牧兽医学报 2023年第11期54卷 4691-4701页

作者：徐自强刘金松孙耀威史永浩吴艳萍张瑞强浙江农林大学动物科技学院·动物医学院、浙江省畜禽绿色生态健康养殖应用技术研究重点实验室、动物健康互联网检测技术浙江省工程实验室杭州311300 惠嘉绿色动物保健品重点农业企业研究院、浙江惠嘉生物科技股份有限公司安吉313300

旨在研究月桂酸(lauric acid,LA)对肉鸡屠宰性能、肌肉品质、常规营养成分和抗氧化性能的调控作用。试验选用480只1日龄AA肉仔鸡,随机分为4组,每组8个重复,每个重复15只鸡,分别饲喂基础饲粮(对照组)和在基础饲粮中分别添加75 mg·kg... 详细信息

旨在研究月桂酸(lauric acid,LA)对肉鸡屠宰性能、肌肉品质、常规营养成分和抗氧化性能的调控作用。试验选用480只1日龄AA肉仔鸡,随机分为4组,每组8个重复,每个重复15只鸡,分别饲喂基础饲粮(对照组)和在基础饲粮中分别添加75 mg·kg^(-1)金霉素(抗生素组)、500 mg·kg^(-1)月桂酸(月桂酸低剂量组,LA500)、1000 mg·kg^(-1)月桂酸(月桂酸高剂量组,LA1000)的试验饲粮,试验期为42 d。结果显示:与对照组相比,饲粮补充500 mg·kg^(-1)月桂酸显著增加了肉鸡胸肌24 h的红度(a^(*))值、黄度(b^(*))值、pH和有机物、粗脂肪、粗蛋白含量(P<0.05),显著增加胸肌总抗氧化能力(total antioxidant capacity,T-AOC)(P<0.05)并显著上调了SOD1、CAT、GPX1、Nrf2、HO-1基因的表达水平(P<0.05),降低了肉鸡胸肌24 h的亮度(L^(*))值、水分含量、48 h的滴水损失和蒸煮损失(P<0.05);饲粮添加1000 mg·kg^(-1)月桂酸显著增加了肉鸡皮下脂肪厚、屠宰率、肌间脂肪宽和全净膛率(P<0.05),显著提高了肉鸡胸肌24 h的pH、a^(*)、b^(*)值和粗脂肪含量(P<0.05),显著增加了T-AOC、总超氧化物歧化酶(total superoxide dismutase,SOD)、谷胱甘肽过氧化物酶(glutathione peroxidase,GPX)的活性(P<0.05),上调了SOD1、SOD2、CAT、GPX1、Nrf2、HO-1的基因表达量(P<0.05),显著降低肉鸡胸肌48 h的滴水损失和蒸煮损失并减少24 h的L^(*)值和丙二醛(malondialdehyde,MDA)的含量(P<0.05)。与抗生素组相比,饲粮添加500 mg·kg^(-1)月桂酸提高了肉鸡胸肌24 h的a^(*)、b^(*)值(P<0.05),降低了肉鸡胸肌24 h的L^(*)值(P<0.05);饲粮添加1000 mg·kg^(-1)月桂酸显著提高了肉鸡皮下脂肪厚(P<0.05),增加了肉鸡胸肌24 h的pH、a^(*)、b^(*)值和T-AOC(P<0.05),降低了肉鸡胸肌24 h的L^(*)值(P<0.05)。综上所述,月桂酸能够改善肉鸡屠宰性能、肌肉品质和抗氧化能力,激活Nrf 2信号通路相关基因的表达,且与抗生素相比,饲粮添加1000 mg·kg^(-1)月桂酸效果更佳。

关键词：月桂酸肉鸡屠宰性能肉品质抗氧化功能

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农业生物技术学报 2023年第11期31卷 2367-2376页

作者：刘晨宋亚雯蒋昕孙静江玲丽宋厚辉程昌勇浙江农林大学动物科技学院/动物医学院/浙江省畜禽绿色生态健康养殖应用技术研究重点实验室/动物健康互联网检测技术浙江省工程研究中心/浙江省动物医学与健康管理国际科技合作基地/中澳动物健康大数据分析联合实验室宁波卫生职业技术学院

单增李斯特菌(Listeria monocytogenes)可诱导机体产生强烈的免疫反应，作为递呈载体在各种癌症和传染病免疫治疗中的研究越来越多，是一种生物安全性高的肿瘤免疫治疗疫苗研发载体。本研究在实验室前期减毒单增李斯特菌LM基础上，构建... 详细信息

单增李斯特菌(Listeria monocytogenes)可诱导机体产生强烈的免疫反应，作为递呈载体在各种癌症和传染病免疫治疗中的研究越来越多，是一种生物安全性高的肿瘤免疫治疗疫苗研发载体。本研究在实验室前期减毒单增李斯特菌LM基础上，构建与李斯特菌溶血素O (Listeriolysin O, LLO)融合表达结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis)抗原Ag85B (Antigen 85B)和ESAT6 (6 kD early secreted antigen target)的肿瘤疫苗菌株LM-Ag85B和LM-ESAT6；通过Western blot确定抗原能与LLO融合表达和正常分泌；利用细菌感染生物学方法研究LM-Ag85B和LM-ESAT6的体外生长能力及溶血活性；利用小鼠(Mus musculus)宫颈癌模型评价LM-Ag85B和LM-ESAT6与LM-E7 (表达宫颈癌相关抗原E7)联合应用在小鼠宫颈癌模型中的治疗效果。结果显示，LM-Ag85B和LM-ESAT6能分别正常表达分泌携带的Ag85B和ESAT6抗原；LM-Ag85B、LM-ESAT6在体外生长能力与野生型无显著差异，溶血活性低于野生型；在小鼠宫颈癌治疗模型中，LM-Ag85B、LM-ESAT6和LM-E7联合应用试验组较对照组显著抑制肿瘤生长，治疗效果良好。本研究证实了结核分枝杆菌抗原能够增强抗肿瘤效果，为推动基于减毒细菌为载体的肿瘤免疫治疗研究提供了科学依据。

关键词：减毒单增李斯特菌结核分枝杆菌相关抗原宫颈癌疫苗载体

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单增李斯特菌内化素家族蛋白Lmo1136生物学特性的研究

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中国预防兽医学报 2024年第10期46卷 997-1004页

作者：叶泽安杨立锋丁强宋厚辉孙静程昌勇陈绵绵浙江农林大学动物科技学院/动物医学院/浙江省畜禽绿色生态健康养殖应用技术研究重点实验室/动物健康互联网检测技术浙江省工程研究中心/浙江省动物医学与健康管理国际科技合作基地/中澳动物健康大数据分析联合实验室浙江杭州311300 宁波卫生职业技术学院浙江宁波315100

单增李斯特菌内化素家族蛋白通常在该菌感染及致病中起重要作用,为探究其内化素家族蛋白Lmo1136在李斯特菌感染致病机制中的作用,本研究以单增李斯特菌EGD-e基因组为模板,经PCR扩增lmo1136基因的上下游基因片段,经重叠延伸PCR将同源臂... 详细信息

单增李斯特菌内化素家族蛋白通常在该菌感染及致病中起重要作用,为探究其内化素家族蛋白Lmo1136在李斯特菌感染致病机制中的作用,本研究以单增李斯特菌EGD-e基因组为模板,经PCR扩增lmo1136基因的上下游基因片段,经重叠延伸PCR将同源臂连接后与温敏型穿梭质粒pKSV7连接构建重组质粒,利用同源重组技术使重组质粒与EGD-e同源片段发生交换,得到缺失株Δlmo1136并经PCR和测序鉴定;以单增李斯特菌EGD-e基因组为模板,PCR扩增lmo1136基因与启动子片段,并与整合型穿梭质粒pIMK2连接后电转化Δlmo1136感受态细胞,得到回补株CΔlmo1136并经PCR和测序鉴定。将单增李斯特菌EGD-e、Δlmo1136和CΔlmo1136分别接种96孔板,37℃培养12h后测定各菌株OD600nm值,并根据OD600nm值绘制各菌株的生长曲线。结果显示各菌株生长速度无显著差异(P>0.05)。将各菌株以感染复数(MOI)10感染人结直肠腺癌细胞(Caco-2细胞)后30min和90min时收集细胞裂解物,接种于BHI培养基进行单菌落计数,结果显示,与EGD-e相比,Δlmo1136的黏附性无显著差异(P>0.05),侵袭力显著下降(P<0.05),而CΔlmo1136的黏附性与侵袭力均无显著差异(P>0.05)。将各菌株均以MOI0.2感染小鼠巨噬细胞(RAW246.7细胞)后2h、5h和8h时收集细胞裂解物接种于BHI培养基,单菌落计数,结果显示,与EGD-e相比,Δlmo1136和CΔlmo1136菌落数均无显著差异(P>0.05)。将各菌株均以1×10^(6) cfu/只经腹腔注射小鼠,48 h后取小鼠脾脏与肝脏研磨,接种于BHI培养基进行单菌落计数,结果显示,与EGD-e相比,Δlmo1136的菌落数显著下降(P<0.05),CΔlmo1136的菌落数无显著差异(P>0.05)。将各菌株均以1×10^(6)cfu/只经腹腔注射小鼠,每隔24h记录小鼠存活情况,结果显示,与EGD-e相比,Δlmo1136组小鼠存活率显著升高(P<0.05),CΔlmo1136组小鼠的存活率无显著差异(P>0.05)。上述结果首次表明lmo1136缺失后,单增李斯特菌的生长能力、细胞黏附性和胞内增殖能力均无显著变化,但对细胞侵袭力、小鼠脏器定植能力显著降低,小鼠存活率显著升高,阐明了内化素家族蛋白Lmo1136在单增李斯特菌细胞侵袭、脏器定植和对小鼠致病机制中发挥重要作用,本研究上述结果为进一步解析Lmo1136介导细菌的感染机制奠定了重要基础。

关键词：单增李斯特菌内化素家族蛋白侵袭力宿主感染

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农业强国与新农科背景下动物生理学实验课程教学改革探索——以动物科学专业为例

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生命科学研究 2025年第2期29卷 182-188页

作者：牛冬李思鸿崔艳军王攀林马翔刘璐浙江农林大学动物科技学院·动物医学院浙江杭州311300 浙江省畜禽绿色生态健康养殖应用技术研究重点实验室/动物健康互联网检测技术浙江省工程实验室浙江杭州311300

动物生理学实验是动物科学专业的核心实践课程,通过创新实验设计和先进技术应用,可实现理论与实践的深度融合,从而为培养高素质科技人才、解决行业挑战及推动学科发展提供重要支持。本文阐明了在农业强国和新农科背景下重塑教学体系的... 详细信息

动物生理学实验是动物科学专业的核心实践课程,通过创新实验设计和先进技术应用,可实现理论与实践的深度融合,从而为培养高素质科技人才、解决行业挑战及推动学科发展提供重要支持。本文阐明了在农业强国和新农科背景下重塑教学体系的战略意义,并从动物科学专业的角度,重点探讨了动物生理学实验课程教学模式、考核体系等多方面的改革创新,旨在为培养符合时代需求的创新型新农科人才提供新思路。

关键词：动物生理学实验农业强国新农科教学改革人才培养

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猪非典型瘟病毒、经典猪瘟病毒、日本乙型脑炎病毒的三重荧光定量PCR检测方法的建立与应用

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中国预防兽医学报 2025年第2期47卷 144-151页

作者：许浩文陈军光马琼琼潘杏明郭美君朱伟群周莹珊董婉玉王晓杜浙江农林大学动物科技学院/动物医学院/浙江省畜禽绿色生态健康养殖应用技术研究重点实验室/动物健康互联网检测技术浙江省工程研究中心/浙江省动物医学与健康管理国际科技合作基地/中澳动物健康大数据分析联合实验室浙江杭州311300 宁海县动物卫生监督所浙江宁波315600 宁波绿港水产牧业有限公司浙江宁波315600

猪非典型瘟病毒(APPV)、经典猪瘟病毒(CSFV)、日本乙型脑炎病毒(JEV)均属于黄病毒科重要成员,从临床症状难以区分且三者的混合感染。为建立一种能快速鉴别检测APPV、CSFV、JEV的三重荧光定量PCR(qPCR)检测方法,本研究根据APPV 5'UT... 详细信息

猪非典型瘟病毒(APPV)、经典猪瘟病毒(CSFV)、日本乙型脑炎病毒(JEV)均属于黄病毒科重要成员,从临床症状难以区分且三者的混合感染。为建立一种能快速鉴别检测APPV、CSFV、JEV的三重荧光定量PCR(qPCR)检测方法,本研究根据APPV 5'UTR基因、CSFV E2基因和JEV E基因分别设计引物与探针,将公司合成的重组质粒标准品pLKO.1-APPV-5'UTR、pLKO.1-CSFV-E2和pLKO.1-JEV-E按体积比1:1:1混合后均为(1×10^(8)拷贝/μL)作为模板,经反应条件优化,初步建立同时检测这3种病毒的三重q PCR方法。以本研究构建的APPV慢病毒、CSFV慢病毒、JEV慢病毒,以及猪流感病毒、猪Delta冠状病毒、猪流行性腹泻病毒、伪狂犬病病毒、猪圆环病毒2型、猪繁殖与呼吸综合征病毒、猪轮状病毒、猪传染性胃肠炎病毒、诺如病毒的基因组为模板,采用建立的该方法检测,评估其特异性,结果显示,该方法仅能检测到APPV、CSFV、JEV的慢病毒,而其他病原检测结果均为阴性。选取1×10^(1)拷贝/μL~1×10^(8)拷贝/μL的混合质粒标准品和1×10^(1)TU/m L~1×10^(6)TU/m L的三种混合慢病毒液分别作为模板,采用本研究建立的方法检测,评估该方法的敏感性,结果显示,该方法对重组质粒pLKO.1-APPV-5'UTR、pLKO.1-CSFV-E2和pLKO.1-JEV-E的检测限均为1×10^(2)拷贝/μL,对3种慢病毒的检测限均为1×10^(2)TU/mL。以1×10~7拷贝/μL、1×10^(5)拷贝/μL、1×10~3拷贝/μL的质粒标准品混合物作为模板,分别进行组内和组间的重复性试验,结果显示,组内和组间重复性试验的变异系数(CV)均低于4.5%。利用本研究建立的三重qPCR和已发表的3种病原的SYBR Green qPCR检测方法对111份临床样品(75份猪肛拭子样品和36份猪组织病料样品)分别检测,结果显示,该三重qPCR方法与已发表的APPV、CSFV、JEV SYBR Green qPCR方法的总符合率分别为99.10%、100%、100%。本研究首次建立的检测APPV、CSFV、JEV的三重TaqMan qPCR方法特异性强、敏感性高、重复性好,为三者临床样品的快速鉴别检测提供了技术支持。

关键词：猪非典型瘟病毒经典猪瘟病毒日本乙型脑炎病毒三重荧光定量PCR

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番茄红素对壬基酚诱导小鼠脾损伤的保护作用及机制研究

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畜牧兽医学报 2022年第2期53卷 637-645页

作者：杨少青邵春艳周彬宋泉江王晓杜宋厚辉姜胜浙江农林大学动物科技学院、动物医学院杭州311300 浙江省畜禽绿色生态健康养殖应用技术研究重点实验室杭州311300 动物健康互联网检查技术浙江省工程实验室杭州311300

探讨番茄红素(lycopene,LYC)对壬基酚(nonylphenol,NP)亚慢性中毒诱导小鼠脾损伤的保护作用及机制。将40只清洁级ICR小鼠随机分为对照组(CON)、中毒组(NPG)、番茄红素对照组(LCG)和番茄红素干预组(LNG)。对照组,每天8:30灌服玉米油0.1 m... 详细信息

探讨番茄红素(lycopene,LYC)对壬基酚(nonylphenol,NP)亚慢性中毒诱导小鼠脾损伤的保护作用及机制。将40只清洁级ICR小鼠随机分为对照组(CON)、中毒组(NPG)、番茄红素对照组(LCG)和番茄红素干预组(LNG)。对照组,每天8:30灌服玉米油0.1 mL,2 h后重复操作;中毒组,每天8:30灌服玉米油0.1 mL,2 h后灌服150 mg·kg^(-1)壬基酚溶液;番茄红素对照组,每天8:30灌服5 mg·kg^(-1)番茄红素,2 h后灌服0.1 mL玉米油;番茄红素干预组,每天8:30灌服5 mg·kg^(-1)番茄红素,2 h后灌服150 mg·kg^(-1)壬基酚溶液。各组连续进行相应灌胃处理30 d后,记录小鼠体重,颌下静脉采集血样,并对小鼠进行安乐死,剖解后采集小鼠脾称重,分析小鼠日均增重以及脾体系数的组间差异;检查血清中免疫细胞因子IL-2、IFN-γ和TNF-α的变化;检测脾氧化与抗氧化指标MDA、T-AOC、CAT、GSH-Px和SOD的差异变化;检测凋亡通路p53/Bcl-2各蛋白表达的差异。结果表明,与NPG相比,经过LYC干预后NP暴露小鼠日均增重显著升高(P<0.05),血清免疫细胞因子含量和脾抗氧化酶活性显著升高(P<0.05);LYC干预后小鼠脾凋亡通路关键分子Akt、p-Akt和Bcl-2蛋白表达水平显著升高(P<0.05),p53和Bax蛋白表达水平显著降低(P<0.05)。结果提示,LYC对NP诱导的小鼠脾损伤具有保护作用,这与LYC增强脾抗氧化能力,抑制脾细胞凋亡有关。

关键词：番茄红素壬基酚氧化应激凋亡

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氯胺酮通过抑制谷氨酸受体和蛋白激酶损害孕鼠子代的学习记忆能力

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中国兽医学报 2023年第5期43卷 1005-1012页

作者：赵菁华姜胜张儒新李沫萱杨玙秦潜高利曾欢王巍宋厚辉浙江农林大学动物科技学院/动物医学院浙江省畜禽绿色生态健康养殖应用技术研究重点实验室/动物健康互联网检测技术浙江省工程研究中心浙江杭州311300 东北农业大学动物医学学院黑龙江哈尔滨150030

氯胺酮是常见的临床麻醉剂,具有较好的镇静、镇痛与麻醉效果。怀孕动物注射氯胺酮是否会影响其子代认知功能仍然未知。本研究通过建立孕鼠暴露模型探究氯胺酮对子代行为学和神经系统的影响。在母鼠怀孕第14天,首先肌肉注射氯胺酮(80 mg/... 详细信息

氯胺酮是常见的临床麻醉剂,具有较好的镇静、镇痛与麻醉效果。怀孕动物注射氯胺酮是否会影响其子代认知功能仍然未知。本研究通过建立孕鼠暴露模型探究氯胺酮对子代行为学和神经系统的影响。在母鼠怀孕第14天,首先肌肉注射氯胺酮(80 mg/kg),每隔1 h按照40 mg/kg补药3次。子代幼鼠于出生后25~29 d进行Morris水迷宫试验。并应用透射电镜、尼氏染色和高尔基染色确定大脑海马区轴突、尼氏小体和树突棘密度的变化,同时分别通过RT-PCR和Western blot检测海马区离子型谷氨酸受体(GLuN1、GLuN2A、GLuN2B、GluR1和GluR2)、钙/钙调蛋白依赖性蛋白激酶Ⅱ(CaMKⅡ)、蛋白激酶A(PKA)和蛋白激酶C(PKC)基因的转录和蛋白表达水平。结果表明,氯胺酮麻醉会导致子代幼鼠花费更长的时间找到定位平台,海马区轴突数量、尼氏小体密度和树突棘密度下降,CaMKⅡ、PKA、PKC、GLuN2A、GLuN2B、GluR1和GluR2的蛋白表达显著下降。综上所述,孕鼠长时间氯胺酮麻醉会导致子代幼鼠蛋白激酶和谷氨酸受体发生变化,影响海马体突触可塑性,最终损害学习和记忆能力。

关键词：氯胺酮妊娠子代幼鼠谷氨酸受体蛋白激酶

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牛病毒性腹泻病毒Npro蛋白与宿主IRF7相互作用机制的研究

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中国预防兽医学报 2024年第12期46卷 1222-1229,1283页

作者：曹唱唱项安琪陈珊王雨欣王静王爽陈斐宋厚辉姜胜宋泉江浙江农林大学动物科技学院/动物医学院/浙江省畜禽绿色生态健康养殖应用技术研究重点实验室/动物健康互联网检测技术浙江省工程研究中心/浙江省动物医学与健康管理国际科技合作基地/中澳动物健康大数据分析联合实验室浙江杭州311300 招远市辛庄畜牧兽医站山东烟台265400

本团队前期研究发现干扰素调节因子7(IRF7)参与牛病毒性腹泻病毒(BVDV)在宿主细胞中的复制。为进一步研究BVDV与IRF7之间的相互作用机制,本实验经PCR扩增BVDV N^(pro)和IRF7基因后,分别构建真核表达质粒pCMV-Flag-IRF7和pCMV-HA-BVDV^(N... 详细信息

本团队前期研究发现干扰素调节因子7(IRF7)参与牛病毒性腹泻病毒(BVDV)在宿主细胞中的复制。为进一步研究BVDV与IRF7之间的相互作用机制,本实验经PCR扩增BVDV N^(pro)和IRF7基因后,分别构建真核表达质粒pCMV-Flag-IRF7和pCMV-HA-BVDV^(Npro),并分别经PCR和测序鉴定均正确。将pCMV-Flag-IRF7转染牛睾丸(BT)细胞后感染BVDV,24 h后分别采用western blot和RT-qPCR检测BVDV E2、IRF7蛋白的表达和BVDV 5'UTR、IRF7mRNA转录水平。结果显示,与BT细胞相比,过表达IRF7的BT细胞在感染后BVDV E2蛋白的表达水平极显著下调(P<0.001),且BVDV 5'UTR基因的转录水平极显著降低(P<0.001);与未感染BVDV的过表达IRF7组相比,感染BVDV后IRF7蛋白表达水平极显著下调(P<0.001),但IRF7 mRNA的转录水平无明显差异。进一步以MOI 0.1的BVDV感染IRF7过表达的BT细胞24 h后,采用RT-qPCR检测IRF7、IFN-α和IFN-βmRNA的转录水平。结果显示,与感染BVDV的BT细胞组相比,BVDV感染过表达IRF7的BT细胞组IRF7 mRNA的转录水平极显著上调(P<0.001)、IFN-α和IFN-βm RNA的转录水平显著上调(P<0.05),表明IRF7可通过增强下游IFN-I的表达水平抑制BVDV的复制。将pCMV-Flag-IRF7和pCMV-HA-BVDV N^(pro)质粒共转染HEK 293T细胞后,经激光共聚焦试验进一步分析BVDV N^(pro)蛋白与IRF7的相互作用关系,结果显示BVDV N^(pro)蛋白和IRF7蛋白在细胞浆中存在明显的共定位,提示二者可能在细胞浆中存在特异性相互作用。将不同剂量重组质粒pCMV-HA-BVDV N^(pro)分别转染HEK 293T后采用western blot检测,结果显示Npro蛋白可以下调IRF7蛋白的表达,且转染2μg重组质粒组中IRF7蛋白极显著下调(P<0.001)。上述结果首次证实宿主细胞可通过上调IRF7和IFN-I的表达抑制BVDV复制,BVDV的Npro蛋白与IRF7可发生特异性相互作用,并下调IRF7表达水平以拮抗宿主细胞对BVDV的抑制作用。本实验为进一步研究BVDV N^(pro)蛋白的功能奠定基础,也为BVD的防控研究提供参考依据。

关键词：牛病毒性腹泻病毒干扰素干扰素调节因子7 相互作用复制

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牛分枝杆菌Mb0869c抑制外源性细胞凋亡的研究

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中国预防兽医学报 2023年第7期45卷 729-736页

作者：梁秋韵孟祥苗杨可黄蓓宋厚辉杨杨浙江农林大学动物科技学院/动物医学院浙江省畜禽绿色生态健康养殖应用技术研究重点实验室/动物健康互联网检测技术浙江省工程研究中心/浙江省动物医学与健康管理国际科技合作基地/中澳动物健康大数据分析联合实验室浙江杭州311300

为探究与人受体相互作用蛋白激酶1 (RIPK1)存在互作的牛分枝杆菌(***) Mb0869c蛋白对细胞凋亡的作用机制,本研究通过PCR从*** DNA中扩增Mb0869c基因片段后构建重组质粒p MN437-Mb0869c并经PCR和测序鉴定正确后,利用电转化法将重组质粒... 详细信息

为探究与人受体相互作用蛋白激酶1 (RIPK1)存在互作的牛分枝杆菌(***) Mb0869c蛋白对细胞凋亡的作用机制,本研究通过PCR从*** DNA中扩增Mb0869c基因片段后构建重组质粒p MN437-Mb0869c并经PCR和测序鉴定正确后,利用电转化法将重组质粒电转入耻垢分枝杆菌(MS)中,并经western blot鉴定Mb0869c蛋白的表达情况。结果显示,重组菌株中出现约55 ku的特异性条带,表明获得了表达Mb0869c的重组菌MS_Mb0869c。将MS_Mb0869c株和对照菌株MS_Vec分别感染人单核巨噬细胞(THP-1),通过PI和AnnexinⅤ/FITC染色,经流式细胞仪检测细胞的凋亡情况,结果显示,MS_Mb0869c感染细胞的凋亡率显著低于MS_Vec感染组,这表明Mb0869c可以抑制MS诱导的细胞凋亡。将上述获得的Mb0869c基因片段克隆于p LVX-IRES-Puro-3×Flag中,构建的重组质粒经测序鉴定正确后,转染HEK293T细胞中,利用嘌呤霉素筛选表达Mb0869c的细胞并经western blot鉴定。结果显示,构建的HEK293T细胞中出现约55 ku的特异性条带,且随着细胞传代次数的增加,蛋白表达量未减少,这表明稳定表达Mb0869c的细胞系HEK293T/Mb0869c正确构建。利用不同浓度的肿瘤坏死因子α (TNF-α)和IAP抑制剂(SM164)作用于HEK293T细胞,通过检测细胞内ATP的含量确定细胞凋亡发生情况。结果显示,100 ng/mL TNF-α和25 nmol/L SM164在作用细胞24 h后,诱导细胞凋亡的效果最佳。以该浓度分别作用于HEK293T/Mb0869c和对照组HEK293T/Con细胞24 h后,统计细胞的存活率。结果显示前者的存活率极显著高于后者(P<0.01),表明Mb0869c能够抑制细胞凋亡。通过PCR扩增人RIPK1的3个结构域片段,并分别克隆至p CMV-Myc中构建真核表达重组质粒并经菌落PCR和测序鉴定正确后分别转染HEK293T/Mb0869c细胞,通过免疫共沉淀法(Co-IP)检测RIPK1结构域与Mb0869c的互作。结果显示Mb0869c和RIPK1的激酶结构域(KD)和中间结构域(ID)存在相互作用。上述结果表明,Mb0869c蛋白在***抑制细胞凋亡中具有重要的作用,且这种抑制作用是通过RIPK1实现的。本研究为***蛋白通过RIPK1调节细胞凋亡作用机制的研究提供实验依据。

关键词：牛分枝杆菌细胞凋亡 Mb0869c 受体相互作用蛋白激酶1

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两种启动子拯救猪繁殖与呼吸综合征病毒ZJ-JX-2015株效率的比较研究

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中国预防兽医学报 2023年第5期45卷 529-534页

作者：阚恩晞祝徐航张孝辉董婉玉宋厚辉周兴东王晓杜浙江农林大学动物科技学院/动物医学院/浙江省畜禽绿色生态健康养殖应用技术研究重点实验室/动物健康互联网检测技术浙江省工程研究中心/浙江省动物医学与健康管理国际科技合作基地/中澳动物健康大数据分析联合实验室浙江杭州311300

为比较不同启动子驱动的猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)强毒株ZJ-JX-2015感染性克隆拯救的各重组病毒的效率,本研究将ZJ-JX-2015株全基因组引入无义突变位点(C-G,形成Bst B I酶切位点)作为后期鉴定标签并分成4段经PCR扩增后,分别克隆至... 详细信息

为比较不同启动子驱动的猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)强毒株ZJ-JX-2015感染性克隆拯救的各重组病毒的效率,本研究将ZJ-JX-2015株全基因组引入无义突变位点(C-G,形成Bst B I酶切位点)作为后期鉴定标签并分成4段经PCR扩增后,分别克隆至含CMV启动子的p SMART-BAC载体和含T7启动子的p WSK-29载体中构建感染性克隆质粒p SMART-BAC-CMV-r PRRSV和p WSK-29-T7-r PRRSV,经PCR及测序鉴定正确后将前者分别转染BHK-21和293T细胞;将后者转染BHK-21(T7)细胞。48 h后收集上述各细胞上清液接种Marc-145细胞并连续传10代。通过观察细胞病变(CPE),收集不同代次Marc-145细胞上清液经PCR及间接免疫荧光试验(IFA)鉴定拯救的各重组病毒。将拯救的各重组病毒以MOI 0.1接种Marc-145细胞,通过测定不同时间各病毒上清液的病毒效价(TCID50)绘制生长曲线。结果显示,各细胞上清液[BHK-21、293T细胞及BHK-21细胞(T7)]在Marc-145细胞中传至第2代时均出现CPE;PCR及测序鉴定结果显示,各代次的各组Marc-145细胞上清液均能扩增到544 bp的目的片段,且均含遗传标记Bst B I酶切位点。IFA结果显示,上述各代次各组Marc-145细胞上清液接种的各细胞中均出现绿色荧光,对照Marc-145细胞无绿色荧光。上述结果表明,拯救了3株重组PRRSV:BHK-r JX15、293T-r JX15(分别转染BHK21及293T细胞所得)及T7-r JX15株[转染BHK-21(T7)细胞所得],且各病毒的遗传稳定性较强。测定各病毒TCID50并绘制各病毒生长曲线,结果显示,在各病毒的感染后期(感染后72 h),BHK-r JX15株的病毒效价显著高于亲本病毒(P<0.05),极显著高于T7-r JX15及293T-r JX15株(P<0.01);293T-r JX15的病毒效价极显著高于T7-r JX15株(P<0.01),但这两株病毒的效价又极显著低于亲本病毒(P<0.001)。且4株病毒的生长趋势基本一致。上述结果表明CMV启动子驱动的重组PRRSV(BHK-rJX15和293T-r JX15)复制水平高于T7启动子驱动的重组病毒(T7-rJX15),尤以CMV启动子驱动并通过BHK细胞拯救的重组病毒(BHK-rJX15)复制水平最高。提示,CMV启动子更适用于构建PRRSV的反向遗传操作系统。本研究为构建PRRSV反向遗传操作系统及其蛋白功能研究、新型疫苗的研发奠定了基础。

关键词：猪繁殖与呼吸综合征病毒反向遗传感染性克隆

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