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牛病毒性腹泻病毒核心蛋白C激活NLRP3炎症小体诱发细胞焦亡的分子机制研究

中国预防兽医学报 2023年第11期45卷 1148-1157页

作者：韩言言钟林翰宋京格周佳莹王美李园徐义刚浙江农林大学动物科技学院动物医学院/浙江省畜禽绿色生态健康养殖应用技术研究重点实验室浙江杭州311300

为探究牛病毒性腹泻病毒(BVDV)核心蛋白C激活NLRP3炎症小体诱发细胞焦亡的分子机制。本研究构建BVDV C蛋白真核表达质粒pCMV-C,经PCR和测序鉴定正确后转染牛睾丸原代(BT)细胞,48 h采用间接免疫荧光试验(IFA)和western blot检测C蛋白的表... 详细信息

为探究牛病毒性腹泻病毒(BVDV)核心蛋白C激活NLRP3炎症小体诱发细胞焦亡的分子机制。本研究构建BVDV C蛋白真核表达质粒pCMV-C,经PCR和测序鉴定正确后转染牛睾丸原代(BT)细胞,48 h采用间接免疫荧光试验(IFA)和western blot检测C蛋白的表达;采用CCK-8法检测转染pCMV-C(过表达C蛋白)的BT细胞活性。结果显示,该BT细胞出现特异性绿色荧光,且在23 ku处出现特异性条带,阴性对照细胞(转染pCMV的细胞,后同)未见绿色荧光也无该条带,表明C蛋白在BT细胞中获得了表达。细胞活性检测结果显示,过表达C蛋白的BT细胞活性极显著低于阴性对照组细胞(P<0.001)。将荧光素酶报告质粒pNF-κB-Luc、内参质粒pRL-TK和pCMV-C共转染BT细胞,并设置相应的阳性和阴性对照,48 h后采用双荧光素酶报告系统检测各组细胞上清中NF-κB的相对荧光素酶活性。结果显示,共转染3种质粒的BT细胞及阳性对照细胞中NF-κB相对荧光素酶活性极显著高于空白对照组和阴性对照组(共转染pCMV、pNF-κB-Luc和pRL-TK的细胞)(P<0.01)。通过荧光定量RT-PCR(qRT-PCR)分别检测过表达C蛋白的BT细胞中NLRP3炎症小体组分[Caspase-1前体(pro-Caspase-1)、凋亡相关斑点样蛋白(ASC)、NLRP3及IL-1β的前体(pro-IL-1β)]mRNA的转录水平;采用western blot检测该BT细胞中NLRP3炎症小体组分(pro-Caspas-1、ASC、NLRP3、pro-IL-1β和IL-1β的表达水平并通过western blot分析pro-Caspase-1和pro IL-1β的切割结果。结果显示,过表达C蛋白的BT细胞中NLRP3和ASC mRNA转录水平(P<0.01)、pro-Caspase-1和pro-IL-1βmRNA转录水平(P<0.001)均极显著高于阴性对照组细胞;该BT细胞中NLRP3、pro-Caspase-1、Caspase-1P20、ASC、pro-IL-1β和IL-1β蛋白表达水平均明显高于阴性对照组细胞。转录和蛋白表达水平均表明BT细胞发生了炎症反应,且pro-Caspase-1被切割成为有活性的Caspase-1和Caspase-1p20,pro-IL-1β被切割成有活性的IL-1β。将pCMV-C和pCMV-ASC、pCMV-C和pCMV-NLRP3分别共转染293T细胞,48 h后通过激光共聚焦显微镜观察C蛋白与NLRP3和ASC的共定位。结果显示,C蛋白分别与NLRP3和ASC在细胞质中存在共定位。为进一步探究C蛋白激活NLRP3炎症小体对细胞焦亡的影响,通过qRT-PCR和western blot检测过表达C蛋白的BT细胞中死亡调节蛋白GSDMD mRNA的转录、蛋白表达水平及切割情况。通过扫描电镜观察转染pCMV-C 12 h和24 h的BT细胞,并采用间接ELISA检测转染pCMV-C 24 h BT细胞上清中IL-1β的含量。qRT-PCR结果显示,GSDMD mRNA转录水平极显著高于空白对照组和阴性对照组细胞(P<0.001);GSDMD蛋白的表达水平也明显高于两个对照组,且该蛋白被切割成有活性的GSDMD-N和GSDMD-C。电镜观察结果显示,与阴性对照细胞相比,随着C蛋白表达时间的延长,BT细胞膜逐渐破裂,细胞膜均已形成渗透孔,并有细胞内容物的释放,且细胞上清中IL-1β的含量极显著高于阴性对照组细胞(P<0.01)。上述研究表明,C蛋白能够显著引起NLRP3炎症小体活化进而激活pro-Caspase-1形成活化的Caspase-1,后者一方面切割GSDMD,形成有活性的GSDMD-N,并在BT细胞膜形成孔洞,释放内容物,诱导BT细胞发生细胞焦亡,另一方面活化的Caspase-1切割pro-IL-1β,形成有活性的IL-1β,并释放到BT细胞外,致细胞上清中IL-1β含量极显著升高。本研究为进一步阐明BVDV的致病机制以及制定BVD的防控策略提供参考。

关键词：牛病毒性腹泻病毒 C蛋白 NLRP3炎症小体细胞焦亡

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致牛腹泻主要病毒多重实时荧光定量PCR检测方法的建立与应用

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动物医学进展 2023年第11期44卷 26-32页

作者：张梦媛钟林翰韩言言刘伊湄李沫萱王美李园徐义刚浙江省畜禽绿色生态健康养殖应用技术研究重点实验室动物科技学院·动物医学院浙江农林大学浙江杭州311300

为鉴别检测引起牛病毒性腹泻的4种主要病原牛病毒性腹泻病毒(Bovine viral diarrhea virus,BVDV)、牛冠状病毒(Bovine coronavirus,BCV)、牛轮状病毒(Bovine rotavirus,BRV)和牛细小病毒(Bovine parvovirus,BPV),分别以BCV Nsp10基因、BVDV 5′UTR基因、BRV VP6基因和BPV VP2基因为靶基因设计引物,建立了检测上述4种病毒的实时荧光定量PCR方法。结果显示,方法的特异性强,仅检测靶标病毒的结果为阳性;方法的灵敏度高,对4种病毒BCV、BVDV、BRV和BPV相应质粒的最低检出限分别为7.77×10^(2)、7.11×10^(1)、1.74×10^(2)和2.53×10^(2)copies/μL,且重复性良好,批内和批间变异系数均小于1.0%。由于上述病毒存在交叉感染的情况较多,因此建立多重荧光定量PCR,并利用建立的多重实时荧光定量PCR方法对采集的230份牛腹泻临床样本进行检测,BVDV、BCV、BRV和BPV的阳性率分别为66.96%、3.48%、18.26%和9.57%;且存在多病毒混合感染情况,其中BVDV和BRV混合感染率为10.43%,BVDV和BPV混合感染率为3.48%,BVDV、BCV和BRV混合感染率为1.74%,BVDV、BCV和BPV混合感染率为0.87%,BVDV、BRV和BPV混合感染率为0.87%。研究建立的多重实时荧光定量PCR方法具有良好的特异性、灵敏性,可为病毒性牛腹泻的快速诊断和流行病学调查提供的技术支持。

关键词：牛病毒性腹泻病毒牛冠状病毒牛轮状病毒牛细小病毒实时荧光定量PCR

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细菌金属离子外排系统及金属稳态调控

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微生物学报 2024年第3期64卷 672-686页

作者：董欣楠邓思敏宋厚辉徐加利程昌勇浙江农林大学动物科技学院·动物医学院动物健康互联网检测技术浙江省工程研究中心浙江省动物医学与健康管理国际科技合作基地浙江省畜禽绿色生态健康养殖应用技术研究重点实验室中澳动物健康大数据分析联合实验室浙江杭州311300

铁、铜、锌、锰等金属离子是各类生物体生存和增殖所必需的微量元素,可影响生物体内蛋白酶活性、免疫反应、生理过程和抗感染机制。细菌感染过程中,宿主可通过限制或提高体内环境中金属离子的浓度来抑制细菌增殖,与此同时,细菌进化出各... 详细信息

铁、铜、锌、锰等金属离子是各类生物体生存和增殖所必需的微量元素,可影响生物体内蛋白酶活性、免疫反应、生理过程和抗感染机制。细菌感染过程中,宿主可通过限制或提高体内环境中金属离子的浓度来抑制细菌增殖,与此同时,细菌进化出各种转运系统以适应宿主体内金属离子水平的变化。由于不同细菌的金属离子外排系统在结构和生化特性上存在变异,它们呈现出独特的金属离子外排模式。本文根据现有文献报道及本团队研究结果,对铁、铜、锌和锰离子的细菌外排系统进行讨论和总结,旨在综述目前对细菌金属离子稳态调控机制研究进展的认识,为深入理解细菌金属稳态调控相关机制提供参考。

关键词：金属离子外排系统细菌感染金属离子稳态调控机制

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蛋鸡产蛋后期产蛋率营养调控措施

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饲料工业 2023年第15期44卷 24-29页

作者：吴斯巧闫聪聪张小东王永侠浙江农林大学动物科技学院/动物医学院浙江省畜禽绿色生态健康养殖应用技术研究重点实验室浙江杭州311300

产蛋率是评价蛋鸡生产性能的重要指标,是衡量蛋鸡养殖企业饲养效率和盈利能力的重要因素之一。老龄化是导致蛋鸡产蛋后期产蛋率下降的主要因素。特别是近年来,商品蛋鸡的产蛋周期大大延长,蛋鸡老龄化程度更高,导致产蛋后期面临的产蛋率... 详细信息

产蛋率是评价蛋鸡生产性能的重要指标,是衡量蛋鸡养殖企业饲养效率和盈利能力的重要因素之一。老龄化是导致蛋鸡产蛋后期产蛋率下降的主要因素。特别是近年来,商品蛋鸡的产蛋周期大大延长,蛋鸡老龄化程度更高,导致产蛋后期面临的产蛋率下降问题更为严峻。文章对鸡蛋的形成过程及引起蛋鸡产蛋后期产蛋率下降的原因进行了概述,并对提高产蛋后期产蛋率的营养调控措施进行了总结和展望。

关键词：蛋鸡产蛋后期老龄蛋鸡产蛋率营养调控

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稳定表达HPV16和18亚型抗原蛋白E7的肿瘤细胞模型构建及评价

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农业生物技术学报 2025年第2期33卷 463-472页

作者：蒋昕胡莱茵宋亚雯孙静宋厚辉夏菁程昌勇浙江农林大学动物科技学院＆动物医学院/浙江省畜禽绿色生态健康养殖应用技术研究重点实验室/动物健康互联网检测技术浙江省工程研究中心/浙江省动物医学与健康管理国际科技合作基地/中澳动物健康大数据分析实验室

人乳头瘤病毒(Human papillomavirus, HPV)是一种常见的生殖道感染病毒，HPV16和HPV18与宫颈癌之间存在密切关联。目前全球共有6种预防性HPV疫苗获批上市，但是这些疫苗只有预防作用，不能用于已感染病例的治疗。因此，本研究以小鼠(Mus... 详细信息

人乳头瘤病毒(Human papillomavirus, HPV)是一种常见的生殖道感染病毒，HPV16和HPV18与宫颈癌之间存在密切关联。目前全球共有6种预防性HPV疫苗获批上市，但是这些疫苗只有预防作用，不能用于已感染病例的治疗。因此，本研究以小鼠(Mus musculus)宫颈癌细胞系TC-1为基础模型构建HPV16 E7和HPV18 E7共同表达的TC-1-HPV18 E7细胞模型，并使用减毒单增李斯特菌(Listeria monocytogenes, LM)为载体的重组菌株疫苗LM-HPV18 E7递送肿瘤抗原，评价重组菌株疫苗在TC-1-HPV18 E7荷瘤小鼠模型中的治疗效果。结果表明，本研究成功构建了TC-1-HPV18 E7细胞模型和小鼠模型，TC-1-HPV18 E7荷瘤小鼠与TC-1荷瘤小鼠在成瘤过程中无差异；与TC-1荷瘤小鼠的肿瘤相比，疫苗LM-HPV18 E7对TC-1-HPV18 E7荷瘤小鼠的肿瘤具有显著的治疗效果，表明LM是一个具有开发潜力的活疫苗载体平台。本研究使以TC-1为基础的细胞模型的用途得到扩展，也为减毒单增李斯特菌作为治疗性疫苗载体的研究提供了参考。

关键词：细胞模型小鼠模型人乳头瘤病毒(HPV)16和18亚型治疗性疫苗

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N-乙酰半胱氨酸预处理对热应激IPEC-J2细胞氧化损伤和内质网应激的影响

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中国畜牧杂志 2023年第4期59卷 217-221页

作者：汤志宁周旭杨梦婷莫凡陈乐怡杨治江魏筱诗茅慧玲王翀崔艳军浙江农林大学动物科技学院·动物医学院浙江省畜禽绿色生态健康养殖应用技术研究重点实验室浙江临安311300

本试验旨在研究N-乙酰半胱氨酸(NAC)对热应激诱导的猪小肠上皮细胞IPEC-J2抗氧化能力、内质网应激通路蛋白表达和细胞凋亡的影响。采用单因子试验设计,试验分3组,分别为对照组(CON,37℃)、热应激组(HS,43℃)和NAC加热应激组(NAC+HS,43℃... 详细信息

本试验旨在研究N-乙酰半胱氨酸(NAC)对热应激诱导的猪小肠上皮细胞IPEC-J2抗氧化能力、内质网应激通路蛋白表达和细胞凋亡的影响。采用单因子试验设计,试验分3组,分别为对照组(CON,37℃)、热应激组(HS,43℃)和NAC加热应激组(NAC+HS,43℃)。其中NAC+HS组细胞在NAC(0.5 mmol/L)预处理12 h后,进行热应激处理4 h,测定细胞氧化损伤情况、活性氧自由基(ROS)含量、抗氧化酶的活性、线粒体膜电位变化、细胞内质网应激和凋亡相关蛋白的表达。结果表明:与CON组相比,热应激导致细胞中ROS和丙二醛(MDA)含量显著增加,铜锌超氧化物歧化酶(SOD1)、锰超氧化物歧化酶(SOD2)和过氧化氢酶(CAT)的表达量提高(P<0.05);与HS组相比,添加NAC降低了氧化损伤和抗氧化酶(SOD2、CAT)的表达(P<0.05)。与CON组相比,热应激增加热休克蛋白A5(HSPA5)、磷酸化真核细胞翻译启始因子2α(p-eif2α)、转录激活因子4(ATF4)、C/EBP同源蛋白(CHOP)蛋白表达量(P<0.01);添加NAC降低HSPA5、p-eif2α、ATF4、CHOP蛋白表达量(P<0.01)。NAC预处理降低了热应激诱导的凋亡标志蛋白细胞色素C(Cytc)和活化半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3(Active-caspase3)的表达(P<0.05)。综上,添加NAC可以缓解热应激诱导的IPEC-J2细胞的氧化应激和内质网应激,减少细胞凋亡。

关键词： IPEC-J2 热应激内质网应激活性氧 N-乙酰半胱氨酸

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湖羊公羔体重与体尺的主成分分析及回归模型的建立

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中国畜牧杂志 2024年第7期60卷 178-182页

作者：张衍震章晓炜曹丁壬张文龙陈悦王翀孙玲玲浙江农林大学动物科技学院·动物医学院浙江省畜禽绿色生态健康养殖应用技术研究重点实验室浙江杭州311300 浙江省畜牧技术推广与种畜禽监测总站浙江杭州310021

为研究湖羊体重和体尺性状的关联,试验选取浙江省内湖羊种羊场80只6月龄湖羊公羔,分别测定其体重和11个体尺性状并进行相关性、主成分分析及建立回归模型。结果表明:湖羊公羔的体重、尾长、尾宽、尾周长、肥周长、胸宽以及睾丸围的变异... 详细信息

为研究湖羊体重和体尺性状的关联,试验选取浙江省内湖羊种羊场80只6月龄湖羊公羔,分别测定其体重和11个体尺性状并进行相关性、主成分分析及建立回归模型。结果表明:湖羊公羔的体重、尾长、尾宽、尾周长、肥周长、胸宽以及睾丸围的变异系数均大于10%;羔羊体重与除体高外所有体尺指标呈显著正相关,胸围与体重间的相关系数最大,其次为体斜长和管围,睾丸围与体重间的相关系数最小。在主成分分析中,12个性状可简化为3个主成分指标,相关矩阵特征值为4.286、2.131和1.552,累计贡献率为66.408%。使用体尺指标建立体重的最优回归方程为Y=-56.55+0.65×X1+0.671×X2(Y为体重,X1为胸围,X2为体斜长),R^(2)=0.727,P<0.01。综上,在针对湖羊公羔选育时,可将多个性状简化为综合指标以提高育种效率;逐步回归分析的结果提示,胸围和体斜长可作为重要性状进行选育。

关键词：湖羊公羔体重体尺性状主成分分析回归模型

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单增李斯特菌毒力因子溶血素关键氨基酸位点在感染过程中的作用研究

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微生物学报 2024年第4期64卷 1219-1232页

作者：冯昱超徐加利朱斌杰吴泽斌王雯静丁桉蔡孜萌陈绵绵孙静江铃丽宋厚辉夏菁程昌勇浙江农林大学动物科技学院·动物医学院、浙江省畜禽绿色生态健康养殖应用技术研究重点实验室、动物健康互联网检测技术浙江省工程研究中心、浙江省动物医学与健康管理国际科技合作基地、中澳动物健康大数据分析联合实验室浙江杭州311300 宁波卫生职业技术学院浙江宁波315100

【目的】探究单增李斯特菌溶血素O(listeriolysin O,LLO)中D3区域β8折叠片上第253位氨基酸(谷氨酰胺,Q)和第254位氨基酸(异亮氨酸,I)对单增李斯特菌(Listeria monocytogenes)感染生物学功能的影响。【方法】构建LLO_(Q253A)和LLO_(I25... 详细信息

【目的】探究单增李斯特菌溶血素O(listeriolysin O,LLO)中D3区域β8折叠片上第253位氨基酸(谷氨酰胺,Q)和第254位氨基酸(异亮氨酸,I)对单增李斯特菌(Listeria monocytogenes)感染生物学功能的影响。【方法】构建LLO_(Q253A)和LLO_(I254A)突变蛋白的原核表达菌株,以及利用同源重组方法构建hly_(Q253A)和hly_(I254A)突变株;通过表达纯化突变蛋白,测定溶血活性;比较LLO第253位Q和第254位I均突变成丙氨酸(A)后,对细菌体外生长能力、黏附侵袭、胞内迁移和增殖能力的影响。【结果】相应位点突变后,LLO蛋白均能够正常表达。在pH 6.5条件下,所有突变蛋白和突变株的溶血活性丧失。然而,在pH 5.5条件下,LLO_(I254A)和hly_(I254A)恢复了溶血活性。与野生株相比,突变株的体外生长、黏附能力和胞内增殖能力均无明显差异;突变株的侵袭能力和胞间迁移能力显著低于野生株。【结论】本研究证实第253位Q和第254位I均突变成A后,单增李斯特菌在pH 6.5条件下丧失溶血活性,并降低了感染宿主细胞的能力,但具体机制还有待进一步探索。本研究为深入探究LLO结构对单增李斯特菌生物学功能的影响奠定基础,对单增李斯特菌点突变株的构建具有一定参考意义。

关键词：单增李斯特菌溶血素O 感染点突变缺失株

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表达E7蛋白的重组减毒李斯特菌在小鼠宫颈癌模型中的治疗效果

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农业生物技术学报 2024年第5期32卷 1206-1215页

作者：潘晓欣崔明珠罗亚如孙静程昌勇王晶宋厚辉浙江农林大学动物科技学院·动物医学院/浙江省畜禽绿色生态健康养殖应用技术研究重点实验室/动物健康互联网检测技术浙江省工程实验室/动物医学与健康管理浙江省国际科技合作基地/中澳动物健康大数据分析联合实验室

单核细胞增多性李斯特菌(Listeria monocytogenes)是一种能在细胞间迁徙繁殖并能促进抗原特异性CD4+和CD8+T细胞增殖产生适应性细胞免疫的优质候选疫苗活载体。本课题组发现新型减毒李斯特菌(attenuated Listeria monocytogenes, LAM)... 详细信息

单核细胞增多性李斯特菌(Listeria monocytogenes)是一种能在细胞间迁徙繁殖并能促进抗原特异性CD4+和CD8+T细胞增殖产生适应性细胞免疫的优质候选疫苗活载体。本课题组发现新型减毒李斯特菌(attenuated Listeria monocytogenes, LAM)较野生型李斯特菌的溶血能力和增殖能力均显著降低的同时仍可正常分泌李斯特菌溶血素O (Listeriolysin O, LLO)蛋白。为了研究LAM的安全性及其对宫颈癌特异性抗原E7蛋白的递送与免疫效果，本研究在小鼠(Mus musculus)模型上检测了LAM的毒力，并对LAM-E7重组菌株在小鼠宫颈癌免疫治疗和预防中的作用进行了评价。结果显示，LAM对小鼠的毒力是野生型李斯特菌毒力的1/8709，且小鼠脏器中的LAM可在一周内被清除。本研究通过同源重组的方法将E7基因整合到LAM基因组上，PCR鉴定结果显示，LAM-E7菌株构建成功。Western blot结果显示，E7蛋白能够与LLO在重组菌株中融合表达并释放。通过对LAM-E7的体外生长能力和溶血活性分析发现，融合后对LAM的生长能力和溶血能力无显著影响，表明E7蛋白的融合不会影响LAM的安全性。通过腹部皮下注射方式构建小鼠宫颈癌模型发现，LAM-E7组小鼠肿瘤平均体积(161.1202 mm3)显著小于LAM组(349.4625 mm3)和PBS组(512.4149 mm3)(P<0.01)，说明接种LAM-E7对肿瘤生长具有显著的抑制作用。经免疫预防试验发现，LAM-E7组小鼠肿瘤平均体积(3.86 mm3)显著小于LAM组(172.67 mm3)和PBS组(57.38 mm3)(P<0.001)，表明LAM-E7对宫颈癌有一定的预防效果。本研究证实LAM-E7对小鼠宫颈癌具有良好的治疗和预防效果，为减毒李斯特菌作为疫苗载体用于宫颈癌治疗提供了新的思路，也为今后宫颈癌治疗疫苗的研发提供数据支持。

关键词：减毒李斯特菌宫颈癌免疫治疗载体疫苗

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镉致肝损伤机制及硒拮抗镉肝毒性的研究进展

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畜牧兽医学报 2024年第4期55卷 1456-1466页

作者：罗通旺吴亚王书杰宋厚辉邵春艳浙江农林大学动物科技学院·动物医学院浙江省畜禽绿色生态健康养殖应用技术研究重点实验室动物健康互联网检测技术浙江省工程实验室动物医学与健康管理浙江省国际科技合作基地中澳动物健康大数据分析联合实验室杭州311300

镉是一种有毒重金属,能通过食物链蓄积于机体内,造成急性或慢性中毒,严重威胁人类和畜禽的健康。肝是镉毒性损伤的主要靶器官,揭示镉的肝毒性机制以及如何抑制其毒性作用具有重要意义。硒是人体必需的微量元素之一,在维持机体正常生命... 详细信息

镉是一种有毒重金属,能通过食物链蓄积于机体内,造成急性或慢性中毒,严重威胁人类和畜禽的健康。肝是镉毒性损伤的主要靶器官,揭示镉的肝毒性机制以及如何抑制其毒性作用具有重要意义。硒是人体必需的微量元素之一,在维持机体正常生命活动中具有重要作用,近年来,很多研究表明硒能够拮抗镉的肝毒性。本文主要对镉致肝毒性损伤机制以及硒拮抗镉肝毒性的相关研究报道进行归纳总结,以期为镉污染的防治以及硒的临床应用提供参考。

关键词：镉肝毒性硒作用机制

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