检索结果-内蒙古大学图书馆

2015年~2021年我国东部地区猪流行性腹泻病毒S1蛋白关键表位的变异分析

中国预防兽医学报 2023年第9期45卷 968-972页

作者：程亚豪胡灵子刘雅琦周莹珊杜静周兴东王晓杜吴瑗董婉玉浙江农林大学动物科技学院/动物医学院浙江省畜禽绿色生态健康养殖应用技术研究重点实验室/动物健康互联网检测技术浙江省工程实验室/动物医学与健康管理浙江省国际科技合作基地/中澳动物健康大数据分析联合实验室浙江杭州311300 金华职业技术学院农学院浙江金华321007

为了解2015年~2021年我国东部地区猪流行性腹泻病毒(PEDV)的流行特征和遗传变异规律,本研究利用RT-PCR扩增2015年~2017年11株分离自浙江地区PEDV流行株的S1基因序列,并与GenBank中我国东部地区(上海、江苏、山东、河南和安徽)的86株PED... 详细信息

为了解2015年~2021年我国东部地区猪流行性腹泻病毒(PEDV)的流行特征和遗传变异规律,本研究利用RT-PCR扩增2015年~2017年11株分离自浙江地区PEDV流行株的S1基因序列,并与GenBank中我国东部地区(上海、江苏、山东、河南和安徽)的86株PEDV流行株的S1基因序列通过MEGA 7.0软件比较分析S1基因的遗传进化关系,采用CLC Sequence Viewer 8软件分析比对S1蛋白氨基酸序列的变异。PEDV S1基因遗传进化分析结果显示,97株PEDV中有92%的流行株属于G2型,与疫苗株CV777同源性较低(90.4%~96.1%),山东地区2017年~2018年间的部分流行株与疫苗株CV777等属于G1型;G2型中,33%的流行株属于G2a型,67%的流行株属于G2b亚型,其中2019年~2021年的流行株有15%流行株属于G2a亚型,85%的流行株属于G2b亚型。S1蛋白关键表位的变异分析结果显示,与经典株CV777相比,中和表位COE(CO-26K equivalent epitope)发生8个氨基酸位点(A^(517)S、S^(523)G、V^(527)I、T^(549)S、G^(594)S、A^(605)E/D、L^(612)F/Y、I^(635)V)的突变,SS2区域无氨基酸变异,SS6发生1个氨基酸位点(Y^(766)S)的突变,2018年后出现新的突变位点(T^(636)I和S^(749)G)。不同地区S1蛋白关键表位的变异分析结果显示,aa501变异在河南地区(L^(501)P)和江苏地区(L^(501)W)存在明显的差异;aa536突变(F^(536)L)多集中于河南、山东地区的流行株,aa542突变(D^(542)E)集中于江苏、上海地区。本研究首次系统分析了我国东部地区PEDV流行株S1基因及其氨基酸的遗传变异规律,为我国该地区PEDV变异株疫苗选择、生物安全防控方案制定提供了参考依据。

关键词：猪流行性腹泻病毒 S1基因遗传变异序列分析

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单增李斯特菌DegU直接调控CtsR介导的温度适应

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中国兽医学报 2023年第5期43卷 986-992页

作者：金浩博徐加利郑晨煦邓思敏程昌勇江玲丽宋厚辉浙江农林大学动物科技学院/动物医学院浙江省畜禽绿色生态健康养殖应用技术研究重点实验室/动物健康互联网检测技术浙江省工程研究中心/浙江省动物医学与健康管理国际科技合作基地/中澳动物健康大数据分析联合实验室浙江杭州311300 宁波卫生职业技术学院浙江宁波315100

在食品加工过程中温和的热处理方式难以完全消灭耐热性强的食源性单增李斯特菌,该菌对食品安全构成显著风险。团队前期发现李斯特菌孤儿反应调节因子DegU与细菌的耐热应激密切相关,为进一步探索DegU参与温度适应调控的分子机制,本研究... 详细信息

在食品加工过程中温和的热处理方式难以完全消灭耐热性强的食源性单增李斯特菌,该菌对食品安全构成显著风险。团队前期发现李斯特菌孤儿反应调节因子DegU与细菌的耐热应激密切相关,为进一步探索DegU参与温度适应调控的分子机制,本研究以单增李斯特菌EGD-e为参考菌株,利用同源重组方法构建单增李斯特菌基因缺失株ΔdegU和回补株CΔdegU,在前期基础上挖掘DegU调控单增李斯特菌适应环境温度的相关分子机制。研究结果显示:荧光定量PCR试验发现单增李斯特菌缺失degU后导致基因ctsR(编码应激调节因子CtsR)的转录水平显著降低;凝胶迁移阻滞试验首次证明DegU能与基因ctsR的启动子区结合,表明DegU以直接方式调控ctsR。综上,本研究发现DegU通过直接调控应激调节因子CtsR的表达适应环境温度变化,为进一步深入理解单增李斯特菌等重要人兽共患病原菌适应环境应激过程中的调控机制奠定了研究基础,具有重要的公共卫生学意义。

关键词：单增李斯特菌 DegU 应激调节因子CtsR 温度适应

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单增李斯特菌感染并调控宿主丙酰辅酶A羧化酶α(PCCA)的研究

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中国预防兽医学报 2023年第8期45卷 787-793页

作者：魏思雨陈绵绵刘郁匆章先江玲丽孙静宋厚辉程昌勇浙江农林大学动物科技学院/动物医学院/浙江省畜禽绿色生态健康养殖应用技术研究重点实验室/动物健康互联网检测技术浙江省工程研究中心/浙江省动物医学与健康管理国际科技合作基地/中澳动物健康大数据分析联合实验室浙江杭州311300 宁波卫生职业技术学院浙江宁波315100

为探究单增李斯特菌感染与宿主丙酰辅酶A羧化酶α(PCCA)表达的相互影响机制,本研究将单增李斯特菌野生株(LM-EGD-e)以MOI 200感染HeLa细胞5 h后,利用qRT-PCR检测感染LM-EGD-e后HeLa细胞中Pcca基因的转录水平变化,结果显示LM-EGD-e感染H... 详细信息

为探究单增李斯特菌感染与宿主丙酰辅酶A羧化酶α(PCCA)表达的相互影响机制,本研究将单增李斯特菌野生株(LM-EGD-e)以MOI 200感染HeLa细胞5 h后,利用qRT-PCR检测感染LM-EGD-e后HeLa细胞中Pcca基因的转录水平变化,结果显示LM-EGD-e感染HeLa细胞中Pcca基因的转录水平无明显变化(log2FC=-0.305);采用相应试剂盒分别提取感染后的HeLa细胞蛋白和线粒体蛋白,采用western blot检测PCCA蛋白表达变化,结果显示,LM-EGD-e感染后的HeLa细胞中,以及线粒体中PCCA蛋白表达水平均无显著变化(P>0.05)。PCR扩增Pcca基因后构建pCMV-N-HA-PCCA重组质粒,并经PCR和测序鉴定正确后转染HeLa细胞中过表达PCCA蛋白后,利用qRT-PCR检测HeLa细胞中Pcca基因的转录水平,收集细胞总蛋白采用western blot检测PCCA蛋白表达水平,结果显示,与转染空载体的细胞相比,转染重组质粒的HeLa细胞中Pcca基因的转录水平上调(log2FC=8.454),且细胞内PCCA蛋白表达量显著增加(P<0.001)。利用LM-EGD-e以MOI 200感染过表达PCCA蛋白的HeLa细胞,在感染后2 h、5 h和8 h分别收集感染细胞进行点样计数,结果显示,感染后各时间点PCCA蛋白过表达显著或极显著抑制LM-EGD-e的感染及其在胞内增殖的能力(P<0.05、P<0.001、P<0.001)。综上所述,单增李斯特菌感染对宿主细胞内PCCA蛋白的表达无显著影响,但在宿主细胞中过表达PCCA会降低单增李斯特菌的胞内增殖能力。本研究首次探究了单增李斯特菌与宿主PCCA蛋白的调控关系,为深入探究单增李斯特菌等重要胞内菌的感染与宿主的内在联系机制,以及防控该病原感染奠定了基础。

关键词：单增李斯特菌丙酰辅酶A羧化酶α(PCCA) 病原宿主调控关系

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猪圆环病毒2型和3型双重荧光定量PCR检测方法的建立

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浙江农业学报 2022年第3期34卷 457-463页

作者：牟泓晔周小杰杨永春王晓杜周莹珊宋厚辉浙江农林大学动物科技学院·动物医学院浙江省畜禽绿色生态健康养殖应用技术研究重点实验室动物健康互联网检测技术浙江省工程研究中心浙江杭州311300 浙江农林大学动物科技学院·动物医学院浙江省动物医学与健康管理国际科技合作基地中澳动物健康大数据分析联合实验室浙江杭州311300

为建立一种同时检测猪圆环病毒2型(PCV2)和猪圆环病毒3型(PCV3)的方法,参照GenBank上已登录的PCV2 Cap基因和PCV3 Cap基因的保守序列,设计特异性引物和TaqMan探针,通过优化反应条件,建立了同时检测PCV2和PCV3的双重荧光定量PCR检测方法... 详细信息

为建立一种同时检测猪圆环病毒2型(PCV2)和猪圆环病毒3型(PCV3)的方法,参照GenBank上已登录的PCV2 Cap基因和PCV3 Cap基因的保守序列,设计特异性引物和TaqMan探针,通过优化反应条件,建立了同时检测PCV2和PCV3的双重荧光定量PCR检测方法,并对其进行特异性、灵敏性、可重复性检验。特异性试验结果显示,该方法除了对PCV2和PCV3的检测结果为阳性外,对猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)、猪瘟病毒(CSFV)、猪细小病毒(PPV)、伪狂犬病病毒(PRV)、猪流行性腹泻病毒(PEDV)、猪传染性胃肠炎病毒(TGEV)检测均呈阴性,无交叉反应,特异性较强。敏感性试验结果显示,该检测方法同时检测猪圆环病毒2型和3型质粒标准品的最低检测极限均可达到10拷贝·μL^(-1),敏感性较高;该方法组内和组间的变异系数均小于2%,重复性较好。采集浙江省181份猪肉及全血样品,分别利用本文建立的检测方法与标准普通荧光PCR检测方法进行检测,结果显示,PCV2的阳性率为50.83%(92/181),PCV3的阳性率为37.57%(68/181),PCV2和PCV3共感染率为12.15%(22/181);而普通荧光PCR的上述检测结果分别为50.28%(91/181)、36.46%(66/181),共感染率为11.60%(21/181),两种方法对PCV2和PCV3的检测符合率分别可达98.91%和97.06%,对PCV2和PCV3混合感染符合率为95.45%。综上所述,本试验建立的双重荧光定量PCR检测方法可同时对PCV2和PCV3进行快速鉴别检测,可用于病原学检测和流行病学调查等。

关键词：猪圆环病毒2型猪圆环病毒3型 TaqMan探针双重荧光定量PCR

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华南虎子宫内膜炎摩氏摩根菌分离鉴定及生物学特性研究

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中国畜牧兽医 2023年第3期50卷 1271-1278页

作者：胡依凡马敬华白思琦翟祎梦刘建勋宋厚辉杨永春浙江农林大学动物科技学院·动物医学院浙江省畜禽绿色生态健康养殖应用技术研究重点实验室动物健康互联网检测技术浙江省工程研究中心浙江省动物医学与健康管理国际科技合作基地中澳动物健康大数据分析联合实验室杭州311300 杭州野生动物世界杭州311400 山东畜牧兽医职业学院潍坊261000

【目的】对杭州野生动物世界1例成年雌性华南虎(Panthera tigris amoyensis)子宫内膜炎病例的病原进行分离鉴定及生物学特性研究。【方法】无菌采集患虎子宫分泌物进行细菌分离培养、形态观察、梅里埃Vitek 2 COMPACT系统的生化鉴定以及... 详细信息

【目的】对杭州野生动物世界1例成年雌性华南虎(Panthera tigris amoyensis)子宫内膜炎病例的病原进行分离鉴定及生物学特性研究。【方法】无菌采集患虎子宫分泌物进行细菌分离培养、形态观察、梅里埃Vitek 2 COMPACT系统的生化鉴定以及16S rDNA序列分析,采用小鼠腹腔接种模型检测临床分离株致病性,并通过药敏纸片扩散法K-B鉴定该菌对50种药物的敏感性,采用筛选的敏感药物联合对症治疗,持续观察疾病是否复发及其产仔情况。【结果】从患虎子宫分泌物中获得1株革兰阴性短棒状杆菌;梅里埃Vitek 2 COMPACT系统革兰阴性卡鉴定结果显示,该临床分离株为摩氏摩根菌,菌株可发酵葡萄糖,分解甘露糖、D-葡萄糖,且尿素酶、磷酸酶、鸟氨酸脱羧酶、γ-谷氨酰转移酶反应呈阳性;序列比对分析发现,16S rDNA序列与摩氏摩根菌的相似性最高,达99%以上,进一步表明该菌为摩氏摩根菌,并命名为HNH2019;药敏结果显示,该菌多重耐药,对多黏菌素B、丁胺卡那、复方新诺明、麦迪霉素、四环素、头孢哌酮等33种药物呈不同程度的耐药,对头孢噻肟、头孢曲松和头孢西丁等6种药物中度敏感,对妥布霉素、洛美沙星、依诺沙星和氟苯尼考等11种药物敏感;小鼠致病性分析结果显示,该分离株腹腔接种ICR小鼠的半数致死量为1×107.5 CFU;采用敏感药物治疗后,该虎痊愈且连续3年未复发,截至2022年9月,该母虎已经多次怀孕并合计生产了5仔。【结论】本研究分离鉴定到1株华南虎源多重耐药致病性摩氏摩根菌,经筛选的敏感药物治疗,该虎子宫内膜炎痊愈未复发,研究结果为同类疫病防治提供了病例参考和数据支持,提示应重视摩氏摩根菌对动物的潜在危害。

关键词：华南虎摩氏摩根菌子宫内膜炎耐药

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大肠杆菌P88噬菌体gp52和gp53基因对其裂解活性和宿主谱形成影响的研究

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中国预防兽医学报 2023年第10期45卷 994-1000页

作者：费定润吴柔霖程丽丽鲁珂蓥庄楠茜孙静程昌勇陈绵绵宋厚辉浙江农林大学动物科技学院/动物医学院/浙江省畜禽绿色生态健康养殖应用技术研究重点实验室/动物健康互联网检测技术浙江省工程研究中心/浙江省动物医学与健康管理国际科技合作基地/中澳动物健康大数据分析联合实验室浙江杭州311300 台州市椒江区农业农村和水利局浙江台州318000

为探究大肠杆菌溶原性噬菌体P88中非结构与功能基因gp52和gp53对其裂解活性和宿主谱形成的影响,本研究在P88宿主细菌K88基因组中对其进行基因工程操作,然后诱导出相应噬菌体进行功能研究。首先在大肠杆菌Red同源重组质粒p KD46基础上,融... 详细信息

为探究大肠杆菌溶原性噬菌体P88中非结构与功能基因gp52和gp53对其裂解活性和宿主谱形成的影响,本研究在P88宿主细菌K88基因组中对其进行基因工程操作,然后诱导出相应噬菌体进行功能研究。首先在大肠杆菌Red同源重组质粒p KD46基础上,融合p ST98-AS质粒的四环素抗性基因和I-Sce I核酸内切酶基因,构建缺失质粒p WRG99。利用质粒p WRG99分别构建大肠杆菌K88的gp52和gp53基因缺失突变株(Δgp52和Δgp53)并经PCR和测序鉴定。利用丝裂霉素C诱导Δgp52和Δgp53,采用双层平板法检测噬菌体的裂解活性,结果显示,Δgp52和Δgp53的诱导液可以在大肠杆菌DE048为宿主菌的平皿上形成清晰的噬菌斑,表明Δgp52和Δgp53能诱导出可以感染DE048的噬菌体(将该噬菌体命名为P88-52和P88-53),并且gp52和gp53基因缺失均不影响噬菌体P88的形成和裂解活性。将P88-52和P88-53纯化并经电镜观察,结果显示,P88-52和P88-53与野生株P88形态相似,具有P2-like噬菌体典型的肌尾和短尾丝特征,表明gp52和gp53基因缺失均不影响P88噬菌体颗粒的形态。利用P88的宿主菌对P88-52和P88-53进行宿主谱分析,结果显示,P88-52和P88-53在DE048为宿主菌的平皿上均可以形成清晰的噬菌斑,在MC1061、DH5α和BL21为宿主菌的平皿上均不能形成噬菌斑,与噬菌体P88宿主谱相同,表明gp52和gp53基因缺失均不影响P88噬菌体的宿主谱。综上所述,在宿主菌K88基因组的基础上缺失gp52和gp53基因后,诱导出的P88突变噬菌体的裂解活性和宿主谱均不受影响。本研究通过在宿主菌中对前噬菌体基因编辑来研究溶原性噬菌体的基因功能,为其他溶原性噬菌体基因功能的研究提供了参考依据。

关键词：大肠杆菌前噬菌体裂解活性宿主谱

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2017–2019年中国南方五省规模化养猪场副猪格拉菌血清型、耐药性及β-内酰胺类耐药基因bla-TEM分子特征分析

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微生物学报 2022年第8期62卷 3039-3047页

作者：陈雨欢肖敏王雨萌金恒琪王馨雨刘星雨夏菁王晓杜周莹珊宋厚辉杨永春浙江农林大学动物科技学院/动物医学院浙江省畜禽绿色生态健康养殖应用技术研究重点实验室动物健康互联网检测技术浙江省工程研究中心浙江省动物医学与健康管理国际科技合作基地中澳动物健康大数据分析联合实验室浙江杭州311300 江西正邦农业科学院江西南昌330096

【目的】旨在分析当前规模化养殖场副猪格拉菌(Glaesserellaparasuis)优势血清型、耐药特性、耐药基因与分子特征。【方法】对源自规模化养猪场21株副猪格拉菌临床分离株,采用PCR鉴定血清型;利用K-B纸片扩散法鉴定其对25种抗生素的耐药... 详细信息

【目的】旨在分析当前规模化养殖场副猪格拉菌(Glaesserellaparasuis)优势血清型、耐药特性、耐药基因与分子特征。【方法】对源自规模化养猪场21株副猪格拉菌临床分离株,采用PCR鉴定血清型;利用K-B纸片扩散法鉴定其对25种抗生素的耐药表型;采用PCR检测bla-、bla-和bla-等7种耐药基因,并采用Chi-square test和Fisher exact test分析耐药表型和耐药基因型的相关性;耐药基因目的条带测序,并应用CLC Sequence Viewer软件分析β-内酰胺类耐药基因(bla-)编码蛋白氨基酸关键位点差异与耐药性的关系。【结果】21株副猪格拉菌临床分离株的优势血清型为4和12型;对β-内酰胺类药物苯唑西林的耐药性较强,耐药菌占比达61.9%(13/21);多重耐药菌株占比高达90.5%(19/21);β-内酰胺类耐药基因bla-携带率较高(52.4%,11/21),且bla-与β-内酰胺类药物青霉素G、苯唑西林和头孢拉定的耐药性显著相关,部分bla-编码氨基酸存在可能与副猪格拉菌耐药能力有关的差异位点。【结论】本研究表明,规模化养猪场的副猪格拉菌多重耐药情况仍很严重,并明确了被调查区域β-内酰胺类药物耐药率高的主要原因是携带耐药基因bla-,为加强对规模化养猪场副猪格拉菌耐药性监测提供理论依据。

关键词：副猪格拉菌 bla-TEM 分子特征

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基于基因缺失减毒单增李斯特菌的小鼠宫颈癌治疗性疫苗效果评估

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农业生物技术学报 2022年第10期30卷 1987-1996页

作者：汪枫婷孙静刘晨程茵蒋昕祝艺然卫芳芳章先宋厚辉程昌勇浙江农林大学动物科技学院.动物医学院/浙江省畜禽绿色生态健康养殖应用技术研究重点实验室/动物健康互联网检测技术浙江省工程研究中心/浙江省动物医学与健康管理国际科技合作基地/中澳动物健康大数据分析联合实验室

减毒单增李斯特菌(Listeria monocytogenes)作为一种安全高效的异源抗原递呈载体可用于肿瘤免疫治疗。缺失重要毒力基因是目前较为成熟的李斯特菌减毒策略。基因缺失减毒菌株ΔactAΔinlB (简称ΔAB)是其中一种较为成熟、安全的李斯特... 详细信息

减毒单增李斯特菌(Listeria monocytogenes)作为一种安全高效的异源抗原递呈载体可用于肿瘤免疫治疗。缺失重要毒力基因是目前较为成熟的李斯特菌减毒策略。基因缺失减毒菌株ΔactAΔinlB (简称ΔAB)是其中一种较为成熟、安全的李斯特菌肿瘤免疫治疗疫苗载体。本研究旨在ΔAB基础上，利用肿瘤相关抗原与重要毒力因子融合表达的创新手段，构建一种能高效表达和递呈宫颈癌相关抗原E7的肿瘤疫苗载体(ΔAB-E7)，以肿瘤生物学方法评估ΔAB-E7在小鼠(Mus musculus)宫颈癌模型中的免疫治疗效果。本研究利用细菌分子遗传操作技术构建ΔAB，在ΔAB基础上构建李斯特菌溶血素O (Listeriolysin O,LLO)和肿瘤抗原E7融合表达的ΔAB-E7；通过Western blot验证ΔAB-E7菌株中的E7抗原能否与LLO融合表达；利用细菌体外培养以及吞噬细胞内增殖实验研究体外生长能力，细胞内复制和增殖能力；通过小鼠脏器内细菌增殖实验评估ΔAB及ΔAB-E7在小鼠体内的增殖能力；构建小鼠宫颈癌模型，通过记录肿瘤模型在小鼠体内的生长趋势评价ΔAB-E7的免疫治疗效果。结果显示，ΔAB-E7菌株的E7抗原能与LLO融合表达并正常分泌；ΔAB及ΔAB-E7菌株在体外生长能力与野生型无显著差异，并且在吞噬细胞中保持稳定的增殖能力；ΔAB及ΔAB-E7感染小鼠后致病力显著下降，在小鼠脏器中的增殖能力显著降低，表明其毒力减弱，在小鼠感染模型中具有安全性；在小鼠宫颈癌模型中，ΔAB-E7免疫治疗组小鼠肿瘤的生长趋势明显较对照组更慢，表明ΔAB-E7抑制肿瘤生长，展现了良好的免疫治疗效果。本研究制备了一种基于减毒李斯特菌的小鼠宫颈癌治疗载体疫苗，为人类宫颈癌及其他恶性肿瘤的免疫治疗提供技术支持。

关键词：减毒单增李斯特菌宫颈癌免疫疗法疫苗载体 ΔAB-E7

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内质网应激与氧化应激

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农业生物技术学报 2022年第10期30卷 2009-2024页

作者：张雨欣周小杰于浩然董婉玉杨永春王晓杜周莹珊宋厚辉浙江农林大学动物科技学院.动物医学院/浙江省畜禽绿色生态健康养殖应用技术研究重点实验室/动物健康互联网检测技术浙江省工程研究中心/浙江省动物医学与健康管理国际科技合作基地/中澳动物健康大数据分析联合实验室

内质网是蛋白折叠的重要场所，对细胞稳态的变化十分敏感。蛋白折叠的环境发生变化会导致未折叠或错误折叠蛋白的聚集并影响细胞内信号通路，如Ca2+，氧化还原，炎症，凋亡等。当内质网发生应激，未折叠蛋白反应(unfolded protein respo... 详细信息

内质网是蛋白折叠的重要场所，对细胞稳态的变化十分敏感。蛋白折叠的环境发生变化会导致未折叠或错误折叠蛋白的聚集并影响细胞内信号通路，如Ca2+，氧化还原，炎症，凋亡等。当内质网发生应激，未折叠蛋白反应(unfolded protein response, UPR)通过一系列适应性反应来缓解蛋白错误折叠并恢复细胞稳态，如果不能重塑稳态，则会诱导凋亡。活性氧(reactive oxygen species, ROS)的产生被证实与内质网应激和未折叠蛋白反应有着密切的联系。ROS具有一定的毒性但也能作为信使分子介导生理过程。细胞质和不同的细胞器包括内质网和线粒体都会产生ROS。内质网中氧化还原状态的改变能够引起内质网应激，而内质网应激又能在内质网和线粒体诱导产生ROS。持续的氧化应激和内质网应激会启动凋亡程序。这些细胞反应在病毒感染中发挥了重要的作用。本文对内质网应激和氧化应激发生的机制、在诱导细胞凋亡中的相互联系、以及在动物病毒感染中发挥的作用进行了综述和展望。

关键词：内质网应激(ERS) 未折叠蛋白反应(UPR) 氧化应激活性氧(ROS) 凋亡病毒感染

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单增李斯特菌PTS系统转运蛋白IIB^(man)介导运动性和感染的功能研究

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中国预防兽医学报 2023年第11期45卷 1179-1187页

作者：张佳雪陈绵绵程丽丽任耿佳徐像文鲁珂蓥庄楠茜孙静宋厚辉程昌勇浙江农林大学动物科技学院动物医学院/浙江省畜禽绿色生态健康养殖应用技术研究重点实验室/动物健康互联网检测技术浙江省工程研究中心/浙江省动物医学与健康管理国际科技合作基地/中澳动物健康大数据分析联合实验室浙江杭州311300 台州市椒江区农业农村和水利局浙江台州318000

为探究单增李斯特菌(LM)磷酸转移酶系统(PTS)转运蛋白IIB^(man)在LM生长、运动性及其生物学功能,本研究以LM EGD-e株基因组为模板,经PCR扩增iiB^(man)基因的上下游基因片段(不包含iiB^(man)基因),插入质粒pKSV7以构建缺失质粒;以LM EGD-... 详细信息

为探究单增李斯特菌(LM)磷酸转移酶系统(PTS)转运蛋白IIB^(man)在LM生长、运动性及其生物学功能,本研究以LM EGD-e株基因组为模板,经PCR扩增iiB^(man)基因的上下游基因片段(不包含iiB^(man)基因),插入质粒pKSV7以构建缺失质粒;以LM EGD-e基因组为模板,采用PCR扩增iiB^(man)基因与启动子片段,插入质粒pIMK2以构建回补质粒,经PCR和测序鉴定后,将缺失质粒转化LM EGD-e感受态细胞,通过氯霉素抗性及42℃压力下使重组质粒与LM EGD-e株的同源片段发生同源重组单交换获得一代同源重组菌株,然后在无抗性培养基中30℃培养使质粒丢失,获得缺失株ΔiiB^(man)。将回补质粒转化ΔiiB^(man)感受态细胞中,通过卡那霉素抗性筛选获得回补株CΔiiB^(man),缺失株和回补株均经PCR和测序鉴定。37℃培养EGD-e、ΔiiB^(man)、CΔiiB^(man)12 h,期间每隔1 h测定OD_(600nm)并绘制生长曲线,分析各菌株生长特性,结果显示,各菌株体外生长趋势相似。将各菌株菌液接种于TSA半固体培养基,培养至24 h和48 h时检测细菌运动圈大小,结果显示ΔiiB^(man)的运动圈直径分别是EGD-e的1.5及1.6倍(P<0.05、P<0.01),CΔiiB^(man)与EGD-e运动圈直径均基本一致。在各菌株培养上清中加入绵羊血,检测各菌株溶血能力,结果显示,ΔiiB^(man)的溶血能力较EGD-e及CΔiiB^(man)增强。将各菌株以MOI 20感染RAW264.7细胞,在感染后2 h、5 h和8 h收集细胞进行点样计数,结果显示,在感染后2 h和5 h时ΔiiB^(man)的胞内增殖能力较EGD-e及CΔiiB^(man)显著增强(P<0.05)。将各菌株以2×10^(5)cfu/只经腹腔注射感染小鼠48 h后剖杀,取肝脏和脾脏研磨并点样计数,结果显示,ΔiiB^(man)在小鼠脏器载菌量较EGD-e及CΔiiB^(man)极显著增多(P<0.001)。上述结果首次表明IIB^(man)不影响LM的生长,但影响LM的运动性及提高LM的体外溶血活性;IIB^(man)参与LM的胞内增殖和宿主脏器定植。本研究为了解LM PTS系统所介导的细菌体外环境适应及宿主感染的分子机制,以及LM感染的防控奠定了基础。

关键词：单增李斯特菌磷酸转移酶系统 IIB^(man)转运蛋白运动性感染

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